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要約

勉強がん微小環境は免疫療法への臨床応答の予後や予測バイオ マーカーを識別できます。こちらに掲載しては革新的な手法に基づいてその場で蛍光スペクトルを分析し、様々 な集団を自動的に CD8 をカウント+ T 細胞。この再現性と信頼性の高い技術は、大規模コホート解析に適しています。

要約

免疫細胞は腫瘍微小環境の重要なコンポーネントであるし、発癌のすべての段階での腫瘍の成長と進化に影響を与えます。特に、それは今確立してひと腫瘍における免疫の浸潤が予後と治療への反応を関連付けることができます。腫瘍微小環境における免疫の浸潤の解析患者および治療に対する反応の分類の主要な課題となっています。

プログラム細胞死蛋白質 1 (PD1; として知られている CD279)、細胞傷害性 T リンパ球関連タンパク質の 4 (CTLA-4)、T 細胞免疫グロブリン、ムチンを含むタンパク質-3 (ティム 3; として知られている CD366)、リンパ球などの抑制性受容体の共発現アクティブ化の遺伝子 3 (ラグ 3; 別名 CD223) は、T 細胞の枯渇の特徴です。その場で多重蛍光染色、細胞レベルでこれらの抑制性受容体の共発現を定量化することを開発しました。腎細胞癌 (RCC) のフリーズされたティッシュのレトロスペクティブ シリーズでは、画像解析ソフトと相まって蛍光マルチ スペクトル イメージング技術を使用して、腫瘍浸潤 CD8 で PD 1 とティム-3 の共同式が見つかりました+ T 細胞RCC の予後と相関しています。我々 の知る限り、このを表します、この自動多重原・ テクノロジーを示す最初の研究いくつかの臨床的意義があります。

概要

過去数年間の免疫療法は、RCC を含む癌の多くの種類のための非常に有望な治療法として浮上しています。特に、免疫抑制のチェックポイントの阻害に基づく PD 1 のような臨床的に効果的な1,2,3,4,5,報告された ctla の条項 46。 モノクローナル抗体 CTLA-4、いくつかのがんでは既に承認されて PD-1、またはプログラム死配位子 1 (PD L1) と患者7の 20% 以上の長期的な臨床反応をもたらします。それにもかかわらず、ないすべての患者が反応、治療費が高い、これらの治療法は、有毒である、潜在的な深刻な自己免疫性のような副作用に 。したがって、現在の課題は、これらの新しい免疫療法を予測するマーカーを識別するためにです。臨床応答と相関する腫瘍、PD L1 の式または+ T 細胞浸潤 cd8 陽性腫瘍のレベルでの突然変異率を報告されています。しかし、この協会は非小細胞肺癌 (NSCLC) 癌患者8 で Pembrolizumab の管理の前に PD L1 の仲間のテストを除いて臨床実習では臨床マーカーの使用をお勧めしますには弱すぎます。、9,1011,12。PD 1、ティム-3、ラグ-3 のように多くの抑制性受容体の共発現し、CTLA-4 誘導細胞枯渇表現療法13,14,15への抵抗、それは実証されています。末梢血は、腫瘍微小環境の代表ではない、原細胞の表現型の機能の分析に関心の高いのです。PD 1 とティム 3 の共同表現する T 細胞が、いくつかのコンテキスト13,16,17機能的障害の細胞として知られています。この研究で 2 つの抑制性受容体 PD 1 の共発現と CD8 のティム-3 の予後への影響+ T 細胞が評価されました。

腫瘍浸潤リンパ球 (TILs) で複数のマーカーの共発現を勉強して、今までは主に流れフローサイトメトリー解析、新鮮な腫瘍とそのため除外解析上で動作する必要があるサービスによって実行されました。従来その場で染色、一度に 1 つだけの染色を実行できますと共同マーカーを表現するセル型の評価は不可能します。たとえば、PD L1 は、PD L1 を発現する細胞相関研究より関連している従来の免疫組織学的解析による定義を難しく腫瘍微小環境の多くの細胞のタイプによって表されます。今回、我々 は腫瘍浸潤 CD8 PD 1 とティム-3 の共発現を関連付けるコンピューター カウントで革新的なその場で多重蛍光方法を開発+ RCC の臨床結果と T 細胞。このテクニックに制限された間隔をキャプチャすることができますマルチ スペクトル カメラを用いた同時に単一セルのレベルで複数のマーカーを分析する可能性を含むいくつかの利点は、> 10 nm ~ 液晶フィルター18。さらに、プロシージャは自動オペレーター間の再現性とマニュアルのテクニック19に比べて短縮分析ができます。がん分野でいくつかの研究報告、メルケル細胞癌、肺癌、頭頸部癌20,21,22, PD 1、PD L1、cd8 陽性など免疫の分子の複数の染色を説得23. 自動細胞数はユーザー (表現型解析ステップ) による訓練で可能です。蛍光は、別の細胞コンパートメント (核、細胞質と膜) で測定されます。

