大規模な gRNA ライブラリ生産 DNA の任意のソースからの普遍的なプロトコル

要約

大規模な gRNA ライブラリを生成するためのメソッドは、シンプルで効率的かつコスト効果の高いはずです。ターゲット DNA の酵素の消化力に基づく gRNA ライブラリの生産のためのプロトコルについて述べる。このメソッド CORALINA (制御のヌクレアーゼ活性を通じて包括的な gRNA ライブラリを生成) は高価なカスタム オリゴヌクレオチド合成に代わるものを提示します。

要約

ゲノム、エピゲノム工学 CRISPR/Cas9 システムの人気は、そのシンプルさと適応性から生じています。エフェクター (Cas9 ヌクレアーゼやヌクレアーゼ死者 dCas9 融合タンパク質) がガイド RNA、または gRNA として知られている小さい合成 RNA ゲノムの特定のサイトを対象と。CRISPR システムの二部の性質は、個々 の gRNAs の何千もの格納式カセットは単一の実験で多数の異なるサイトを調査する使用ことができますプラスミド ライブラリからスクリーニングのアプローチでの使用できます。

日には、ライブラリの構築のための gRNA シーケンスをライブラリ内のシーケンスの達成可能な複雑さを制限、比較的コストのかかるオリゴヌクレオチド合成によってほとんど専ら生成されています。ここで詳細なプロトコル CORALINA (制御のヌクレアーゼ活性を通じて包括的な gRNA ライブラリを生成)、単純な非常に複雑な gRNA ライブラリの生成コスト法に基づいて入力 DNA の酵素消化、記載されています。カスタマイズ オプションの多くが存在する DNA の任意のソースから、CORALINA ライブラリを生成できますので、多種多様な CRISPR ベースの画面を有効にします。

概要

分子ターゲット ツールとして細菌の CRISPR/Cas9 システムの適応は、分子生物学の最も最近の革命を引き起こされます。決して前に、それがそう定義されたゲノム場所でクロマチンを操作する簡単です。CRISPR の一般的なアプリケーションは、対象となる遺伝子の突然変異は¹、ゲノム工学²、エピゲノム編集³、転写活性化遺伝子サイレンシング⁴。CRISPR システムの 1 つの特定の利点は、そのアプリケーションはよく研究の候補地に限定されない gRNA ライブラリより少なく偏りのある画面を可能にします。これらは前の実験的知識なしのゲノムの機能遺伝子座の検出を促進します。ただし、gRNA 図書館の建設は現在主 oligo ヌクレオチドの合成に基づいて人間は gRNA ライブラリを購入する限られたオプションがあります、またはマウスの起源またはターゲット地域外開いたリーディング ・ フレーム。したがって、CRISPR 画面が信じられないほど強力な^5,6,7、8を既に証明しているが彼らの完全な可能性がまだ開発されていません。

克服するために古典的な gRNA 生成メソッドの 2 つの方法の制限を最近開発されています。両方はカスタム オリゴヌクレオチド合成に頼るのではなく、ターゲット DNA の酵素消化力制御に基づいています。制限酵素を使用して CORALINA⁹ミクロコッカスヌクレアーゼ、のみ現在利用可能な代替法 CRISPR 食べて¹⁰を採用している間 (HpaII、超 Bfaは私とMme私)。重要なは、両方の方法は、gRNA protospacer シーケンスのソースとして任意の入力の DNA に適用できます。CRISPR 食べる方法は、必要な S.pyogenes PAM (protospacer 隣接する動機) がターゲット サイトに従わない複製された gRNAs の数を減らすための戦略を採用し、それのためのすべての可能な機能 gRNAs の小さい一部分だけが生成されます、指定された領域。CORALINA、一方でソース シーケンスのすべての潜在的な gRNAs を生成することができるがまた非機能的なガイドの高い割合が組み込まれています。任意の種の包括的な gRNA ライブラリの製造を可能に gRNA ライブラリを生成制御のヌクレアーゼ活性をシンプルかつコスト効果の高い方法で任意の Cas9 蛋白質またはエフェクター システム。さらに、CORALINA は、適切な入力とベクトルの選択肢を定義するライブラリの種類、サイズ、コンテンツのカスタマイズに適応されます。ここでは、詳細なプロトコルが表示細菌人工染色体 (BACs) またはゲノム DNA⁹を含む DNA (図 1) のさまざまなソースから包括的な gRNA ライブラリの生成に使用することができます。このプロトコルを伴う代表的な結果は、BAC DNA に CORALINA プロトコルを適用することによって得られました。

プロトコル

1. ミクロコッカスヌクレアーゼと DNA の消化力

1. ミクロコッカスヌクレアーゼ酵素 (MNase) の各の新しいバッチに対して最適化反応を実行します。
   注: 使用 MNase の単位の数は、(図 2 a、シリアル希釈を使用して) テスト必要があります。通常、5-10 MNase U ダイジェスト 1 μ g の精製ゲノムか以下の条件で 5 100 bp の範囲に BAC DNA。
2. MNase バッファー x 10、ウシ血清アルブミン (BSA)、ターゲット DNA の MNase の 1 μ L の 1 μ g x 1 の 1 μ L を反応ごとの設定 (0.1 〜 50 台) 10 μ L 反応ボリュームで。
3. 37 ° c 15 分間インキュベートします。
4. すぐに 500 mM エチレング リコール-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N の 1 μ L を追加することによって、酵素を不活性化 '、N'-四酢酸 (グリコールエーテルジアミン四酢酸)。

