単球輪廻と慢性炎症性疾患を持つ個人から泡沫細胞の形成の定量化

要約

ひと内皮細胞膜間での単球によって輪廻と泡沫細胞にその後成熟を測定するプロトコルについて述べる。これは、別の病気の条件を持つ人々 から分離した単球の動脈硬化特性を評価するために、この傾向を高めるかもしれない血の要因を評価する汎用性の高い方法を提供します。

要約

冠動脈疾患 (CAD) は、罹患率と死亡率の世界の主要な原因です。アテローム性動脈硬化、主要な CAD の原因、太い動脈に動脈壁の中に含まれる脂肪質の縞と呼ばれる堆積した脂質の炎症性サイトに生得の免疫球輪廻によって開始されます。動脈硬化の初期段階での病変の重要な病原性機能は、泡沫細胞や脂質を含んだマクロファージを形成する動脈に移行する単球の成熟です。かなりの証拠は、リウマチ性関節炎、HIV と一般的な高齢化などの疾患に伴う慢性炎症性条件によってアテローム性動脈硬化のリスクが増加して単球によってこのリスクを予測する仮説をサポートしています活性化。マウス モデルは、粥状動脈硬化体内の単球の役割を調査するための良いプラットフォームを提供する、彼らは自然コレステロール代謝の遺伝的変化と通常のマウスの食事療法の抜本的な変更が必要し、の適合性が限られています。人間の併存症動脈硬化の影響の研究。これは定義されている病気の状態を持つ個人から分離した単球の atherogenic 潜在性を測定する人間の in vitroモデルを開発する動機。現在、人間の in vitroモデルは、単独で単球輪廻と発泡体細胞の形成を評価することを制限しています。ここでのプロトコルについて述べる患者血液から分離した単球は 1 型コラーゲン マトリックスにひと内皮細胞に執し、外因性の脂質の存在の有無で泡沫細胞に成熟する彼らの傾向を測定します。プロトコルは、HIV 感染症を持つ個人と高齢の HIV 感染者から精製したひと単球の使用のために検証されています。このモデルは汎用性とどちらか顕微鏡を用いて評価する単球輪廻と発泡セルを形成可能またはフローサイトメトリーと同様、動脈硬化の要因の評価を許可する血清・血漿中存在します。

概要

単球の輪廻転生は、血栓症、心筋梗塞や脳卒中につながる動脈硬化性プラークの開発の重要なステップです。大きな動脈、堆積した脂質が内皮細胞の活性化に貢献し、炎症¹をローカライズする培地で低振動血流のサイトで一般に存在している脂肪すじから動脈硬化性プラークを開発します。単球単球走化性タンパク質 (CCL2) などを介して脂肪筋の血管内皮細胞に補充され、内膜²に生まれ変わる。次の輪廻転生、単球は動脈硬化、脂質を含んだマクロファージ泡沫細胞脂質摂取、脂質の合成、コレステロール排出のダウンレギュレーションをまたは上記の要因の組み合わせの結果と呼ばれるフォームがあります。単球がありますも循環の脂質を蓄積し、'泡' の表現型、発泡セル形成^3,4のセルをおそらく素因があります。泡沫細胞が脂肪質の縞と早期動脈硬化性プラークの定義の特徴とその形成は脂質および炎症性メディエーター⁵を受けます。単球が逆にする能力を持っている代わりに、動脈からの血流に⁶、それにより内膜動脈の健康を維持する作用から脂質を除去する輪廻転生。

