化学の活用方法を使用して E 型肝炎ウイルスのナノ粒子の表面化学

要約

我々 は、theranostic ナノ粒子 (HEVNP) として肝炎 E のウイルスのカプシド蛋白を設計しました。HEVNP 自己粘膜配信で安定した正二十面体のケージにアセンブルします。ここでは、表面に露出したシステインは、とりわけ腫瘍細胞を結合する配位子の合成を共役残基の変異を対象とした腫瘍に対する HEVNPs の変更について述べる。

要約

ウイルス様粒子 (群集) は、外国のエピトープを表示および/または小さな分子の検出と様々 な病気の治療を提供するナノキャリアとして使用されています。遺伝子組み換えは、自己組織化でこのアプリケーションが依存しているし、組換え群集の腫瘍を対象としたアプリケーションを満たすためにシステイン抱合に比べ遺伝的群集に外国のペプチッドの変更だけでも、化学の活用を提供しています、重要な利点の合成ペプチドやオリゴ糖、VLP アセンブリの変更することがなく、変調かつ柔軟に群集の表面に共役するためなどのエンティティの様々 なをことができますので。

ここでは、多機能配信キャリアとして肝炎 E ウイルス粒子 (HEVNP)、モジュール化された theranostic カプセルを使用する方法を示します。HEVNPs の機能には、組織を対象とした、イメージング、および治療薬デリバリーが含まれます。HEVNP の確立の構造調査に基づき、構造的に独立して表面に露出した残基は、チオール選択的リンケージを介してマレイミド リンク化学グループの活用サイトとしてシステイン置換に選ばれました。1 つの特定のシステイン変更 HEVNP (573 アスパラギン システイン交換 aa (HEVNP-573 C)) は乳房がん細胞特異リガンド、LXY30 共役し、近赤外線 (NIR) 蛍光色素 (Cy5.5) 腫瘍ターゲットのレンダリングにラベル付け効果的な診断カプセル (LXY30-HEVNP-Cy5.5) として HEVNPs。Theranostic 配信への応用可能性を探索するよく知られている原子の構造を持つ他の高分子複合体と同様のエンジニア リング戦略を採用できます。

概要

治療および診断の配信、nanotheranostics、として知られているナノサイズのベクターの開発は、ターゲットを絞った配信¹に向かって一般的な治療から生物医学分野の多くをシフトしています。Theranostic 分子安定的に特定の病気にかかったティッシュまたは生化学的経路^{2,3,4 theranostic 分子を直接にターゲットを絞った nanotheranostic 配信統合ナノサイズ ベクトル (ナノ粒子)}.ナノメディシンは、最適なサイズのナノ粒子 theranostic 分子の循環を安定し、病気にかかったティッシュの提示細胞表面分子を選択的にターゲットする能力を持っているので、ターゲットを絞った配信の最前線に来ています。まだ多くの nanotheranostic プラットフォーム パッシブ セル吸収, 事前に成熟し劣化、毒性、および theranostic 分子と不十分な協会に苦しみます。群集は、ターゲットを絞った配信でこれらの障害の多くを克服します。彼らは外国のエピトープを表示および/または小さい分子を提供するナノキャリアとして使用されている: 療法は多くの病気¹を戦うために使用することができます。このアプリケーションのプロパティに主に依存する特定のエンドユーザのために設計されたアプリケーションを満たすために、遺伝の修正の容易さだけでなく、自己集合。遺伝子工学と比較して、VLP に異質ペプチドの化学的活用のための重要な利点を表示多種多様なペプチドやオリゴ糖、変調の群集の表面に共役するなどのエンティティをことができますので、柔軟 VLP アセンブリの変化なし。