2 ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (ページ) を使用してフラグメントの DNA の分離

1. サンプル バッファー/ゲルの DNA サンプルにローディングの染料を追加し、ページのゲル 20% の上にロードします。サイズ変更のための適切な DNA の梯子を読み込む (5 bp DNA の梯子)。ゲル (ウェルあたり 1 DNA μ g) をオーバー ロードしません。
2. Bp、ゲルの下端に達すると 1.5 h の前後約 15 で下の色素フロント (ブロモフェノール ブルー、濃いブルー色) までの適切な 1 x TRIS ホウ酸 EDTA (TBE) 連続したバッファー 150 V (定数) でゲルを実行します。
3. 超高感度核酸染色を使用してゲルを染色し、紫外線の下で視覚化します。
4. ゲル画像からサイズで 20-30 bp まで消化の DNA に MNase の最適な濃度を決定します。
5. 手順 1.2 2.2 を繰り返すことによってターゲット DNA を消化するのに MNase 濃度の最適化を使用します。通常、以降のステップに進むために次のページのゲルの抽出 DNA を消化反応 (すなわち10-12 出発物質合計の μ g) を行えば、十分 10-12 を設定します。
6. 生殖不能のメスを使用して、マーカー レーンの隣にゲルをカットし、超高感度核酸染色の 1 X を含む新鮮な 1 x TBE 実行バッファーではしごを含んでいるゲルの部分だけを染色します。DNA の梯子を視覚化し、消費税約 18 30 bp のかみそりの刃を使用しての間の大きさの範囲に MNase 消化 DNA のフラグメント。
   注: は、UV ライトに MNase 消化フラグメントの露出を避けます。それは) (紫外線) ではなく青い光源を使用または UV の下ではしごのイメージでスケール MNase 消化の DNA のフラグメントの切除をガイドするこれを使用してそれを印刷することが可能です。この手順では、染色、DNA のフラグメントの紫外線への露出を回避できます。常に汚染を避けるために未使用、滅菌使い捨てメスまたはこの手順のかみそりの刃を使用します。
7. 微量遠心チューブにゲルのスライスを転送します。
8. 上記として核酸染色ゲルの残りの部分を染色、UV ライトに公開し、ゲル切除手順の記録を保持するイメージを記録します。

3. ときめきと浸漬法を用いたページ ゲルからの DNA のフラグメントの分離

注: この手順は、Sambrookらから採用されています¹¹

1. ゲル可溶化バッファー (4 M 酢酸アンモニウム、酢酸マグネシウム 1 M 150 μ、30 μ L の純水 H₂O 15 mL の容量で 0.5 M エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) (pH 8) 1.88 mL) ページを準備します。
2. 滅菌ピペット チップを用いたマイクロ遠心チューブの壁切除のゲルのスライスをつぶします。
3. 2 ページ可溶化バッファーのボリュームをゲルし、, 回転プラットフォーム上で 16 時間 37 ° C で追加します。
4. 遠心機の最高速度で 1 分間サンプルを遠心します。任意の押しつぶされたゲルの部分を転送しないように世話、新しい微量遠心チューブに上清を転送します。
5. 0.5 を追加ゲルにページ可溶化バッファーのボリューム ペレット、渦、および遠心分離 (ステップ 3.4) を繰り返します。培養上清を組み合わせます。
6. 標準的なフェノール-クロロホルム抽出法を用いた DNA 断片を抽出します。
   注意: 皮膚に接触する場合や誤って飲み込んだ場合は、フェノールは有毒です。手袋、保護眼鏡、白衣、ヒューム フードでの作業などの安全対策が重要です。研究所の規則に従ってすべてのフェノールを含む廃棄物の処分します。
   1. 徹底的にサンプルと渦にフェノール: クロロホルム: イソアミル アルコール (25:24:1) の 1 つのボリュームを追加します。
   2. 最高速度 (16,000 x g) 卓上遠心室温で 10 分間遠心します。慎重に新鮮な遠心管に上層の水相を転送します。ピペッティング時に任意のフェノールを引き継ぐように注意してください。
   3. 3.6.1 と 3.6.2 の手順をもう一度繰り返します。
   4. グリコーゲン、3 M 酢酸ナトリウム (pH 5.2) の 0.1 ボリュームの小さな量 (0.2 μ L) を追加し、100% エタノール (エタノール) の 2 つの容積。
   5. 渦、-20 ° C でインキュベートするいくつかの時間または一晩します。
   6. 卓上型遠心分離機を使用して 4 ° C で最大速度で 30 分間遠心します。
   7. 慎重に上澄みを除去し、DNA のペレットを 70 %etoh。
   8. 卓上型遠心分離機を使用して 4 ° C で最大速度で 30 分間遠心します。
   9. 上澄みを除去し、空気乾燥 DNA の餌。すべてのエタノールが蒸発したことを確認しかし、ペレットを過剰に乾燥しないように注意してください。
   10. H₂o. の 12 μ L の DNA ペレットを溶解します。
       注: ページのゲルの抽出は非常に効率的ではありません。MNase と消化される DNA の開始のすべての 10 μ g、ゲルの抽出後に精製されたフラグメントの 1 20 ng を回復に期待します。1/6^thを読み込むことによって量とフラグメントの整合性を制御 (2 μ L) ページのゲル (図 2)。