単球の傾向を決定する動脈内皮に執し、フォーム泡沫細胞内膜、または逆に輪廻転生しプラークから脂質を運ぶ、増加における単球活性化の役割を理解するための重要な要件は、動脈硬化のリスク。動脈硬化など CADs のマウス ・ モデル、リアルタイム体内脂肪ストリーク/動脈硬化性プラークの開発についての解明に重要です。ただし、これらのモデルは、処理能力により、(アポ/欧米型食事モデル) などダイエット^7,8, 抜本的な変化と相まって通常これらの動物の自然なコレステロールの遺伝的変化を必要とドライブ プラーク開発のレベル脂質を循環の非生理的集積を誘導します。これらのモデルは関連性慢性炎症性人間などの条件に HIV 感染を増加コレステロールまたは低密度リポタンパク質 (LDL) のレベルを循環させるのに関連付けられていない限られている可能性があります。さらに、人間とマウスの単球生物の違いは、単球のサブポピュレーションの関連性に関する免疫学的質問のテスト (中間単球など (CD14 +⁺CD16⁺))⁹難しい。これは、心血管疾患の中間単球数が心血管イベント^10,11を独立して予測運転のメカニズムを勉強するときに重要です。順番にどちらか単球輪廻や発泡セルにおける分離を測定する試金が存在するは、臨床コホートから同じ細胞を用いた初期の動脈硬化の両方の側面を定量化するための in vitroアッセイは検証されてはないです。Transwell モデルは変更された Boyden 二院制システム細胞上部室に読み込まれ、多孔質プラスチック障壁または単層細胞走化性因子¹²メディアが通常含まれる下院に輪廻転生を利用します。^,13白血球輪廻の分析に広く使用されているこれらのモデルのソリューションに移行する転生セルの結果、内膜を表すレイヤーを一般的には含めないようにと泡沫細胞の測定を許可しない。形成または同じセルの逆輪廻。逆に、泡沫細胞の形成のモデルは単球または泡の細胞形成¹⁴に貢献する知られている内皮細胞活性化の効果を輪廻による変更は考慮されません。さらに、これらのシステムは、泡を誘発する外因性の酸化低密度リポ蛋白質 (酸化 Ldl)^15,16、キー インデューサの濃度が飽和状態の添加による細胞培養皿に付着したマクロファージから細胞の形成泡沫細胞の形成。これらのモデルで使用される LDL 酸化され、しばしば CuSO₄治療¹⁷など非生理的-関連プロセスしたがって、これらのモデルを用いた研究の生理学的な重要性を問います。

ここ我々 こうして泡沫細胞の形成の単球の役割をより良いモデリング単球輪廻と同じセルの外因性の酸化 Ldl の添加を必要としない細胞の泡形成を定量化する試金を記述します。このモデルはもともと教授ウィリアム ・ ミュラー (ノースウェスタン大学、シカゴ)¹⁸, によって開発され、前のヴィヴォ非アクティブ化の下で分離された単球のクレンチアゼムを評価する私たちの研究室でさらに洗練されてきた条件個人から²⁰を老化し同様、HIV 感染¹⁹などの疾患に伴う基礎の炎症性疾患、動脈硬化症のリスクの増加に関連付けられています。このモデルはまたフォーム発泡セル²⁰、泡沫細胞の形成^{14 日時 TNF などのサイトカインによる内皮活性化の影響に異なる単球サブセットの性向に関する基本的な生物学的質問に答えるためのプラットフォームを提供します}と単球、深さなどの渡り鳥のプロパティとゲル¹⁹の輪廻の速度。さらに、単球の輪廻と泡の細胞の形成の標準的な顕微鏡を用いて定量化することができます、シス、フローサイトメトリー、フローサイトメトリーおよびイメージングの流れ、したがって、粥状動脈硬化の単球の役割を評価する汎用性の高い方法を提供します。

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プロトコル

注: アルフレッド病院人間倫理委員会、メルボルンから倫理の承認とひと生体試料を用いた実験を行った。すべての実験は、指定しない限り、クラス II の安全キャビネットで行われました。" Prewarmed " 試薬実験で 37 ° C に加温を指します

。

1 です型の準備 I 線維性コラーゲン ・ ゲル: 日 1

1. 準備順次追加し、35.7 mM NaOH を混合のコラーゲン ・ ゲルの重合、M199、4.58 mM 酢酸、1.71 mg/mL x 0.71 5 mL ポリスチレンにコラーゲン線維型。表 1 に従って管
   。 メモ: は、コラーゲンの形成を停止するために上下に 5 回軽くピペッティングしてコラーゲンが十分に混合されたであることを確認 ' ポケット ' ゲル混合物で。顕微鏡用テスト条件あたり 4-6 ゲルまたはフローサイトメトリー用テスト条件ごとの 15 のゲルを準備します
。
2. は、組織培養平底 96 ウェル プレートの各ウェルにコラーゲン ゲル混合物の混合、分注 50 μ L を一度も。外側の行と列を使用しないで、塗りつぶし、これらの 1 の 200 μ L x Dubecco ' s リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) ゲルを乾燥から守るために。37 °C/5% CO ₂ 重合コラーゲンを 2 h でプレートをインキュベートします
   。 注: は、均等な熱分布を確保するためのインキュベーターできれいな金属ラックに直接プレートを配置します
。
3. 次のインキュベーション、補われた M199 x 1 の 150 μ L をゲルをオーバーレイ (材料の表 を参照してください)、使用するまで 5 日間インキュベートします
。