ここでは、腫瘍浸潤 CD8 の異なるサブセット+ T 細胞表現する PD 1 および/または RCC の大規模コホートでティム 3 は数えられ結果が臨床重力得点と生存率パラメーターと相関しました。また、フローサイトメトリーのような蛍光強度の意味 (MFI) データと携帯電話の解像度で膜の蛍光強度を分析することが可能だった。我々 の知る限り、これは最初の研究レポート予後結果に基づいてカウントするマルチ スペクトル イメージングの技術を使用して表します。

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プロトコル

本研究はヘルシンキ宣言に基づき実施し、ローカル倫理委員会 (CPP イル ・ ド ・ フランス」2012-05-04) によって承認されました。コホートに含まれている参加者からインフォームド コンセントを得た。

1. 組織材料

  1. 手術の日に RCC 組織サンプルを収集します。常温 (病理) 手術標本を処理します。
  2. 約 0.5 cm × 0.5 cm × 0.5 cm サイズ ドライ チューブでの腫瘍のサンプルを収集します。スナップ液体窒素で凍結し、-80 ° C で保存
  3. 最適な切削温度化合物のサンプルをコートします。4-6 μ m 厚いセクションにサンプルのセクション-20 ° C でクライオスタットを。サンプル 12 h のスライドした空気乾燥し直接-80 ° c 乾燥を避けるために保存をしましょう。
  4. ヘマトキシリンとエオシン染色セクションを表示するサンプルの品質を確認してください。