4 エンド MNase 消化、ゲル精製断片の修復

1. キットを鈍化 DNA を使用して次の反応を設定: ステップ 3.6.10、鈍化バッファー、1 mM dNTP ミックス 1.5 μ、モデル酵素の 0.6 μ L、1.4 μ L H₂o. の X 10 の 1.5 μ L から精製した DNA の 10 μ L
2. 22 の ° c で 30 分間インキュベートし、酵素の熱を 70 ° C の 10 分の間孵化によって不活性.
3. H₂O の 85 μ L を追加し、反応クリーンアップ標準のフェノール/クロロホルム抽出とエタノール沈殿 (セクション 3.6 で説明) を使用してを実行します。リンカー結紮に進んでください。

5. リンカー世代

注: リンカーはセクション 3 リンカー結紮をすぐに続行することができるようにすると同時に増幅する必要があります。以下使用のプライマー シーケンスは選択した gRNA の表現のベクトルのために適切である必要があります。ここで紹介はベクトルの pgRNA pLKO.1 のために設計されています。⁹ pgRNA pLKO.1 から 5' リンカーの増幅、プライマー シーケンス 5'-リンカー-F (TTGGAATCACACGACCTGGA) および 5'-リンカー-R (CGGTGTTTCGTCCTTTCCAC) 689 bp 私アンプリコンを降伏を使用します。PgRNA pLKO.1 から 3' リンカーの増幅用プライマー 3'-リンカー-f: (GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATA) と 3'-リンカー-r: (ACTCGGTCATGGTAAGCTCC)、848 の bp 増幅をもたらす。

1. PCR 増幅アダプターは (必要に応じて試薬の選択とカスタムのプライマー シーケンスを使用して) gRNA 発現ベクターからシーケンスします。PgRNA pLKO.1 次の 50 μ L の PCR 反応を設定の: PCR マスター ミックスの 25 μ L、F のプライマーの 2.5 μ L (10 μ M)、プライマー R の 2.5 μ L (10 μ M)、0.1 gRNA 発現ベクター (pgRNA-pLKO.1) H₂o. での ng
2. 次の条件を使用してたちの反応を孵化させなさい: 1 サイクル 30 98 ° C s、32 サイクル 98 ° C 10 s、59 ° C、10 s 72 ° C、30 秒、10 分の 1 サイクル 72 ° C。
3. 製造元の指示に従って固相リバーシブル固定化ビーズを用いた PCR 反応を浄化します。H₂o. の 30 μ L の溶出します。
4. 最後修理、MNase 消化 DNA のフラグメント リンカー、(ここでハインドIII とSacII) 適切な制限の酵素のダイジェスト リンカーの方向結紮します。次の反応を設定します。
   1. 5'ハインドIII をリンカーの消化、30 μ L の精製された 5' ステップ 5.3 から私アンプリコン リンカーを使用します、5 μ l のバッファー、ハインドIII (20U/μ l) の 3 μ l、12 μ l H₂o.。
   2. 3' SacII をリンカーの消化、30 μ L の精製 3' ステップ 5.3 から私アンプリコン リンカーを使用します 5、バッファー、 SacII の 3 μ l の μ l (20 U/μ l)、と 12 μ l H₂o.。
5. 3 h の 37 ° C でダイジェストを孵化させなさい。
6. DNA ゲルのローディングの染料を追加し、1% アガロースゲルの制限の酵素のダイジェストを実行します。637 でバンドを消費税 bp (5' リンカー ダイジェスト) と 295 bp (3' リンカー ダイジェスト)。
7. ゲル抽出キットを使用して摘出したゲル片から DNA を浄化します。

6. リンカー結紮と挿入の増幅

1. MNase 消化、最後修理断片およびリンカー シーケンスの等モルの量を使用して 14 μ L の ligation の反作用を設定します。
   注: リンカー フラグメント率を最適化できます。いいえフラグメントのコントロール (NFC) 反応を含めることをお勧めします。
   1. MNase 消化フラグメント (エンド修理し、精製)、120 の 5 ng 5' (ハインドIII ダイジェスト、精製)、リンカーの ng 55 3' リンカー (SacII ダイジェスト、精製)、T4 リガーゼ バッファーの 1.4 μ L、1.4 μ L H₂o. 集中 T4 DNA リガーゼの ng
2. 16 h 16 ° C でライゲーション反応を孵化させなさい。ない熱は、酵素を不活性化します。ニック変換に進んでください。
   注: 終わり修理 MNase 消化フラグメントは、5' リン酸必要なリンカーの結紮、リンカーとして自体が非 osphorylated。
3. 結紮する反応 (と NFC 反応) は、次を追加: Taq 2 マスター ミックス (ニック変換可能) X 25 μ L、プライマー リンカー-Minus450-F の 2.5 μ L (10 μ M、GGGCAAGTTTGTGGAATTGG)、プライマー リンカー-Plus275-R の 2.5 μ L (10 μ M、AAGTGGATCTCTGCTGTCCC) と 6 μH₂o.
4. いいえテンプレート コントロール (NTC) が含まれます。次の条件を使用してたちの反応を孵化させなさい: 1 サイクル (ニック翻訳): 72 ° C、20 分、1 サイクル: 95 ° C、5 分、3 〜 4 サイクル: 95 ° C、15 s、58 ° C、15 s、72 ° C、30 s、1 サイクル: 72 ° C、5 分。
5. 反応クリーンアップ固相リバーシブル固定化ビーズを用いたビーズ比 1:1 のサンプルを実行します。H₂O を 40 μ L の溶出します。
6. さらに目的のフラグメントを増幅 (5' リンカー + MNase フラグメント +3' リンカー) 適切な PCR 試薬と次のプライマーを使用して。
   1. PCR マスター ミックスの 12.5 μ L、プライマー リンカー-Minus450-F の 1.25 μ L 使用 (10 μ M、GGGCAAGTTTGTGGAATTGG)、プライマー リンカー-Plus275-R の 1.25 μ L (10 μ M、AAGTGGATCTCTGCTGTCCC)、ステップ 6.4 から精製されたニック翻訳製品の 2.5 μ L。7.5 μ L H₂o. の次の条件を使用して、: 1 サイクル: 98 ° C、30 秒、10-16 サイクル: 98 ° C、10 s、63 ° C、10 s、72 ° C、15 s、1 サイクル: 72 ° C 10 分。
      注: 必要に応じて、いくつかの反応設定できます並列で後続のステップの十分な PCR の製品があることを確認します。Agarose のゲルの PCR の製品の少量を視覚化し、6.5 の手順とその他の反応を設定し、15 から 32 のサイクル数を増やします。この反応は、15 サイクル後 amplicons が表示されない場合、品質管理として使用できます。また、テンプレートなしのコントロール (NTC) が含まれます。