2。保存された血管内皮の拡大: 日 1

1. ラベルとコート 10 cm 直径 50 μ G/ml フィブロネクチンの 1 mL をシャーレの 1x PBS で希釈した 10 分間室温でインキュベート
2. 雪解け因数凍結プライマリひと臍帯静脈内皮細胞 (血管内皮、1.0 x 10 の ⁶ セル) 10 ml M20
   。 注: 前述の ²¹ と低い通路番号で使用に螢光が準備する必要があります (< 4 を通過)。ひと冠動脈内皮細胞の螢光を置き換え可能性があります
。
3. 10 mL M20 で新生活を再懸濁します、吸引 3 日目でメディアを交換の細胞と文化合流点 (約 5 日) を添加する前に余分なフィブロネクチン フィブロネクチン コート皿に追加します
。

3。血管内皮膜コラーゲン ・ ゲル上培養: 日 5

1. 5 日培養ペトリ皿の上清を吸引して無血清 M199 の 10 ml の血清を含むメディアを洗い流す新生活をデタッチします
。
2. を螢光 M199 に 5 mL 0.05% トリプシン 0.53 EDTA を追加し、セルをデタッチするまで優しく揺れ、室温で 1-2 分間インキュベートします
。
3. 戸、一度すぐに 5 mL M20 でシャーレを洗うし、10 mL チューブに細胞を含むメディアを転送します
。
4. 、室温で 5 分間 300 × g で遠心分離機サンプル上清を吸引、M20、200 μ L に細胞を再懸濁します、診断を使用してセルをカウントします
。
5. 10 ⁵ セル/mL M20 x 2.0 に細胞を再懸濁します、96 ウェル プレート (手順 1.3) からゲルの M199 を吸引し、再懸濁新生活 (10 の ⁴ セル × 2.0) の 100 μ L を (ステップ 1.2) 上記の各コラーゲン ゲルに追加します。37 °C/5% CO ₂ でさらに 3 日間培養プレートします
   。 注: 血管内皮膜の完全性は、銀製硝酸塩のこの段階では ²² または ²³ タイト結合蛋白質の免疫組織化学を汚損によって 3 日後確認することができます。追加ジェルはこの目的のため準備する必要があります
。

4。螢光単分子膜と輪廻の単球の分離/活性化の活性化: 日 8

1. 日 8 の M20 を吸引して単球添加する前に各血管内皮膜をアクティブにゲルを重ね合わせると 10 ng/mL の 100 μ L を追加するメディアゲルあたり M20 で人間の tnf α。37 °C/5% で孵化させなさい CO ₂ 4 h
   注: 非アクティブの螢光条件も含まれますコントロールとして必要な場合です
。 磁場を利用した PBMCs から
2. の間の 4 h 螢光活性化ステップ、分離単球ビーズ製造業者に従って細胞の負を選択する技術 ' の指示。6.5 x 10 ⁶ PBMCs の最小値は、単球は通常 PBMCs の約 10-15% のアカウントに 1 つの条件に必要な 10 の ⁵ 球 x 3.0 を確実に回復するためにこのステップで使わなければなりません
   。 メモ: 単球活性化単球輪廻と発泡セルを形成する前の効果の評価、単球はこの段階で有効にできます。単球は解凍 PBMCs (すなわち、ストアドの患者サンプル) 必要な場合から隔離することができます。ゲル (図 1) に加え FACS を並べ替えることにより分離した単球サブセットを準備できます
。

