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要約

封入体、ミリグラム単位の微量のタンパク質を生成するための精製からカンピロバクター走 Tlp3 の dCACHE ペリプラズム リガンド結合ドメインの巻き戻しプロシージャが表示されます。

要約

化学受容器とリガンド特異性の分子基盤の解明を目指した構造研究の天然リガンドの同定は、大きく純粋な折り畳まれたリガンド結合ドメインの少量の生産によって容易にできます。クローン細菌エシェリヒア属大腸菌(E. 大腸菌) 化学受容器のペリプラズム リガンド結合ドメインをよく表現しようと封入体に彼らをターゲットに発生します。ここでは、封入体、そのリフォールディング、例としてカンピロバクター (c) 受容体 Tlp3 のペリプラズム dCACHE リガンド結合ドメインを用いた精製からタンパク質の回収の手法を提案します。アプローチを含む、劈開を持つ興味の蛋白質の表現彼の6-タグ、分離および尿素を介した脱色封入体タンパク質アフィニ ティー ・ クロマトグラフィーによる尿素の枯渇及び精製リフォールディングタグの取り外しとサイズ排除クロマトグラフィーが続きます。円偏光二色性分光は、純粋な蛋白質の折られた状態を確認する使用されます。このプロトコルは一般的に水溶性と crystallisable フォームで他の細菌の化学受容器の dCACHE ペリプラズム リガンド結合ドメインの少量の生産に有用なそれが実証されています。

概要

細菌の植民地化とホスト1,2,3の侵略を促進することによりカンピロバクターの病因に重要な役割を再生する走化性と運動性が示されています。走化性化学信号によって導かれて細菌の成長のための最適な環境に向かって移動することができます。このプロセスには、化学受容器と呼ばれるタンパク質や探触子のようなタンパク質 (Tlps) のセットによって細胞内および環境化学手掛かりの認識が含まれます。ほとんどの化学受容器は、表層のリガンド結合ドメイン (LBD)、膜貫通ドメインと細胞質信号ドメインの信号を転送する細胞内シグナル伝達蛋白質との相互作用を持つタンパク質を膜に埋め込まれて5,4,76,べん毛モーター。

11 の異なる化学受容器はcゲノム4,8で識別されています。これらの化学受容器の一部だけが特徴づけられているまでと Tlp1113 Tlp712Tlp411Tlp310,11Tlp19のリガンド特異性が知られています。この種の残りの化学受容器と他の細菌の多数の化学受容器の天然リガンドの同定が折り畳まれた、非常に純粋な組換え受容体リガンド14,の生産によって大幅に促進すること15,16しますただし、クローンエシェリヒア属大腸菌細菌化学受容器のペリプラズム リガンドをよく表現しようと封入体17,18,19 に彼らをターゲットに発生。.それにもかかわらず、この現象ことができます簡単に分離とリカバリを実現タンパク質の手に。ここでは、封入体からのタンパク質の回収、リフォールディングと例としてc受容体 Tlp3 のペリプラズム LBD を使用して浄化手法を提案します。この例は、Tlp3 LBD dCACHE 家族20の 2 成分ヒスチジンのキナーゼおよび原核生物20,21,の化学受容器に豊富ある検出ドメインに属するために選ばれました。22,23。

このアプローチで pET151/D ・ TOPO ベクトルに基づいた表現の構成要素は、彼の6N ターミナルを組み込む設計されています-タグの直後にタバコによってエッチング ウイルス (TEV) プロテアーゼ胸の谷間サイト、その後タグ除去19。プロトコルでは、封入体のタンパク質リフォールディング尿素減少によって尿素による脱色、分離大腸菌タンパク質発現について説明します。次のリフォールディング、サンプルは、オプションのタグ除去とサイズ排除クロマトグラフィーとのアフィニ ティー ・ クロマトグラフィーによって浄化されます。浄化された蛋白質の折られた状態を確認するには、円偏光二色性分光法を用いた.これは、以前異種受容体、ピロリ菌TlpC19の LBD を浄化し、回復に培われたメソッドの修正版です。この手順は、図 1の要約の蛋白質の純度と純粋なタグなし Tlp3 LBD 細菌文化、1 L あたりの 10-20 mg を得られます > SDS-PAGE により見積もられた 90%。