7. サイズ選択

注: この手順 MNase-のフラグメントを分けるに 5' と 3' のリンカーを正しく接続された 2 つのフラグメントから 5' または 3' リンカー 2 つのサイズに基づいて。

1. ステップ 6.5 からすべて 15 サイクル PCR の反作用を結合します。 DNA ローディングの染料を追加して、0.8% の agarose のゲルを実行。869 の顕著なバンドを消費税 bp とゲル抽出キットを使用して DNA の浄化します。
2. (例:分光光度計を使用して) DNA の量を定量化します。

8. クローン gRNA ギブソン アセンブリによって表現のベクトルに PCR 増幅断片の

1. アセンブリの準備マスター ミックスの次のように。
   メモ: 次の手順は、ギブソンらから適応¹²。
   1. 1 M トリス (ヒドロキシメチル) アミノメタン (トリス) の 3 mL を組み合わせることにより 6 mL の等温の反作用バッファーを作成-塩酸 pH 7.5、1 M MgCl、100 mM デオキシグアノシン三リン酸 (dGTP) 60 μ L、100 mM デオキシアデノシン三リン酸 (dATP) 60 μ L、100 mM チミジンの 60 μ L 300 μ L三リン酸 (dTTP) 100 mM デオキシシチジン三リン酸 (dCTP) 1 M ジチオトレイトール (DTT)、1.5 g のポリエチレング リコール (PEG)-8000、100 mM ニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド (NAD) 超純水 H₂o. の 300 μ L 300 μ L の 60 μ L
      注: 検体、-20 ° C で保存されます、このバッファーを使用できます。
   2. 5 X の等温の反作用バッファーの 320 μ L、10 U/μ L T5 エキソヌクレアーゼ、2 U/μ L の DNA のポリメラーゼ、40 U/μ L の DNA リガーゼの 5 μ L でアセンブリのマスターの組合せの超純水の H₂O を使用 15 μ 160 μ L の 20 μ L の 3 μ L を組み合わせることにより 1.2 mL アセンブリ マスター ミックスを作成します。挿入します。
      注: アセンブリのマスター ミックス避けようと-20 ° C で保存されます、それは 1 年以上の安定をすることができます、複数凍結融解サイクルを容認することができます。T5 exonuclease の選ばれた量は長いオーバー ハングでの使用に最適です。
2. ベクター バックボーン消化
   メモ: 8.3 の手順アセンブリ反応の所望の数の入力としてベクトルの十分な量を消化するを確認します。
   1. 反応、1 次を追加:年齢の 1.5 μ L、5 μ L バッファーの gRNA 発現ベクター (pgRNA-pLKO.1) の 1.5 μ g (5 u/μ L)、私と 38.5 μ L H₂o ・加温の 2 h の 37 ° C でダイジェストします。
3. 一直線に並べられたベクトルの脱燐酸化。
   注: この手順はお勧めしますが、厳密には必要ありません。マスター ミックスで T5 exonuclease はほとんど年齢が削除されます私は Taq DNA リガーゼが行動するチャンスがあった前にオーバー ハングします。したがって、ベクトルの過剰な再結紮は想定されていません。
   1. エビのアルカリホスファターゼの酵素 (rSAP、1 U/μ L) の 2.5 μ L を追加します。
   2. 37 ° C、30 分インキュベートし、5 分の 65 ° c の孵化によって酵素を不活性化します。
4. DNA の浄化を実行します。
   注: agarose のゲルの抽出手順を実行することをお勧めします。代わりに、列またはビードの浄化を使用できます。ベクトル消化が agarose のゲルの電気泳動によって例えば、完全なことを確認することが重要です。比較のため未消化のベクトルを並行して実行する必要があります。
5. サンプルの精製消化ベクトル量を定量化します。
6. ベクターに挿入の 2 倍モル過剰を持つアセンブリを設定します。ベクトル (年齢私はステップ 8.5 からダイジェスト) の 20 μ L 反応使用 100 ng あたり 12.2 の ng 挿入手順 7.1。)、8.1.2 の手順アセンブリ マスター ミックスの 15 μ l。H₂o.
7. 50 ° C 1 時間インキュベートします。
8. コラムの浄化を使用して反応を浄化します。H₂O の 75 μ L の DNA を再懸濁します (またはエレクトロポレーションの規模に応じてボリュームを適切な)。
   注: 変換効率は DNA の純度に大きく依存しています。追加精製工程 (例えばフェノール/クロロホルム抽出) は、効率を向上させる可能性があります。