組換え HEV キャプシド蛋白質、2^ndオープンから派生した HEVNPs フレーム (ORF2) を読んで、非感染性、カプシド セルの結合、およびエントリの対応を自己組み立てます。粘膜感染の HEV が進化したので組み立てカプシド蛋白はプロテアーゼ、酸性の粘膜条件⁵同様に安定です。HEVNPs は、T の中空を形成レンダリング非常に安定したストレージと過酷な生理的条件の両方、ORF2 の 60 の同一ユニット^6,7から成る、1 の正二十面体キャプシドを =。任意のウイルスの遺伝的要素に欠けている、効率的、高収率生産はバキュロ ウイルス昆虫細胞発現システムによって実現されます。蛋白分解性が高く、自己組織化 HEVNPs を抽出され、細胞培養上清より精製した必要な精製工程を大幅に削減します。さらに、HEVNPs は安定した正二十面体ベースに柔軟なヒンジを介して接続されている表面の露出した突起ドメイン (P ドメイン) を所有しています。P ドメインは、融通がきく蝶番は、大幅に基本の正二十面体構造を損なうことがなく P ドメインを変更することが可能、正二十面体ベースの上に表面に露出したスパイクを形成します。化学変調 60 対称サイトで 60 の繰り返し単位、1 つのサイト固有の変更結果します。最近では、提案するナノ プラットフォーム配位子または theranostic 用小分子化学的に共役することができます HEVNP を使用して。これは、マレイミド リンク ペプチドや分子と反応サイトとして単一のアミノ酸を HEV VLP の突起ドメインのシステインに置き換えることによって達成されました。HEV VLP とよく研究免疫原性エピトープ^8,9の前の構造の分析に基づいて、次の 5 HEV VLP アミノ酸に置き換えられたシステイン潜在的な候補として: Y485C、T489C、S533C、N573C、T586C (図 1)。透過電子顕微鏡 (TEM) 観察 (図 2)、によって確認されたその VLP 形成発現と昆虫細胞から精製後、公開されているシステイン サイトは西部によって分析されたビオチンのマレイミド リンク後のしみ活用 (図 2)。5 つの変異体の間で HEVNP-573 C はマレイミド ビオチン活用 (図 2) の最も強い信号を表示され、フォロー アップ⁴ (図 3) をターゲット乳癌細胞のナノキャリアとしてデモに使用されました。

このプロトコルは、表面システイン共役を通じて腫瘍ターゲット分子を HEVNPs にアタッチする化学の活用方法を示しています。我々 は N573 でシステインを含む組換え HEVNPs と腫瘍腫瘍配信対象と検出分子の共役の詳細 (HEVNP-573 C)。ペプチド、LXY30¹⁰ HEVNPs にフォーム LXY30 HEVNP (図 4) 乳房癌腫瘍をバインドする 2 段階クリック化学接合過程に着目しました。その後、N hydroxysuccimide (NHS)-Cy5.5 いた HEVNPs を構築する LXY30 HEVNP Cy5.5 蛍光検出の両方生体外で(図 5) で別の Lys サイトに共役と体内⁴ 。