5。プライマリのひと単球の輪廻: 日 8

1. 単球輪廻を測定、tnf α を含むメディアを削除および 100 μ L で 2 回ジェルを洗う M199 追加してメディアを削除します。2.0 x 10 を追加次の洗濯、⁵ たて分離解凍や洗浄 PBMCs または 5.0 x 10 の ⁴ たて分離した単球を凍結保存または血管内皮膜 100 μ L の単球サブセットを定義を精製した M20。ゲルに単球の前方の輪廻を許可する CO ₂ を 37 ° C、5% で 1 時間インキュベートします。6 井戸ごとの実験条件の検討を許可することをお勧めします
   。 注: 輪廻と泡の細胞形成に及ぼす自家血清を評価するには、m20 希望者の熱不活化の血清濃度をセルを孵化させなさいし、プール血清制御条件に比較します。この段階で単球以外の白血球を追加可能性があります。特定の脂質/脂質種 (例えば HDL、oxHDL) の影響を調査した場合 20-50 μ G/ml の脂質を含む無血清メディアとすべての以下の手順を実行します
。 Prewarmed 1 mm 1x PBS でグリコールエーテルジアミン四酢酸 100 μ L で 2 回と 100 μ L のゲルを洗浄することにより非転生細胞を収集
2. 後 1 h 前方輪廻の M199 (同じ遠心条件)、同じの各ウェルから培養上清をプーリング氷の上の 1.5 mL 遠心チューブに実験条件 (通常 6 井戸)。4 ° C、5 分 300 x g で非転生細胞を遠心し、30 μ L 1 × PBS に再懸濁します
。
3. 前方転生セルの数を決定する上清で収集したセルをカウントします
。
4. 前方転生細胞の割合は次のように決定されます:
   
5. カバー洗浄100 μ L で転生セルを含むゲル M20 しさらに 48 h.,
6. 後 48 h、上澄みを収集し、100 μ L で 2 回洗浄非転生セル prewarmed 1 mM グリコールエーテルジアミン四酢酸/PBS、収集とステップ 5.2 のように各条件から上澄みをプーリングします
   。 注: 逆転生細胞の表現型は、これらの細胞の f でテストします。プロトコルを汚す続いて標準フローサイトメトリー
。
7. は、4 ° c で 5 分間 300 x g 細胞を遠心し、30 μ L 1 × PBS で細胞を再懸濁します。セルをカウントし、トリパン ブルー染色で有効性を判断します
。
8. は、次の式を使用して、逆転生セルの割合を決定する:
   
   注: 会計進む転生セルの合計数は、低い前方輪廻だ逆輪廻のより正確な指標になります100% します
。
9. 顕微鏡による解析は、各ウェルに 100 μ L の 2% のホルムアルデヒド (最終濃度) を追加することによりゲルを fix カバー アルミ板箔し、分析まで 4 ° C で保存します。フローサイトメトリー、この段階でセルを修正できません。下顕微鏡 (セクション 6) または流れ cytometry (セクション 7) 分析のためのプロトコルを参照してください
   。 注意: ホルムアルデヒドは有毒、腐食性;個人保護用具 (PPE) を使用します。ホルムアルデヒドを追加するときに注意が必要、ただし、この手順は、使用される低濃度のためドラフト内で実行する必要はありません
。

6。泡沫細胞とマクロファージ (オイル赤 O 染色) 顕微鏡による定量

ホルムアルデヒドを取除き、5 分 50% (v/v) メタノールと、100 μ L 78% (v/v) メタノール 15 分の 100 μ L をゲルを洗浄する

1. 
   注: 実験室ベンチとクラス II バイオハザード キャビネットではなくに染色手順が実行可能性があります
。
2. 脂質による液滴作りたて 0.2% の 100 μ L 追加 (w/v) オイル赤い O (詳細については 表の材料 を参照) 室温で 1 時間のための汚れ
。
3. 4 ゲルを洗浄することにより削除余分な汚れ度 78% (v/v) メタノール、吸引と各ワシントン後上清を廃棄の 100 μ L
4. 対比染色ギムザの 100 μ L で室温で 15 分間蒸留水で 1:10 の希釈の
。
5. ギムザ染色を吸引し、一度水でゲルを洗浄します
。
6. 、プレートからゲルをデタッチするリムに向いて、ゲルの端のまわりのベベル 21 G 針を使用して井戸
。
7. 顕微鏡スライドにゲルをマウントする は、両面テープの 2.54 cm × 1.5 cm のストリップの 2 つの穴 (直径 6.35 mm) をパンチします。標準的な顕微鏡側にテープを修正し、上からの保護コーティングを削除します。
   1. 追加転送ピペットを使用してテープの穴に水を一滴。テープとサイズ 1.5 のガラス基盤をカバーの穴にゲルを転送軽くピンセットを使用します。テープに付着する上、軽く押します
   。
8. 微分干渉コントラスト明視野顕微鏡倒立顕微鏡による 40 × 対物を調べる。
   1. 持参フォーカス 40 X を血管内皮膜拡大とスクロール ' に ' ゲル、ゲルの全体の深さ中マクロファージ/発泡セルをカウントします。可能なエッジ効果を最小限にするためにゲルの端から同じような距離に位置する 3 つの異なるフィールドのビューに対して繰り返します。これにより、ゲルの深さが地域を数える間で一貫しています
      。 注: スコア ゲルの細胞としての泡沫細胞 (セルとして定義されている > 1/3 オイル赤い O と細胞質の染色脂質液滴) または大食細胞 ( 図 2) のスライド マウントの 2 時間以内。泡沫細胞の形成は、移行されたセルの合計数を基準にして泡沫細胞の割合として表されます、3 の視野の中央数について 6 ゲル 1 つの条件、従って 18 測定条件ごとの中央値として表されます。典型的な実験からの生細胞数の例を 表 2 に示します
      。 注: 顕微鏡による発泡セル対マクロファージとしてセルの分類は主観的なもの、したがって調査官依存をすることができます。臨床試験、拡張期間にわたって実行している実験で単一の調査官に目がくらんで実行するすべてをカウントするため重要です。泡沫細胞とゲルにおけるマクロファージの例 図 2 で提供されます
   。