9. エレクトロ有能な TG1大腸菌細胞の調製

1. すべて遠心分離機の瓶、フラスコ、洗剤洗浄、オートクレーブに入れる前に蒸留水で後続の充填を確認します。
   注: この手順は、変形の効率に影響を与えるかもしれない不純物を除去するのに役立ちます。水は、使用の直前に破棄する必要があります。また、使い捨て可能な遠心瓶の使用はお勧めできます。
2. 遠心ボトル、チューブ、electrocompetent 細胞の調製に使用されるソリューションは、使用する前に氷に冷え込んでいるを確認します。変形の効率に影響を与えるかもしれない温度の変動を最小限に抑えるため冷蔵室で次の手順を実施することをお勧めします。
3. 2TY メディアを準備します。バクト トリプトンの 16 g に酵母エキスの 10 g と 5 g, 塩化ナトリウムは 1 L、ミックス、オートクレーブに蒸留水を追加します。室温で店中。
4. 2TY 寒天コーティング バイオアッセイ料理と適切な抗生物質を含んでいる 10 cm シャーレを準備します。4 ° C でプレートを保存します。
   注: 抗菌薬の選択は、pgRNA pLKO.1 の使用 100 μ g/mL アンピシリン gRNA 発現ベクターの性質に依存します。
5. (抗生物質) なし 2TY 培地 10 mL に接種する TG1 セルのグリセロール ストックからこすり落とします。
6. 225 rpm で振とうしながら 37 ° C 一晩 (~ 16 h) で文化を孵化させなさい。
7. 一晩かけて培養 (1/100 倍希釈液) 10 ml (抗生物質) なし 2TY 培地 1 L を接種して (バッフルを含む) 2 つの 2 L フラスコの間それを均等に分割します。
8. 37 ° c、225 rpm (約 1.5-2 時間) 後 0.55 の OD600 nm に到達するまで文化を孵化させなさい。分光光度計を使用して、OD600 nm を定期的にチェックします。
9. 30 分間氷の上文化を冷やします。
10. 文化 4 500 mL 遠心ボトル (事前冷たい氷の上に均等に分割します。
11. 中古冷蔵遠心分離機で 4 ° C で 4,000 x g で 15 分間遠心します。
12. 培養上清をデカントし、各遠心ボトルにあらかじめ冷やした冷たい滅菌蒸留水 H₂O の 1 ボリューム (すなわち 250 mL) を追加します。旋回やボトルを反転する (または穏やかなピペッティング、必要に応じて) は、細菌のペレットを再懸濁します。
    注: それは最初に少量の水を追加することでペレットを再懸濁しますやすくなっています。ペレットは完全に最終的に再停止されるを確認します。
13. 4 ° C で 4,000 x g で 15 分遠心分離
14. 2 回、洗浄を繰り返します (手順 9.12。 9.13 と)。上澄みを除去します。デカント細菌ペレット洗浄後ますますルーズになるよう注意してください。
15. 滅菌、氷冷 10% グリセロールの 50 mL にペレットを再懸濁し、中古冷蔵 50 mL の遠心管にそれを転送します。
16. 4 ° C の ~ 4,000 x g で 15 分遠心分離細胞上清を慎重に取り外します。
17. 優しく冷たい滅菌 10% グリセロール 2 mL 中の細菌を再懸濁します。
18. セルがすぐにエレクトロポレーションを使用する氷の上保管してください。
    注: セル ドライアイス ・ エタノールお風呂で 0.5 mL チューブに 50 μ L の因数で冷凍でき-80 ° C で保存、これは推奨されません。

10. TG1 Electrocompetent大腸菌細胞のエレクトロポレーション

注: エレクトロポレーション、包括的なライブラリを生成のボトルネックの一つです。ライブラリ表現を維持するために必要な/実行可能な多くの個々 のエレクトロポレーション反応を実施して以下の品質管理手順を実行するお勧め (10.6。 と 10.8。)。

