誘導およびマウス モデルにおける脳海綿静脈奇形のマイクロ CT イメージング

要約

このプロトコルはマウス モデルにおける脳海綿静脈奇形病の誘導を示し、使用造影病変の負担を測定するマイクロ コンピューター断層撮影。このメソッドは、分子基盤と脳海綿静脈奇形の潜在的な治療とその他の脳血管疾患を勉強する確立されたマウス モデルの価値を高めます。

要約

突然変異、 CCM1 (別名 KRIT1)、CCM2、またはCCM3 (別名 PDCD10)遺伝子は人間の脳海綿静脈奇形 (CCM) を引き起こします。CCM 病気のマウスモデルはCcm遺伝子は生後のタモキシフェンによる削除によって設けられています。これらのマウスのモデル分子機構と CCM の病気のための治療上のアプローチを調査するための非常に貴重なツールを提供します。これらの動物モデルの完全な値を活用する病変負担と進行を評価する正確な定量的な方法が欠かせません。ここでは、CCM 病マウスモデルでの誘導を示す、コントラストの使用強化 x 線マイクロ コンピューター断層撮影 (マイクロ CT) マウス脳におけるメジャー CCM 病変負担します。生後日 1 (P1)、 Ccm2の floxed の対立遺伝子を切断するのに Cdh5 CreErt2 遺伝子から Cre リコンビナーゼ アクティビティを有効にするのに 4-hydroxytamoxifen (第 4 はレディース) を使用しました。マウス脳における CCM の病変は、P8 で分析しました。マイクロ CT によるヨウ素・ ルゴール液脳組織のコントラストを高めるため使用しています。スキャン パラメーターを最適化し、約 25 μ m の最小機能サイズにつながる 9.5 μ m のボクセル ディメンションを利用しました。この解像度で世界的にかつ正確に、CCM 性病変の容積と数を測定し、高品質マウス脳の CCM 病変の 3次元マッピングを提供するのに十分です。このメソッドは、CCM と他の脳血管疾患の分子基盤と潜在的な療法を研究するため設立されたマウス モデルの価値を高めます。

概要

CCM は壁が薄く、人間の人口¹で最大 0.5% の有病率と脳の血管の奇形を拡張します。CCM は、3 つの遺伝子の 1 つの機能喪失変異による支配的な障害として継承できる: CCM1 (別名Krit1)、 CCM2、およびCCM3 ( PDCD10とも呼ばれる)^{2,3,4 ,5,6}。これらの遺伝子は、単一の複雑な信号に存在。

モデル CCM 疾患、CCM^7,8,9,10は、CCM の遺伝子の下流の経路を理解し、様々 なモデルが開発されています。最も堅牢なモデルは、新生の子犬^8,10P1 をタモキシフェン誘導Cdh5 CreERT2とCcmの遺伝子のいずれかを条件付きで削除することです。これらの子犬は、CCM 以降の P6 から脳の病変を開発し、検索メカニズムのための前臨床試験および CCM 病気の治療に治療薬のための理想的なモデルをする予定です。

マウス脳における CCM 病変負担を組織ベースのメソッドは、非常に時間がかかるアプローチによって主に測定し、捜査対象となるバイアス^10、11,12。MRI 法は、成体マウス モデル^9,13CCM 病変負担を評価するために使用されています。ただし、専門性の高い小さな動物 MRI 計測器と一夜にして数時間の長いスキャン時間は、CCM の病変を識別するための満足のいく解決を達成するために必要です。また、新生仔マウスの CCM の病変を検出するための MRI の使用かどうかは報告されていない、解像度は感度を制限可能性があります。

最近、画像、CCM 病変^14,15を分析してマイクロ CT 技術を開発しました。この高解像度、時間とコスト効果の高い方法劇的に解明と治療研究で CCM 病モデルの値をブーストしました。コントラストを向上させる、全体のマウント染色法は、軟部組織、マウス胚^16,17のマイクロ CT イメージングのために使用されています。以前は、染色、オスミウム ベース マイクロ CT イメージング脳¹⁴CCM 病変のコントラストを高めるために使用している我々。本稿で我々 は毒性の低い、非破壊、使用、コスト効率の高い試薬、ヨウ素によるマイクロ CT 画像のコントラストを高めるため、ルゴール液。ヨウ素脳内に拡散することができますで、血液¹⁸の親和性が高い。

詳しいプロトコルはイメージングと共に新生児マウス モデルにおける CCM 斑の誘導とコントラストに基づくマイクロ CT CCM 病変の解析の紹介します。このマイクロ CT 法 CCM 性病変の容積測定の定量的なグローバルの提供数とマウス脳における CCM 病変の 3次元位置を正確に識別、コストの大幅削減し、これらの動物の表現に必要な時間。

プロトコル

すべての動物の倫理およびプロトコルはシドニー ローカル健康地区動物福祉委員会と制度的動物ケア使用委員会 (IACUC) 天津医科大学によって承認されました。センテナリー大学、シドニー大学、天津医科大学のガイドライン/規制の下ですべての実験を行った

1。マウス モデルにおける脳海綿静脈奇形の誘導

1. クロス Cdh5-CreErt2;Ccm2 ^{フロリダ州/フロリダ} Ccm2 ^{フロリダ州/フロリダ} のリットルを生成するマウス Cdh5-CreErt2;Ccm2 ^{フロリダ州/フロリダ} (Ccm2 ^iECKO) 子犬と濾胞 (Ccm2 ^{フロリダ州/フロリダ州})。前述の ¹⁹ をされている Cdh5 CreErt2 Ccm2 ^{フロリダ州/フロリダ} 動物.
2. 100% エタノールで第 4 はレディースを溶解し、30 μ L の因数で-80 ° C で保存 (第 4 はレディース濃度: 10 mg/mL)。コーン油 (0.5 mg/mL) の検体第 4 はレディースを希釈使用の日
。
3. 第 4 はレディースの 50 μ L を注入量 (0.5 mg/mL) インスリン注射器を使用して実験の CCM 病変を誘発する P1 で新生児の子犬にします
。