プロトコル

1 昆虫細胞で HEVNP 生産

注: すべての次の手順は、セル文化フードで行わなければなりません。詳細な HEVNP 生産手順¹¹当社前の文書を参照してください。

1. Sf9 昆虫細胞のセル 6 ウェル プレートでの 50-75% 合流するメディア (材料表を参照してください)。
2. 組換えバキュロ ウイルスを生成する Sf99 セルに HEVNP-573 C ORF2 を含む Bacmids を transfect 製造元のプロトコルによると昆虫の細胞のトランスフェクション試薬を使用する。27 ° c transfected セルをセルの実行可能性によって、3-6 日にインキュベートします。
3. (後に transfected セルは、バキュロ ウイルス感染による分離) P0 バキュロ ウイルス ストックとして感染後 3 〜 6 日で上清を収集します。
4. P0 株式の 200 μ L を 25 cm²分子フラスコの 50-75% コンフルエント Sf9 細胞に適用する前に培地を削除します。接種の完全なカバレッジを確保するためには、フラスコ 15 分毎をロックします。60 分の合計 4 回を繰り返します。
5. 昆虫の細胞培養培地 2 mL をフラスコに追加および 27 ° C で 3-6 日間より高い力価をバキュロ ウイルスを増幅する細胞によって維持します。
6. ¹²を読んでバキュロ ウイルス力価を取得するプラクの試金を遂行します。
7. 昆虫細胞用培地フラスコ 250 mL に 100 mL で懸濁 Tn5 昆虫細胞 (材料表) の培養し、0.5 x 10 の力価に 150 rpm で 27 ° C に振る⁵ - 1 x 10⁶接種のため。
8. 250 mL のフラスコで 5-10 に 100 mL Tn5 細胞のバキュロ ウイルス感染 (MOI) の多様性を追加します。接種後 5-7 日間 150 rpm で 27 ° C で横に振る。
9. 小胞を持っているようにほとんどの細胞と細胞の 70-90% は光学顕微鏡観察下で死んでいる、一度 Tn5 細胞を収集し、33 mL 遠心チューブに移します。25 ° C で 90 分 10,000 x g でバケツの回転子、バランス、および細胞の残骸や組換えバキュロ スピンダウンを振る場所、超遠心機チューブします。
10. さらに浄化のための 4 ° C でリリースされた HEVNPs を含む上清をしてください。バキュロ ウイルス上清の拡張ストレージは、プロテアーゼ阻害剤を追加します。

2. HEVNP 浄化

1. ペレットし、セシウム塩化 (CsCl) 勾配分離を使用して HEVNPs を分離できます。
   1. (ステップは 1.10) から収集した上清を転送し、20% を追加 0.5% の最終的な集中に各チューブに NP 40 NP-40 任意の残りの細胞膜を溶解します。軽くピペッティングにより混合し、25 ° C で少なくとも 30 分間インキュベート
   2. 遠心上清から HEVNPs ダウン ペレットへの 4 ° C で 2 時間バケツの回転子を振る 112,400 x g で HEVNPs。遠心分離後上澄みを廃棄し、優しく再 200 μ L の 10 mM MES バッファー pH 6.2 各管内一晩 (O/N) 4 ° C での原油のペレットを中断SDS - 52 kDa のバンドとして原油のペレットの HEVNP ORF2 の存在を確認する (ステップ 3.1) のページを実行します。
   3. 混合 1.96 g CsCl 38.5% (w/v) CsCl 勾配、再浮遊原油ペレット 5 mL 遠心チューブに 0.01 M MES pH 6.2 の 〜 4 mL を準備します。管のバランス、スイング バケツの回転子の場所します。4 ° C で 16 時間 147,000 × g で遠心
2. CsCl 勾配後分数を収集します。
   1. 主に軽量化細胞膜の破片は、トップ 500 μ L 分数を破棄します。チューブの先頭から、500 μ L の分数を収集し、各分画の間にチップの交換します。番号ラベル 1.5 mL チューブに各分画を配置します。
      注: CsCl グラデーションは SDS のページ CsCl の高濃度のためのゲルを実行することによって検出できないから画の HEVNP ORF2 の存在。各分画の CsCl を削除または CsCl のクリーンアップの手順で希釈できます。また、CsCl の勾配は、10-40% ショ糖勾配¹³ CsCl の残留を避けるために取替えることができます。
   2. 5 mL の遠心管に各画分を転送し、4.5 ml の 10 mM MES の pH 6.2 の CsCl を希釈します。管のバランス、スイング バケツの回転子の場所します。ペレット、HEVNPs ダウンへの 4 ° C で 2 時間 147,000 × g で遠心。
   3. 上澄みを廃棄し、優しく再各管内 10 mM MES pH 6.2 の 100 μ L で、HEVNPs を停止します。蒸発を避けるために、, O/N 4 ° C でチューブをカバーします。
   4. 分光光度計を用いた A260/A280 nm 比 A280 読書を記録します。として ORF2 のおおよその濃度を決定します。
      