7。フローサイトメトリーによる細胞の転生の分析

1. 表現型泡沫細胞とマクロファージの遊走を次を特徴付ける、37 ° C prewarmed 1 mg/mL コラゲナーゼに M199 で希釈した D の 100 μ L を追加することにより、ゲルをダイジェストにまあ、37 °C/5% CO ₂ で 20 分間インキュベートします
   。 注: は、均等な熱分布を確保するためのインキュベーターできれいな金属ラックに直接 96 ウェルのプレートを配置します
。
2. 次のインキュベーション、200 μ L ピペット チップを使用してゲルを漬け込むし、37 °C/5% CO ₂ でさらに 20 分間インキュベートします
。
3. は一度完全に消化、フィルターとプール 35 μ m ナイロンを通して消化レプリケート ゲル メッシュ キャップ FACS チューブを氷の上に配置、洗って一度 FACS で洗う (材料の表 参照) 4 ° C で、300 x g. FACS の 100 μ L に細胞を再懸濁しますワシントン州
4. は CD45、ライブ/死細胞のマーカーおよび標準的な流れの cytometry のプロトコルを使用して興味の表面/細胞表現型または機能マーカーの特異蛍光標識抗体を結果として得られる細胞をインキュベートします
   。 注: コントロールを準備する適切な fluorophores が付いて、Ig 補償ビーズを用いた補償用チューブ。抽出されたセルは、cytospinning による蛍光顕微鏡用スライド ガラスにも収集できます。また、我々 は正常にフローサイトメトリーをイメージングによる評価のこのプロトコルを使用してセルを収集している
。
5. 流れの cytometer を使用してセルを取得し、必要に応じて補正を実行します
   。 注: 泡細胞/マクロファージの機能が光の拡散プロパティを使用して個々 の集団を形成することがなく、サイズや形状はかなり異なる場合があります寛大な前方散乱 (FSC) と設定側散布 (SSC) ゲートで示すように、移行後のすべてのセルをキャプチャするために <強いクラス ="xfig"> 図 3A.
6. 次の買収は、流れの cytometry のソフトウェアを使用してデータ解析を行います。移行した細胞を特定するには、まず 図 3 b に示すように、ライブ/デッド マーカーに負の値としてセルを選択します。次に、単一セルの差別を実行 SSC 地域対 SSC 高さプロットにセルの周りタイトなゲートを作成します
。
7. CD45 を選択 ⁺ 細胞し、マクロファージ/泡沫細胞として FSC/SSC プロットに移行した細胞の主要な人口をゲートします
。

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結果

単球輪廻の定量化

モデル図 1で説明したように単球が追加され、条件ごとに六つのジェルを用意します。ドナーごと 6 ゲルの球 (すなわちゲル 6 ゲルあたり 10 の⁴球 × 5.0 = ドナーあたり 10 の⁵球 x 3.0) 600 μ l 必要な血清/分離した脂質を含む M199 メディアの最終巻に?...