2その場で蛍光染色ティルズ。

  1. 手続きのガイドライン
    1. 室温ですべて実験手順に従います。
    2. すべての手順、Tris バッファー食塩 (TBS; 参照テーブルの材料) で希釈を実行します。
    3. 一次抗体の孵化後 tbs を除くすべてのステップのための洗浄を実行します。後者は、Tris バッファー生理食塩水 Tween20 を使用 (TBST、材料表を参照してください)。バッファー構成と再構成は、補足表 1を参照してください。
    4. 抗体の孵化および洗浄のため染色瓶に湿度チャンバーを使用します。
    5. セクションのプロシージャの間に乾燥をさせてください。
  2. 前処理
    1. 組織サンプルを含むスライドを解凍し、慎重にペーパー タオルをもつ試料周りスライドを乾燥します。疎水性障壁ペンで組織を含む反応領域の外縁 (材料の表を参照してください)。2 分間乾燥させます。
    2. 5 分、2 分、乾燥 100% アセトンのサンプルを修正し、10 分間 TBS で洗いします。
  3. 彩度と封鎖
    1. アビジン 0.1% の 3 滴と 10 分のためのスライドの前処理、タップやフリック、アビジンを配布、空気の泡を削除し、ビオチン 0.01% の 3 滴と 10 分のため、治療にスライド (参照材料表)、タップやフリックします。TBS と洗う
    2. Fc の受容器の封鎖を実行します。TBS. 使用標識二次あるいは三次抗体として同一宿主動物種から血清希釈血清の 5% ボリューム/ボリュームの 100 μ L を適用 (材料の表を参照)。ここでは、ロバ血清が使用されました。30 分間インキュベートします。
    3. 、インキュベーション中にスピン抗 CD8、PD-1、およびティム 3 抗体 (材料表) が簡単に。補足の表 2で説明した TBS の一次抗体のミックスを準備します。
  4. 免疫染色、CD8 の PD-1 とティム-3
    1. 一次抗体の混合物を準備します。使用される抗体の材料表および補足の表 2を参照してください (抗 CD8、PD 1、ティム-3、および彼らの対応する二次抗体) と濃度。
    2. タップやフリック (2.3.2 の手順で追加) 残りのロバ血清。加湿チャンバーで 1 h の非標識一次抗体ミックスの 100 μ L でスライドを孵化させなさい。
    3. 、インキュベーション中に簡単にスピン シアニン 5 抗家兎、AF488-アンチ-ヤギとビオチン標識抗マウス抗体と補足の表 2で説明したように、二次抗体のミックスを準備します。
    4. スライド 5 分ドライ TBST でスライドを洗います。
    5. 加湿チャンバー内で 30 分間二次抗体の 100 μ L でスライドを孵化させなさい。
    6. 補足の表 2で説明したように、Cy3 ストレプトアビジンを含む第三紀の抗体の混合物を準備します。
    7. TBS で 10 分ドライ用のスライド、スライドを洗ってください。
    8. 30 分の第三紀の抗体の混合物の 100 μ L でスライドを孵化させなさい。
    9. TBS で 10 分ドライ用のスライド、スライドを洗ってください。
  5. 携帯実装
    1. 4' のスライドをマウント、6-Diamidino-2-Phenylindole、塩酸 DAPI 含む coverslip 蛍光顕微鏡と互換性を持つ媒体 (1.5 μ g/mL DAPI) を取り付け (材料の表を参照)。
      注: 各実験のための否定的なコントロールとしてアイソタイプをマッチさせた抗体を 1 つのスライドが対応する抗体と同じ濃度で使用されました。この染色マウス IgG1、ウサギ IgG、およびヤギ IgG ネガティブ コントロール抗体価 (材料の表を参照) を使用しました。肯定的な制御としては、各実験のためのテストされたマーカーに陽性であること知られている人間の hyperplasic 扁桃を使用しました。典型的な染色結果 (図 1) の説明です。モノラル CD8 の染色、PD 1 とティム-3 必要があります個別に行う必要 (スライドごと 1 つ染色) 同じ前処理と DAPI なし。抗体および DAPI メディアをマウントのみなし同じ実験条件でスライドも行わなければなりません。スライドは、抗体と DAPI せず同一の実験条件を使ってイメージ化される必要があります。