      1 システイン サイトと化学の活用のための 1 の Lys サイトそれぞれの ORF2 が含まれます。
      注: HEVNP ORF2 のモル吸光係数は、60,280 1.019 mg/mL × A280 と同等であります。これは 1:1 に近く、A280 としたがって、上記式で ORF2 の濃度 (mg/mL) で HEVNPs の濃度を近似できるということ。1 の A280 読書と HEVNP が 1 mg/mL、18.8 μ M に相当する濃度を持っている例えば、ORF2。
   5. SDS ページを準備します。各画分から 6 μ L のサンプルを使用して、53.3 HEVNP ORF2 タンパク質 (ステップ 3.1) を含む分数を決定します。HEVNPs は、分数の 3-5、~1.25 グラム/mL の濃度で発見されるべき。
   6. 存在と tem による HEVNPs の純度を確認してください。準備または 0.5 - 2.0 mg/mL TEM の HEVNP サンプルを薄めます。TEM で空の正二十面体蛋白質、~ 27 として表示されます、HEVNPs nm の直径 (図 2)。いくつかの蛋白質の汚染物は分数で残ることがあります、TEM (ステップ 3.2) の下で観察されます。
3. 不純物が電子顕微鏡の下で存在している場合、ステップ 2.1.3 -、HEVNPs のよい純度 2.2.6 を繰り返します。
   注: CsCl 勾配によって余分な浄化 HEVNPs の歩留まり損失があります。また、CsCl 勾配浄化は残留 CsCl¹³を避けるために 10-40% ショ糖密度勾配によって置き換えることができます。

3. HEVNP の評価

1. SDS のページ 4-12% ビス トリス タンパク質ゲル、1.0 mm、ユーザーズ マニュアル¹⁴によると 17 井戸 (材料の表を参照) を準備します。
   1. 6 μ L の蛋白質のサンプルにローディングバッファー x 4 の 2 μ L を追加します。タンパク質を変性する 100 ° C で 10 分間の熱ブロックのサンプル混合物を孵化させなさい。ゲルに蛋白質のサンプルをロードします。
   2. 10 分間、45 分サンプルをゲルの下端の上約 1 cm に実行までの 150 V、100 V DC 電源アダプターを設定することにより SDS のページを実行します。
   3. Coomassie 青い (0.25% (w/v) Coomassie ブリリアント ブルー R250、30% (v/v) メタノール、酢酸 10% (v/v))、1 h の SDS ページのゲルの汚れ。
   4. 染色の手順後 Coomassie 青い汚れを削除し、蛋白質ゲルの重複染色バッファー (30% (v/v) メタノール、酢酸 10% (v/v)) を適用 > 室温で 12 時間。
   5. 52 kDa のバンドで HEVNP ORF2 の存在を確認する白色光の下でゲルを文書化します。
2. TEM を使用して HEVNPs を観察します。
   1. 準備または 0.5 - 2 mg/mL 10 mM MES pH 6.2 TEM 画像で HEVNP サンプルを薄めます。
   2. 30 40 mA グロー放電の炭素被覆グリッドをイオン化親水性炭素表面を生成する s。グロー放電装置は、材料表の説明です。
      注: グリッドの親水性炭素表面だけ最後グロー後 30 分間放出できる治療。
   3. ピンセットで保持してグリッドに HEVNP サンプルの 2 μ L を追加、15-30 秒待って、ろ紙をしみ。
   4. DdH₂0 グリッドとろ紙をしみをすぐに洗ってください。
   5. すぐにグリッド、待機 15 秒、ろ紙をしみに酢酸 2% ウランの 2 μ L を追加します。乾燥、電子に入れてサンプル グリッド除湿 O/n 乾燥キャビネット
   6. TEM および 10-80 k 倍率で画像にグリッドを転送します。HEVNPs TEM で ~ 27 である空の正二十面体蛋白質として表示されますウイルス RNA の不在のための直径の nm。