1. 滅菌済みチルド PCR に (手順 8.8) から精製反応管の因数と氷 (チューブあたり 1 μ L) のそれらを保ちます。氷の上の 1 mm のギャップ エレクトロポレーション キュベットを冷やします。
2. DNA の 1 つの因数に直接作りたての TG1 細胞の 25 μ L を追加し、すぐにエレクトロポレーション キュベットに混合物を転送します。フリックやタップ細胞・ DNA ミックスを確保するためのキュベットは (閉じ込められた空気や泡) を持たないキュベット チャンバーの長さに沿って配られます。
3. スライド室のキュヴェットを配置し、適切なエレクトロポレーション プログラムを起動 (1.8 の例えば 1 パルス kV (EC1))。
   注: 時定数は、5.7 および 6.0 さん間にある必要がありますいる場合遺伝子導入装置アーク キュヴェットをフリック、商工会議所に気泡がないことを確認もう一度やり直してください。
4. すぐにキュヴェットに室温 2TY 媒体の 975 μ L を追加します。
5. Electroporated 細菌を 50 mL チューブに移動転送ピペットを使用して、します。10.2 のステップからを繰り返します。1 つ 50 mL のチューブの 1 つのライブラリに変換のすべてのセルを収集しています。
6. 総量を文書化します。
7. 品質管理手順
   1. 新たに生成された電子有能なセルの能力を定量化するには、ノーカット プラスミド DNA (例えば 10 pg pUC19 の制御プラスミド) の定義された数量を使用して別のエレクトロポレーション反応を実行します。これを 1.5 mL および microfuge の管に転送します。
      注: 能力は少なくとも 10¹⁰コロニー形成単位 (cfu) μ g の DNA をする必要があります。常に新鮮な細胞は通常これより実行します。
8. 225 rpm で 60 分の 37 ° C で変換された細菌を孵化させなさい。
9. 品質管理手順:
   1. 適切な抗生物質の選択と 10 cm 寒天プレート上のライブラリ (例えば10 μ L の 10-100 倍希釈) を細菌の定義された少量のプレート。
      注: は、(ステップ 10.6) から合計文化量を知ること、得られたコロニー数はライブラリ全体のコロニーの総数を推定する使用できます。ライブラリの 20-30 倍の表現を維持理想的にする必要があります。
10. 適切な抗生物質の選択範囲を含む 2TY コーティング寒天生物検定料理に細菌の残りの部分を分散させます。
    注: ~ 4,000 x g で 10 分間 (または表示ペレットを形成して上澄みがはっきり表示されるまで) での遠心分離によって文化の量を削減できます。これは、プレートが文化の広がり後に乾燥する必要があります時間を短縮します。液体培養ではなく、板の使用は、個々 のコロニーの肥大化を最小化します。¹³
11. 適切な抗生物質の選択と追加 10 cm 寒天培地皿に pUC19 コントロール エレクトロポレーション反応の適切な量を広げます。
12. 寒天一晩 (16 h) 37 ° c. で孵化させなさい
13. ライブラリの複雑さだけでなく、細菌の CFU/μ g の DNA を推定する制御板 (pUC19 とコントロール ライブラリ プレート) の得られたコロニーをカウントします。

11. プラスミッド DNA の抽出

1. 一晩のプレートに 2 TY メディアの 10 mL を追加、細菌層をオフに使い捨てスプレッダーを使用してプレートをこすり、50 mL のチューブで収集します。きれいなプレートのすべて表示されるまでに数回を繰り返します。
2. (2-3 列必要なバイオアッセイあたりプレート) プラスミド マキシ キットを使用して DNA を抽出します。

結果

手でプロトコルを使用して、CORALINA gRNA ライブラリは人間およびマウスのゲノム DNA⁹と BAC DNA (図 1) から生成されています。GRNA 発現ベクターへのクローニングのために適した入力の DNA の断片を生成するには、制御ヌクレアーゼ消化のための最適の条件は覚悟しなければなりません。ミクロコッカスヌクレアーゼ消化の最適化のための典型的な結果を図 2 aに示します。ヌクレアーゼの不十分な量 (0.1、2、3、4、4.5 または 5 単位) 作り出す必要なサイズ範囲 (10-100 bp) の顕著なプロダクトおよび 5.5 7.5 単位まだ断片が生成されるない平均長すぎる上にあります。大量の酵素 (50 台) は、10 分後入力 DNA の過度の低下に します。その結果、中間の量 (10 台) に選ばれました。ダイジェストされたスケール アップ十分生産する後続の精製とクローニング (図 2 b) の断片を消化します。盲目的にサイズによって DNA のフラグメントを選択し、方向の DNA のフラグメントの紫外線への露出を最小限に抑えるための DNA ラダーのみに依存することをお勧めします中のゲルは消化と切断の品質管理のためその後汚すことが。図 2 bは、20 と 30 bp の断片を DNA から切除されているページのゲルの代表的な例を示しています。ゲル精製 MNase 成功したサイズの選択と MNase 消化フラグメント (図 2) の浄化を確認するページのゲル 20% にフラグメントを読み込みました。手元のプロトコルは選択の gRNA 発現ベクターに MNase 消化断片のクローンを作成できるように、カスタマイズされたリンカー シーケンスの使用と互換性が。ここでは、gRNA PLKO⁹は、バックボーンとして使用されました。リンカーは、標準 PCR を使用して gRNA 発現ベクターから増幅されます。図 2 Dは、増幅されたリンカー シーケンス、不適切な追加を欠いているまたはないテンプレート amplicons の代表的な例を示しています。次に、リンカー amplicons は正しい方向に MNase 消化断片にリンカーが組み合わされてできるように制限の酵素と消化されます。予測 637 と 295 にリンカーの完全な消化力を示す図 2 Dを示し、5' と 3' のリンカーの agarose のゲルの前にハインドIII とSacII 消化後、それぞれ bp。ゲル画像の右側の部分は文書消化リンカー フラグメントの切除です。次ゲルの消化のリンカーの抽出、プロトコルの次のステップは終わり修理 MNase 消化フラグメント リンカーの結紮。リンカー シーケンスはペプタイドのプライマーを用いた PCR による生成される、ために、リンカーのセルフライゲーションは起こらないはず。だけで終わり修理 MNase 消化 DNA のフラグメントは、ligation に必要なリン酸基を提供します。次の刻み目変換結紮製品は PCR によって増幅されます。ライブラリ内の gRNA シーケンスの表現を歪める過度の PCR 増幅バイアスを避けるためには、増幅は合計で 20 未満のサイクルに限定されます。次の PCR 増幅製品は agarose のゲルを視覚化する困難です。32 サイクル別コントロール Pcr 製品を検出する行われ (しかしライブラリの準備のため使用されません)。このコントロールの結果 PCR図 2Eで表示されます。これにより、ライゲーション反応を最適化するために、時々「フラグメント コントロールなし」で発生する PCR の工芸品を欠いている反応を確実にする (NFC).図 2E目的の増幅を示します (5' リンカー DNA フラグメント + 3' リンカー、長: 869 bp) 次のフラグメントとリンカー シーケンスの等モル (1:1) 比を用いたライゲーション反応の増幅。