3. 蛍光分析と自動細胞数

  1. 自動顕微鏡画像集録
    1. プロトコルを作成します。
      1. 自動顕微鏡ソフトウェアと蛍光照明器具を入れます。
      2. メニュー バーで「ファイル」「プロトコルを作成する」をクリックして選択「DAPI、」「FITC、」と"TRITC"
      3. クリックして"Next"「組織] セクションで、」とクリックして「次へ」「プロトコル名」選択する名前、たとえば、「CD8-PD-1-ティム-3、」クリック「次へ」と「保存」
      4. 手動でスライドをステージに配置します。
      5. メニュー バーで、「セットアップ」「設定」をクリックします。新しいウィンドウで「ホーム Z セット」をクリックします。
      6. 露光時間を調整すなわちCD8 陽性対照とスライド、PD 1 ティム 3 トリプル-染色 DAPI サンプル。
      7. コントロール バーの「露出を設定」をクリックします。
      8. 十分がない飽和信号が得られるまでは、フィルターごとに露出時間を調整します。
      9. モノクロ画像は、以下を実行します。
      10. 取得を選択し、「オート フォーカス」[DAPI フィルターを選択します。
      11. 「スキャン領域制限」の目的の上をスライドの左上隅に移動します。「マーク」をクリックします。右下隅に同じことを行います。
        注: この手順の delimitates イメージング (LP イメージング) 4 X; 低消費電力のエリアまぁシリーズのすべてのサンプルを囲むようマークを配置する注意してください。
      12. 高出力 (馬力) イメージング、次を実行します。
      13. 「オート フォーカス」の下で「DAPI」を選択します。
      14. '買収' バンドの下「DAPI」、「FITC」、"Cy3"および「Cy5」を選択します。「OK」をクリックします。メニュー バーで、"プロトコル"保存「ファイル」をクリックします。
    2. スライドをスキャンします。
      1. 「負荷プロトコル」メニューバーから「ファイル」をクリックして、プロトコル ロードします。「スタート」をクリックします。
      2. 「ラボ ID」(画像保存用フォルダーの場所) を入力します。スライド、スライドを識別する ID を入力します。「次へ」をクリックしてします。
      3. (明視野照明の下で全体のスライドをスキャン、4 x の目的を使用して連続画像を取得し)」モノクロ画像」をクリックします。
        注: これは、スライドのグレースケールの概要を生成します。
      4. 「標本を検索する」をクリックしてします。(4 x) の低解像度でスキャンする組織の領域を選択:「Ctrl」キーを押しながら選択を解除します (図 2 a) のフィールドにカーソルを使用してフィールドをクリックしますします。
      5. 各フィールド蛍光レッド ブルー グリーン画像の獲得のため「LP イメージング」(画像 × 4) をクリックします。
      6. HP フィールド選択、「Ctrl」キーを押しながら、選択または選択解除 (20 倍) の高解像度でスキャンする組織の領域に対応するフィールドにカーソルを使用してフィールドをクリックして。5 フィールド (図 2 b) を選択します。
      7. マルチ スペクトル画像の獲得は各フィールド (図 2) には、「HP イメージング」(画像 × 20) をクリックしてください。
      8. LabID で初めに選択したフォルダーに画像を格納する「データ ストレージ」をクリックしてします。
        注: プロセスの要約は、図 2に示します。(組織の検出、フィールド選択) ステップごとにアルゴリズムをインクリメントし、全自動スキャン プロセスのユーザーによって訓練できます。
  2. 蛍光画像解析、連成解析ソフトウェアを数える自動セル
    1. スペクトル ライブラリをビルドします。
      1. 画像解析ソフトウェアを開きます。
      2. 左のパネルでは、「ビルド ライブラリ」を開きます。'ロード イメージ、[「ブラウズ」をクリックし、(例えばCD8/シアニン 5) 1 つのモノラルで汚れたイメージを選択します。
      3. 蛍光体、(例えばシアニン 5) を選択します。「抽出」をクリックします。ライブラリに格納するには「保存」をクリックします。「保存」をクリックします。
      4. PD - 1、同じプロセスを繰り返すティム-3、および関心の各 fluorophore のスペクトルを統合するために DAPI モノラル染色スライド。
        注: 各 fluorophore (ここで腎臓)、特定の組織の使用のためのスペクトルを統合スペクトル ライブラリをビルドするが、既に存在する「合成」のライブラリを使用できます。蛍光スペクトルは厳密に組織を基準にして、1 つの自己蛍光とプロジェクトごとのスペクトル ライブラリを実行することが重要です。
    2. 新しいプロジェクトを作成します。
      1. メニューバーから「ファイル」「新規プロジェクト」をクリックします。「検索機能」タブの「セルの分割」を選択します。'表現' タブで「表現」を選択します。「作成」をクリックします。
      2. プロジェクトの代表的なイメージを統合します。
        1. 「ファイル」タブで「画像を開く」をクリックしてします。シリーズ全体の 10 〜 30 の代表的なイメージを選択します。蛍光を削除する非染色スライドを追加します。右のパネル: 選択ライブラリのソース。Fluorophore を選択し、以前に作成したスペクトル ライブラリに対応するものを選択します。
      3. 組織の自家蛍光を削除するには、「AF ボタン」をクリックし、白紙のスライドに蛍光の領域を選択します。
      4. 画像処理、合成画像。