4 ビオチン、がんをターゲット リガンド、フルオロと HEVNPs の化学の活用

1. HEVNPs とリンクしたマレイミド ビオチンの 1 つのステップの活用を実行します。
   1. バッファーの変更: ミニ透析ユニットの HEVNPs を適用し、製造元のプロトコル (材料表) に従って 1 時間室温で 0.01 M PBS pH 7.4 に対して dialyze。1.5 mL チューブに、HEVNPs を転送し、280 タンパク質濃度測定分光光度計を用いた nm。
   2. 1 mg/mL、Cys 反応サイト (2.2.4 の手順で詳細を参照してください)、マレイミド ビオチン (100 μ M) を 1:5 のモル比; に 0.01 M pbs は、pH 7.4 の同量の 18.8 μ M に相当する HEVNP をミックスします。O/N を 4 ° C で反応します。製造元のプロトコル (材料表) によると 40 K MWCO スピン海水淡水化列手順を非連結したマレイミド ビオチンを削除します。
   3. SDS ページ (手順 3.1) を減らす標準的サンプルを分析します。
   4. 標準的な手順を使用して、化学発光西部のしみ HRP リンク ストレプトアビジンを使用して準備します。X 線フィルム (図 2) で発光信号をキャプチャします。
2. HEV NPs (図 5) の表面に露出したシステインに 2 つのステップ LXY30 活用を実行します。
   1. バッファー交換: ミニ透析ユニットの HEVNPs を適用、1, 1.5 mL チューブへの転送、HEVNPs の室温で 0.01 M PBS pH 7.4 に対して dialyze し、280 タンパク質濃度を測定 nm の吸光度。
   2. 200 μ M CuSO₄と 1 mM アスコルビン酸マレイミド リンク LXY30 を形成すると 0.01 M PBS pH 7.4 で 650 μ M マレイミド アジと 650 μ M アルキン LXY30¹⁰を追加 (Mal LXY30) 650 μ M で 4 ° C で混合物を O/N. インキュベートします。
   3. 1 mg/mL、Cys 反応サイトの 18.8 μ M に相当する HEVNP をミックス (2.2.4 の手順で詳細を参照)、約 10% のマル LXY30 のボリューム (650 μ M) 0.01 M PBS ph 7.4 では、モル比 1:3; するO/N を 4 ° C で反応します。
      注: Mal LXY30 の比較的高い濃度、CuSO₄など、反応の最終濃度が減少します。 約 10 倍 HEVNPs への損傷を防ぐため、混合した後。別のオプションは、Cu 無料活用法¹⁵。
   4. 削除したマレイミド-クリック-LXY30 製造元のプロトコルによると 40 K MWCO スピン脱塩カラムを非連結 (材料表を参照してください)。4 ° C で LXY30 リンク HEVNPs (LXY30-HEVNPs) を維持します。
3. LXY30 HEVNPs や Cy5.5 NHS エステル (NHS Cy5.5) の 1 つのステップ活用を実行します。
   1. ミックス 1 mg/mL、Cys 反応サイトの 18.8 μ M に相当する LXY30 リンク HEVNPs (LXY30-HEVNPs) (2.2.4 の手順で詳細を参照)、NHS Cy5.5 の等量を (100 μ M) 0.01 M PBS ph 7.4 に 1:5 モル比;O/N を 4 ° C で反応します。
   2. 削除は製造元のプロトコルによると 40 K MWCO スピン脱塩カラム プロシージャ Cy5.5 NHS を非連結 (材料表を参照してください)。4 ° C で LXY30、Cy5.5 リンク HEVNPs (LXY30-HEVNP-Cy5.5) を維持します。