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ディスカッション

ここで説明したプロトコルでは、単球輪廻と泡沫細胞の形成の両方を組み合わせることによって人間の臨床コホートから単球のクレンチアゼムを評価するための汎用性と関連する生理学的方法を提供しています。このモデルは、単球輪廻泡沫細胞の形成の影響を考慮し、逆輪廻⁶に加えて固有の測定が可能泡沫細胞の形成の方法上の利点を提供しています外因性の要因の有無...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gel preparation reagents
NaOH	Sigma-Aldrich	221465-500G	0.1 M NaOH diluted in H20
10x M199	Sigma-Aldrich	M0650
AcCOOH	Sigma-Aldrich	695092-100ML	20 mM Acetic acid diluted in H20
Cultrex Bovine Collagen I	R&D Systems	3442-050-01	Type I Fibrous Collagen
Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture
M199	Life Technologies	11150-059	M199 media containing Earle's salts, L-glutamine and 2.2 g/L Sodium Bicarbonate. Media supplemented with 100 µg/mL L-glutamine  and 100 U/mL penicillin/streptomycin
M20			Supplemented M199 containing 20% heat-inactivated pooled or donor serum. Individual lipid species such as LDL can be added to M199.
HUVEC			Primary human umbilical cord endothelial cells (HUVEC) can be isolated from umbilical cords donated with informed consent and ethics approval. Isolated HUVEC may also be purchased commercially.
Human coronary artery endothelial cells			Primary human coronary artery endothelial cells can be isolated from arteries donated with informed consent and ethics approval. Isolated cells may also be purchased commercially.
EDTA	BDH Merck	10093.5V	Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) - 0.5 M, pH 8.0
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889-500G	Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) - 1 mM, pH 8.0
0.05% trypsin EDTA	Gibco	25300-054	0.05% trypsin/0.53 EDTA (1X)
L-glutamine	Gibco	25030-081	L-glutamine (200 mM)
Penicillin/streptomycin	Gibco	15140-122	Penicillin/streptomycin (10,000 units/mL Penicillin and 10,000 µg/mL Streptomycin)
New born calf serum	Gibco	16010-142	New born calf serum: New Zealand origin
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F1056-1MG	Fibronectin - 50 µg/mL aliquots prepared and stored
PBS (1x)	Gibco	14200-075	Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (10x): Dilute to 1x with sterile H20
0.1% TNF	Gibco	PHC3015	Recombinant human TNF - Reconstituted in H20 and stored in 10 µg/mL aliquots
Low-density lipoprotein	Merck Millipore	LP2-2MG	Low-density lipoprotein (LDL)
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopy
1 or 2% formaldehyde	Polysciences	4018	1 or 2% formaldehyde diluted with sterile H20
50% and 78% methanol	Ajax Finechem	318-2.5L GL	50% or 78% v/v methanol, diluted with H20
Oil Red O stain	Sigma-Aldrich	O0625-25G	Dilute to 2 mg/mL in 22% 1M NaOH and 78% (v/v) methanol
Microscope slides	Mikro-Glass	S41104AMK	Twin frosted 45 degree ground edge microscope slides (25 X 76 mm)
Cover slips	Menzel-Gläser	MENCS224015GP	22 x 40 mm #1.5 size glass cover slips
Double-sided tape	3M Scotch	4011	Super strength exterior mounting tape (25.4 mm x 1.51 m)
Giemsa stain	Merck Millipore	1.09204.0500	Giemsa's azur eosin methylene blue solution (dilute stock 1:10 in H20)
Hole punch			Hand-held single hole punch (6.35 mm punch)
Name	Company	Catalog Number	Comments
Flow cytometry
Collagenase D	Roche Diagnostics	11088858001	Collagenase D diluted in M199 media to 1 mg/mL
35 µm nylon mesh capped polystyrene FACS tubes	BD Biosciences	352235	35 µm nylon mesh capped polystyrene FACS tubes
Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain	Life Technologies	L34959	Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain
FACS wash			Prepare by mixing 1 X PBS-, 2 mM EDTA and 1% New born calf serum
Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasticware
96 well plate	Nunclon	167008	Delta surface flat-bottomed 96 well plate
10 cm Petri Dish	TPP	93100	Sterile 10 cm Petri dish
1.5 mL Eppendorf tubes	Eppendorf	0030 125.150	Eppendorf tubes
Transfer pipette	Samco Scientific	222-20S	Sterile transfer pipette (1 mL, large bulb)