        1. 合成画像 (図 3) を生成する蛍光スペクトルと蛍光ライブラリを統合する「すべて準備」をクリックしてします。[ビュー エディター] パネルを開き、表示されるデータを選択する '目' アイコンをクリックして: マーカー CD8 を選択、PD 1、ティム-3、および DAPI。自発蛍光を削除します。ソフトウェアによって提示される手順に従います。
      5. セルを分割します。
        1. 、コンパートメント内のセルを分割するには、「核」と「膜」を選択します。「核」タブでは、核の対比染色として DAPI を設定します。
        2. '最大値と最小サイズ (px)'] タブで「40」と「176」最小と最大のサイズとそれぞれ入力します。'最小' 信号「0.13」に設定します。「分割」タブでは、"2.60"を設定します。「核」タブで「0.81"を設定します。「セグメンテーションを支援するために膜の信号を使用する」を選択します。
        3. 画面の最下部に「細胞の分割」をクリックします。核の領域分割と細胞膜を確認セルの DAPI と膜の蛍光を一致しない場合別のパラメーターで再試行してください。
          注: ソフトウェアは、核の DAPI 染色とセル サイズに基づいて、セルを認識します。プロジェクトによるとセルのパラメーター (サイズ, 分割, ピクセル) を調整します。
      6. 形質細胞。
        1. '表現' タブで「追加」をクリックします。細胞表現型カテゴリを作成: CD8 (青い点)/CD8-PD-1 (赤い点)/CD8-PD-1-ティム-3 (緑の点)/その他 (ブラック ドット) (図 4)。
        2. 各カテゴリのセルの以上 5 つの例を選択します。「分類子を列車」をクリックしてします。
          注: これはソフトウェアによって統計分類アルゴリズムを生成します。
        3. 各セルの表現型を取得する「すべて表現」をクリックしてします。
          注: ソフトウェアは精度の信頼区間 (CI) と 1 つのセルの表現型を提供します。
        4. 目と自動カウントの違いが一致するまで、ソフトウェアの学習によってアルゴリズムの改善 (エラー < 5%)。興味のセルの許容される CI を選択します。
          注: 許容として 55 %ci に基づいてトレーニングをしました。
      7. アルゴリズムとプロジェクトを保存します。
      8. 'ファイル' の下で「プロジェクト」を選択します。名前し、「保存」をクリックします。
    3. シリーズのバッチ分析を実行します。
      1. 「バッチ分析」を選択します。プロジェクトを選択します。分析するイメージを追加します。データ用のストレージのフォルダーを選択します。「実行」をクリックします。合成する画像の品質を確認します。シリーズのすべてのイメージの表現を確認します。
        注: 結合型イメージ解析ソフトウェアは、すべての細胞コンパートメント (膜、細胞質、核) 信号を統合します。アルゴリズムのトレーニングは、時間のかかる手順をすることができますにもかかわらず、表現型解析のステップは重要です。各画像のすべてのデータが 1 つの .txt ファイルで。(特にその表現型 CI で与えられる) 1 つのセルのすべてのデータは、1 つの行です。各スライドの画像の獲得およびそれに続くカウント 5 のフィールドに行った。
  3. 自動細胞数の発生と生データの統合
    1. 統計プログラムを使用してデータを計算します。
      1. 1 人の患者の分析 5 フィールドに対応する 5 枚の画像からすべてのデータを計算します。統計のプラットフォームを使用し、経験豊富な統計学者、データ マネージャー、または分析を行うデータの科学者があります。自動的に彼らの表現型、CI > 55% を選択することによって細胞をカウントするスクリプトを構築します。
      2. シリーズのすべての .txt ファイルを同じフォルダーに置きます。
    2. データを抽出します。
      1. すべての .txt ファイルを 1 つのフォルダーに入れてください。3.3.1 の手順で構築された自動スクリプトを実行します。R スクリプトによって生成される出力の .csv ファイルを開きます。.Xl 形式として保存します。出力は、各患者のため (すなわち、cd8 陽性だけで、CD8 PD 1、CD8 PD 1 ティム 3) それぞれの表現型のための細胞の数を収集します。
      2. フィールドごとのそれぞれの患者の細胞の平均数を計算する: フィールドごとのそれぞれの患者の細胞数を正規化する (すなわち5) フィールドの数ごとのセルの数で割ります。
      3. PD 1+合計 cd8 陽性細胞の割合を計算する+ T 細胞、そして合計 CD8 間 PD 1+ティム-3+細胞+ T 細胞。この手順の概要は、図 5を参照してください。
        メモ: R 言語 (または選択した他のプログラミング ソフトウェア) が正しく作成し、コマンドを実行する必要、経験豊富なユーザーまたは統計/データの科学者が不可欠ですので。R プログラムは同じ患者のデータを計算することができますが、一人の患者の 5 つの .txt ファイルの名前は同一の先頭、患者の意識に対応するはず。
  4. 統計解析
    1. 結果の統計分析のための統計ソフトウェアを使用します。
    2. 統計学者の助けを借りて、適切な統計分析を行います。
      1. 使用非パラメトリック Wilcoxon ランク 2 つの細胞の表現型 (図 6) の PD 1 MFI の比較テストに署名しました。ピアソンのカイ二乗検定共変量と組織学的特徴を関連付けます。
      2. 無増悪生存期間と全生存率、無病生存率などのイベント時に成果を共変量効果を推定するのにコックス回帰モデルを推定するのにカプラン ・ マイヤー法を使用します。
      3. Pを検討-重要である 0.05 よりも低い値です。