2。マイクロ CT スキャンのための試料調製

1. 二酸化炭素窒息を通して P8 で新生児子犬を安楽死させる
。
2. マウス心臓の心室に PBS で 10 mL の注射器で 3 ml の 2% のパラホルムアルデヒドの 29 g 針を挿入して心臓内の血流を実行します
   。 注意: パラホルムアルデヒドは有毒である;適切な保護具を着用します
。
3. は、はさみを使って体から頭をデタッチします。頭、はさみを使用してすべての皮膚を削除し、剥離鉗子を使用して全体の脳を解剖する頭蓋骨
。
4. X 倍率、1 x 利得、0.6 ガンマと露出時間を 20 ms 7.82 顕微鏡で脳の画像を撮影します
。
5. は一晩 PBS 溶液中 4% パラホルムアルデヒドで切り裂かれた脳を修正します
   。 注意: パラホルムアルデヒドは有毒である;適切な保護具を着用します
。
6. 次の日に、鉗子を使用して hindbrains を取り外し、PBS 溶液で洗浄します
。
7. インキュベート ルゴールで hindbrains ' 48 h. の s ヨード溶液
8. 次の孵化、簡単に空気乾燥過剰ルゴールを削除する hindbrains ' s ヨード
。
9. 、ルゴールをパック ' s ヨード染色 0.65 mL 遠心チューブと組織収縮 ( 図 2 A) を避けるためにプラスチック パラフィン フィルムで完全にシールで hindbrains です
。
10. ( 図 2 B) のスキャン中に移動からそれらを防ぐためにスポンジと 5 mL プラスチック チューブにマイクロ遠心チューブ用を配置します
。

3。マイクロ CT スキャンの CCM マウス脳内

1. マイクロ CT システムのアルミ ホルダーをチューブでパック後脳を垂直にマウントします
。
2. 540 予測と 50 のソースの条件と 2 s の露光時間にスキャン パラメーターを設定 (画像解像度 9.5 μ m/ピクセル) の断層のデータセットを取得する kV と 10 W
。
3. スキャンからレントゲン写真が自動的に再構築マイクロ CT システムによって提供されるハードウェア ベースの投影再構成ソフトウェアによって 16 ビット軸スライスの画像シリーズを生産 (" TXM " ファイル).

4。マイクロ ct 画像の解析

1. 再建されたイメージ ファイルを開く (" TXM " ファイル) 3次元解析ソフトウェアで脳を使って視覚化し、" ボリューム ・ レンダリング " 関数
。
2. 変換による目的のオリエンテーションに菱脳、" 境界ボックス " と " クリップ平面 " 関数
。
3. 拡張モードで変換後のイメージをリサンプルし、ボクセル サイズを維持します
。
4. 作成 " 新しいラベル] フィールドを編集 " (4.3) の変換後のイメージにグレースケール強度を使用して脳だけを強調表示します
。
5. が強調表示されている領域を追加し、実行 " ラベルの分析 " 全体菱脳 (すなわち、総体積と面積) の測定値を取得します。単位の Excel ファイルをエクスポートします
。
6. 菱脳使って視覚化、" 等値面表示 " 機能
。
7. を別に作成 " 新しいラベル] フィールドを編集 " グレースケール強度による病変でイメージとハイライト部分を変換します
。
8. が強調表示されている領域を追加し、実行 " ラベル "、菱脳 (すなわち、総体積と面積) 内病変の測定分析。単位の Excel ファイルをエクスポートします
。
9. を使用して病変を可視化、" 表面を生成する " と " 表面図 " 関数
。
10. 目的のオリエンテーションでは、菱脳の画像をスナップショットまたは病変の 3次元可視化のための映画を生成します
。

結果

第 4 はレディース P1 での単回投与は、CCM 小脳病変を誘発するのに十分だった。複方ヨードとは対照的マイクロ CT は十分に CCM 病変を検出し、そのボリュームと数を定量化することができます。最適化されたマイクロ CT を活用し、CCM 病変Ccm2^iECKOマウスの hindbrains をイメージしています。異なる深さと方向で脳実質内病変全体の可視化を許可されて、マ?...

ディスカッション

CCM は、個人¹の 0.5% まで影響を与える一般的な血管の奇形です。CCM は、散発的なまたは家族性の形で発生します。患者の予後の CCM 病変がストロークやその他の神経学的な結果を引き起こすことが突然破裂、しばしば明らかではありません。現在、唯一の治療法の選択肢は外科的伴われる高リスク病変を取り除くことです。

人間の CCM 条件で再現された?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-hydroxy tamoxifen	Sigma-Aldrich	H6278	To activate Cdh5-CreErt2
Corn oil	Sigma-Aldrich	C8267-500ML	To dilute 4-hydroxy tamoxifen
Stereomicroscope	Leica	M205FA	To take macroscopic images
Lugol's Iodine solution	Sigma-Aldrich	L6146	To stain samples for contrast micro-CT
Plastic paraffin film	Parafilm	PM992	To package samples
Micro-CT	Xradia	MicroXCT-400	Micro-CT
3D rendering software	FEI Visualization Science group	Avizo 3D image processing software	To analyse micro-CT scans