図 1: GRNA ライブラリの準備のためのタイムラインを提案します。CORALINA は、あらゆる有機体から DNA さまざまの茄多から包括的な gRNA ライブラリの生成のシンプルでコスト効率の高い戦略を提供しています。手でのプロトコルは、1 つの仕事週の間に完了するまで同伴可能です。リンカーの世代は、DNA の端-修理と並行して実行できます。Electrocompetent 細菌の準備 2 日かかります一晩成長ステップが含まれています、したがって反応されてアセンブリの前に開始する必要があります。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2: プロトコル間の重要な手順を実行します。 (A) 制御消化 BAC DNA の異なるサイズのフラグメントの生成を有効にします。ここで示すように、MNase 消化の最適化です。10 分 10 U MNase の生成 (20-30 bp) の所望の長さの DNA 断片の精製の BAC DNA は MNase の量が異なると扱われました。(B) サイズ ポリアクリルアミドゲルから切除を使用して 20 と 30 bp の断片の選択。精製の BAC DNA は、10 U の 10 分の MNase で処理しました。画像は、切除後記録されました。フラグメントのゲル精製の (C) 品質管理。ゲル精製後 1/6 20% 成功サイズ選択と浄化を確認するページのゲル精製 MNase の積まれ断片。(D) 方向クローニングようにリンカーのアセンブリおよび制限の酵素の消化力のためのリンカー配列の増幅。5' と 3' のリンカーは増幅され、 HindIIIとSacII、それぞれカットします。いいえテンプレート コントロール (NTC) は PCR の工芸品の DNA 汚染コントロールに含まれていた。左: 分析のサンプル アプリケーション。右: 取サンプル アプリケーション。画像はゲル切除後記録されました。PCR を用いた PCR サイクル (32) 数の増加と H₂O (NTC) テンプレート コントロールを実行せずまたは前のニック変換手順から NTC の使用によって制御される (E) DNA のフラグメントへのリンカーの結紮を分析できます。入力 (NTC NT))。コントロールが含まれていないフラグメントには (NFC), 結紮と元 MNase フラグメントが省略されたニック翻訳反応から増幅であることが重要です。どの MNase のフラグメントは、リンカー DNA と組み合わされているサンプル生産予想私アンプリコンだけ (869 bp)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

ディスカッション

CORALINA は、ターゲット DNA の制御ヌクレアーゼ消化、大規模な gRNA ライブラリを生成し、結果の二重鎖断片のクローニングを一括使用ことができます。統計的推論は、以上 10⁷個々 の gRNA シーケンスの多く既に正常にクローンされた手⁹でプロトコルを使用してを示します。CORALINA は、複数の方法でカスタマイズできます。DNA のテンプレートの選択は、ターゲット領域と生成されたライブラリの最大の複雑さを定義します。このプロトコルを使用すると、CORALINA ライブラリ以前は人間から生成され、マウスのゲノム DNA⁹。ここで示した代表的な結果には、精製の BAC DNA から CORALINA ライブラリの生成が描かれています。GRNA 式ベクトルとリンカー シーケンスの選択によっては、さらにカスタマイズを実現できます。我々 は以前効率⁹で少しバリエーションを持つギブソン アセンブリ リンカー長の 3 つの異なるペアをテストします。

一括消化 DNA から、その起源のため CORALINA gRNAs の protospacer は通常正確 20 長さ、しかしショー両方が依存する平均の長さ分布の bp MNase 消化のパラメーターおよび切除のサイズから作られたページのゲルs.図 2 bとC、、代表的な例は、19 と 27 bp 間の平均距離が断片を示しています。私たちの経験ではフラグメントの長さは生成された gRNA protospacer⁹で忠実に保持されます。一方、20 より小さいフラグメント結果 gRNAs のオフのターゲット速度が高いため避けるべきである bp、長いフラグメントははるかに少ないそれ以来下流のアプリケーションで問題を示した限り 45、protospacers と、gRNAs 可能性が高い bp はまだ機能⁹。

CORALINA プロトコルの 2 つの最も重要なステップは、MNase 消化断片のクローニング ステップ サイズの選択です。あまりにも短いフラグメントの生成 (例えば平均 18 歳以下 bp) またはあまりにも多くの空の gRNA 発現ベクターの取り込みはライブラリの無駄をレンダリングします。したがって、切除 (図 2 b, C) を監視する gRNA ベクター バックボーンの完全な消化力を確認し、プロトコル全体のフラグメント コントロールを含む、MNase 消化手順 (図 2 a) を最適化することが重要です。特別なケアは、gRNA ライブラリの表現を保持するためにも。ライブラリ生成の 1 つの一般的なボトルネックは、一般的に増幅の細菌にプラスミドの効率的な転送です。したがって、優れた能力を持つ細菌の大量と多数の個々 のエレクトロポレーション イベントは、高 gRNA クローン数を達成するために必要です。