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結果

腫瘍 CD8 を定量化する上で説明した一般的なプロトコルを使用して、目的とする患者、RCC と臨床転帰25結果を関連付けることから凍結するティッシュでの PD 1 とティム 3 抑制性受容体の共発現細胞の+ T。

CD8/PD-1/ティム-3 染色の最適化:

抗?...

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ディスカッション

変更とトラブルシューティング:

組織の品質は重要なパラメーターです。ヘマトキシリンとエオシンの着色によって簡単にチェックできます。

技術の利点の 1 つは多重染色の可能性が、fluorophore の波及を避けるためには、発振波長 10 nm 以上のデルタを選択することお勧めします。ここでは、4 染色 DAPI を含むので、我々 は波長を広げて?...

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開示事項

すべての著者は宣言する利害の対立があります。

謝辞

この作品は、Institut 国立デュがん (インカ) (ET)、リーグ contre le がん (ET)、大学ソルボンヌ大学パリ ・ シテ (ET)、ANR (Selectimmunco) (ET)、Labex 免疫腫瘍 (ET)、SIRIC CARPEM (CG, ET) からの助成金によって支えられました。EdG 財団アークの交わりによって資金を供給されました。EV と CD APHP (bourse 極東凝った) の団体によって資金を供給されました。ChB 大学ソルボンヌ大学パリ シテ (契博士) の交わりによって資金を供給します。著者は、このプロジェクトの資金調達のためのブリストル マイヤーズ スクイブをありがとうございます。著者は、病理学の病院位置ジョルジュポンピドーとネッカー (Laurianne シャンボール、エロディ ミシェルとジゼル Legall) の部門をありがとうございます。著者は、PARCC 病院位置ジョルジュ ・ ポンピドゥー (コリーヌ クリスチアーネ) の組織のプラットフォームをありがとうございます。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Vectra 3 Automated Quantitative Pathology Imaging Perkin ElmerCLS142338
inForm cell analysis 2.1.Perkin ElmerCLS135781
R softwarehttps://www.r-project.org
Dakopen delimiting penDakoS2002
Tris Buffer Salin TBS TabletsTakara, Bio Inc.TAKT9141ZpH7.6 100 tablet
Tris Buffer Salin Tween 20 TBS(+Tween20)Takara, Bio Inc.TAKT9142ZpH 7.6 100 tablets
Biotin blocking systemDakoX0590Avidin 0.1% and Biotin 0.01%
normal donkey serumJackson Immunoresearch017-000-0015% vol./vol. concentration
Fluoroshield with DAPISigma-aldrichF60571.5 µg/mL concentration
Knittel glass coverslipKnittel Gläser,10003924x60 mm 100 cover slips
Rabbit anti-CD8 Clone P17-VnovusNBP1-79055use at 4µg/mL
Mouse anti-PD-1 Clone NATabcamab52587use at 2 µg/mL
Goat anti-Tim-3R&DAF2365use at 3 µg/mL
Rabbit anti-PD-L1 Clone SP142Roche7309457001use at 1 µg/mL
Mouse AF647 labeled pan- Keratin Clone C11Cell Signalling4528use at 0.5 µg/mL
Goat anti-human gal9R&DAF2045use at 0.3 µg/mL
Cyan 5 conjugated donkey anti-rabbitJackson Immunoresearch711-175-152use at 5 µg/mL
Biotinylated F(ab’2) donkey anti-mouse IgGJackson Immunoresearch715-066-150use at 3 µg/mL
Alexa Fluor488 conjugated donkey anti-goat IgGabcamab150133use at 5 µg/mL
Cy3 labeled streptavidinAmershamPA43001use at 3 µg/mL
negative control mouse IgG1DakoX0931use at 2 µg/mL
IgG from goat serumSigma-aldrichI5256use at 3 µg/mL
IgG from rabbit serumSigma-aldrichI5006use at 4µg/mL

参考文献

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