5 HEVNP へのバインディングと MDA MB231 乳癌細胞に内在

1. シード MDA MB231 乳癌細胞に 35 ミリメートルのガラス底皿 (皿あたり 5 × 10⁴ ) 哺乳類の細胞培養のキャビネットの O/N。
2. セルの結合実験のため次の手順 4.2 4.3 LXY30 HEVNP Cy5.5 を準備します。0.01 mg/mL、HEVNP ORF2 の 0.188 μ M に相当する LXY30 HEVNP Cy5.5 を希釈 (ステップ 2.2.4 を参照してください)、0 - 250 μ L で 1 %fbs/DMEM。
   1. NHS Cy5.5 色素のみ (HEV Cy5.5) 共役ですが、手順 4.3 HEVNP Cy5.5 の 0.01 mg を mL で否定的な制御サンプルを準備します。0.01 mg/mL、HEVNP ORF2 の 0.188 μ M に相当する HEVNP Cy5.5 を希釈 (ステップ 2.2.4 を参照)、10% の 250 μ L の FBS 添加 DMEM。
3. 1 M PBS バッファー pH 7.4 の 250 μ L を適用することによって細胞を一度洗います。細胞培養ディッシュである一部のバッファーを維持しながら、洗浄後 PBS バッファーを削除します。
4. 250 μ L LXY30 HEVNP Cy5.5 の FBS 添加 DMEM または HEVNP Cy5.5 FBS 添加 DMEM 培養 MDA MB231 乳癌細胞に 10% の 10% を適用します。シールド セルは、アルミ箔で光から料理を培養しました。
5. キャビネット内部の 1 h の 37 ° C の細胞培養の細胞培養皿をしてください。
6. 3 回、1 M PBS、pH 7.4 の 250 μ L での洗浄あたり 5 分氷の上培養細胞を洗います。
7. 4% のセルを修復する pbs は 1 M、1 M PBS、pH 7.4 の 250 μ L で 1 回 20 分、洗いの pH 7.4 PFA。
   注: セルは、共焦点顕微鏡によるイメージを作成する準備が整いました。代表的なデータは、図 5のとおりです。

結果

HEV-群集に似ているすべて形成 HEVNPs 可溶性正二十面体のカプシドを変更し、したソリューションの製造及び精製中に集計はありません。シングル ステップ マレイミド ビオチン活用、Cys の各変更の前後に HEVNPs は否定的な汚れの EM (図 2) で HEV 群集から区別されました。マレイミド ビオチン活用効率 Cys 修正 HEVNPs 最初化学発光ストレプトアビジ...

ディスカッション

週間かかる、時間がかかる遺伝子工学プロシージャと対照をなしてここに示す簡単な 2 ステップとリガンドをターゲット癌を追加する、3 日間内に完了できるワンステップ化学の活用手順や蛍光検出色素 HEVNPs のシステイン/リスのサイトへ。テクニックを使用することができます候補者のプール、したがって合理的なコストと配信時に利用可能なペプチド/小分子合成サービスの活用から最高?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
MINI Dialysis Units, 10K MWCO	Thermo Fisher Scientific	69572	mini dialysis unit
High Five Cells	Thermo Fisher Scientific	B85502	Tn5 cells
SF9 Cells	Thermo Fisher Scientific	11496015	Sf9 cells
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System	Thermo Fisher Scientific	A11101, A11100	Baculovirus expression system
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System	Life Technologies	10359-016, 10360-014, 10584-027, 10712-024	Bacmid
ESF921 Insect Cell Media	Expression Systems LLC	96-001-01	insect cell media
Cy5.5 NHS ester, 5mg	Lumiprobe Corp	27020	Cy5.5 NHS ester
Zeba Spin Desalting Columns, 40K MWCO, 0.5 mL	Thermo Scientific	87766	spin desalting column
MES Hydrate	Sigma-Aldrich Chemical Co	M8250-250G	MES
Ultra-Clear Centrifuge Thinwall Ultra-Centrifuge Tubes	Beckman Coulter, Inc	Depends on Rotor	ultracentrifuge tube
NuPage 4-12% Bis-Tris Protein Gels	Thermo Fisher Scientific	NPO321BOX	SDS protein gel
Cellfectin II Reagent	Thermo Fisher Scientific	10362100	transfection reagent
EMS Glow Discharger	Electron Microscopy Science		glow discharger