GRNA ライブラリ用の新しい戦略は次の十年にわたって CRISPR ベースのスクリーニングのアプローチの完全な可能性を収穫する必要があります。モデル システムと異なる CRISPR ベース工学的アプローチの大きい数に従うのスクリーニングを行う前提の大規模なライブラリを生成するコスト効果の高い、シンプルでカスタマイズ可能なメソッドの重要な要求があります。CORALINA は、この第一歩を提供しています。潜在的な用途は多様、特にゲノムの包括的なライブラリを生成する、cDNA 由来のより少なく共通のモデル システム ライブラリ、高度に集中ライブラリおよび (異なる PAM とどの異なる CRISPR 蛋白質の実験のセットアップ要件) は、組み合わせで使用されます。

他のメソッドとは異なり、CORALINA は入力 DNA からすべての可能な gRNAs を生成します。ただし、メソッドの 1 つの欠点は、必要な PAM シーケンスを欠けている gRNAs、ライブラリ、gRNA ライブラリを生成、CRISPR を食べる (表 1) の 2 つ目の酵素法と共有している機能にも含まれていることです。最適な方法の選択の計画されたスクリーニングの仕様に依存する gRNA ライブラリを生成実験、(、規制、遺伝子) 特に気と対象地域 (単一の軌跡、複数の地域、ゲノム) のサイズ。我々 は CORALINA と多数の非コーディングを使用して特別な利点を参照してくださいまたは規定する領域が分析され、不完全なまたは信頼性の低い順序の情報がある場合 (エキゾチックなモデル システム、種 (内細菌叢解析など) の混合物または実験的に求めた入力)、異なる CRISPR 酵素を組み合わせた場合、または分析を飽和は短い、定義の軌跡 (例えばBACs によって表される) に対して実行されます。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
500 mM EGTA	Sigma Aldrich	03777-10G	1.4., Inactivation of Mnase
Novex Hi-Density TBE Sample Buffer	Thermo Fisher Scientific	LC6678	2.1.
Novex® TBE Gels, 20%, 10 well	Thermo Fisher Scientific	EC6315BOX	2.1., pre-made 20 % PAGE gel
O'RangeRuler 5 bp DNA Ladder,	Thermo Fisher Scientific	SM1303	2.1.
Novex® TBE Running Buffer	Thermo Fisher Scientific	LC6675	2.1., PAGE gel running buffer
Disposable scalpel, sterile	VWR	233-5363	2.3., other equivalent reagents may be used
SYBR Green I nucleic acid stain (1000x concentrate in DMSO)	Sigma Aldrich	S9430	2.3. +2.5., also available from Thermo Fisher Scientific (S7563)
UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1)	Thermo Fisher Scientific	15593-031	3.6.1. + 4.3., other equivalent reagents may be used
Glycogen	Sigma	10901393001	3.6.4., other equivalent reagents may be used
3M Sodium acetate , pH5.2	Thermo Fisher Scientific	R1181	3.6.4., other equivalent reagents may be used
Ethanol			3.6.4. + 9.1.8., molecular biology grade
Quick blunting kit	New England Biolabs	E1201	4.1.
ammomium acetate	Sigma	A1542	3.1., other equivalent reagents may be used
magnesium acetate	Sigma	M5661	3.1., other equivalent reagents may be used
0.5 M EDTA (pH 8.0)	VWR	MOLEM37465520 (or Promega V4231)	2.2. + 3.1., other equivalent reagents may be used
Agencourt AMPure XP beads	Beckman coulter	A63881	5.3. + 6.5.
Gel extraction kit	QIAGEN	28704	5.7.+ 7.1. +8.4., other equivalent reagents may be used
concentrated T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202T	6.1.+ 8.1.2.
Long Amp Taq 2X Master Mix	New England Biolabs	M0287S	6.3.
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer	New England Biolabs	M0531S	5.1. + 6.6., other equivalent reagents may be used
HindIII	New England Biolabs	R0104S	5.4.1.
SacII	New England Biolabs	R0157S	5.4.2.
AgeI	New England Biolabs	R0552S	8.2.1.
Tris base	Sigma	93362	8.1.1.
2M MgCl	Sigma	93362	8.1.1.
dGTP,dATP, dCTP, dTTP	New England Biolabs	N0446S	8.1.1.
DTT	Sigam	DTT-RO	8.1.1.
PEG-8000	Sigma	P5413	8.1.1.
NAD	Sigma	N6522	8.1.1.
T5 exonuclease	New England Biolabs	M0363S	8.1.2.
Phusion DNA polymerase	New England Biolabs	M0530S	8.1.2.
Taq DNA ligase	New England Biolabs	M0208L	8.1.2.
rSAP	New England Biolabs	M0371S	8.3.1.
TG1 competent cells	Lucigen	60502-1	9.1.
1mm gap electroporation cuvettes	VWR	732-2267	10.2.
Bio-Assay Dish (Polystyrene, 245 mm x 245 mm x 25 mm)	Fisher Scientific	DIS-988-010M	9.4.
NaCl	Sigma	S7653	9.3.
Bacto-tryptone	BD	211705	9.3.
Yeast extract	BD	212750	9.3.
Agar	Sigma	A1296	9.4.
Glycerol	Sigma	G5516	9.17.
MNAse	New England Biolabs	M0247S	1.1.
Nanodrop	Thermo Fisher Scientific	ND-2000	throughout
Micropulser	Biorad	165-2100	10.2.
Electroporation cuvettes	Biorad	732-2267	10.2.
250 ml centrifuge tubes	Corning	430776	9.1-9.9.