プロトコル

1. 彼の6の式-Tlp3-大腸菌の LBD

  1. BL21 のコドン-プラス (DE3) と 50 μ g mL-1アンピシリンを含む滅菌ルリア ベルターニカミラ (LB) スープ 150 mL を接種すると彼の6の式の pET151/D ・ TOPO ベクトル変換 RIPL 細胞 - Tlp3-LBD (アミノ酸残基 42-291) と孵化させなさいそれ (軌道直径 25 mm) シェーカーの 37 ° C で 200 rpm で一晩。
  2. 流体培養基 LB の滅菌と 50 μ g mL-1アンピシリンの 800 mL を含む六つの 2 L エルレンマイヤー フラスコを準備します。各ステップ 1.1 から取得された一晩文化の 20 mL のフラスコを接種します。600 nm に達すると 0.6 の光学濃度まで 200 rpm で連続的な揺れで 37 ° C でそれらを孵化させなさい。
  3. フラスコ (未誘導コントロール サンプル)、ベンチトップ遠心分離機 (13,000 x g, 4 ° C, 10 分) を用いたペレットの 1 つから 1 mL を分注取るし、上澄みを廃棄します。後続の SDS-PAGE 解析のための-20 ° C で細菌のペレットを格納します。
  4. 文化と各フラスコにイソプロピル β-D-thiogalactoside (IPTG) の 1 ミリメートルを追加することでタンパク質の発現を誘導します。さらに 4 時間 200 rpm でシェーカーの 37 ° C でフラスコ培養を続けます。
  5. 4 ° C で 15 分間 5,000 × g で遠心分離によって細胞を収穫し、上澄みを廃棄します。
    注: この時点で、プロシージャを一時停止できる細胞ペレットをストレージの-80 ° C のフリーザーに置くことによって。

2. 分離と封入体の変性

  1. 250 mL のビーカーに手順 1.5 で取得したすべての細胞ペレットを転送し、100 mL のバッファー A (10 mM トリス-HCl、pH 8.0、150 mM の NaCl) を追加.細胞は、完全に (冷凍) 場合を解凍して、ペレットを再懸濁します。特に指定しない限り、氷のサンプルを保ちます。
  2. 細胞を溶解し、完全なゲノム DNA のせん断を確認高圧 homogeniser を再懸濁細胞 3 回を渡します。
  3. ライセートの 4 ° C で 15 分間、10,000 × g で遠心分離します。上清 (可溶性画分) の 1 mL サンプルを収集し、後続の SDS-PAGE 解析のための-20 ° C で保存します。上澄みの残りの部分を破棄し、氷の上、ペレットを配置します。
    注: このペレットは色が白い (ブラウンのシェードは、切れ目のない細胞から区別しやすい色で) 封入体が含まれていると。
  4. 20 mL の氷冷バッファー B で徹底的に封入体ペレットを再懸濁します (10 mM トリス塩酸 pH 8.0、0.2 mM phenylmethanesulfonyl フッ化物 (PMSF) 1% トリトン X-100)。膜と膜タンパク質の脱色が容易になります。巻き上がりを支援するために 1-2 分の渦。
  5. 4 ° C で 15 分間 10,000 x g でサンプルを遠心分離し、上澄みを廃棄します。
  6. ボルテックス 1-2 分、ペレットが小さな断片に分割されることを確認のためチューブで 20 mL の氷冷バッファー B に徹底的にペレットを再懸濁します。ペレットの再懸濁のため上下にサンプルをピペットで移しなさい。
    注: 封入体の不純物から無料を取得徹底的にペレットを再懸濁しますに重要です。
  7. 手順 2.5 を繰り返します。上清が曇りまたは色の場合 2.6 と上清まで (順番) 2.5 手順はクリアで無色。
  8. ボルテックス チューブに 1-2 分 (10 mM トリス塩酸 pH 8.0、0.2 mM PMSF) 20 mL の氷冷バッファー C でペレットを再懸濁します。
  9. 手順 2.5 を繰り返します。
  10. 25 mL の冷たい変性バッファー D (10 mM トリス塩酸 pH 8.0、8 M 尿素 10 mM ジチオトレイトール (DTT) 0.2 mM PMSF) 封入体ペレットを溶解するを追加します。ボルテックス 1 〜 2 分、またはペレットが小さな部分に分割するまで徹底的に再懸濁します。
  11. ミックス 4 ° C で 30-120 分の間 30 rpm の回転速度と軸の回転によって懸濁液
  12. 30,000 × g、30 分のための 4 ° C での遠心分離によって変性蛋白質の解決を明らかにする、氷の上清を配置し、ペレットを破棄します。
  13. ブラッドフォードの試金を使用して蛋白質の集中を測定します。24 SDS ゲルの分析の因数を取るし、-20 ° C に配置
    注: この時点で、手順スナップ凍結検体サンプルを液体窒素中で一時停止できる、ストレージの-80 ° C でそれを維持します。

3. 蛋白質のリフォールディング

  1. 250 ml のバッファー E (3 M 尿素 100 mM トリス塩酸 pH 8.0、0.4 M L-アルギニン塩酸塩、20 mM 減少 L-グルタチオン、2 mM 酸化型グルタチオン) 500 mL ビーカーに、4 ° C までバッファーをクール
  2. 彼の6を含む変性タンパク質ミックス 60 mg を追加-Tlp3-LBD がバッファーを 500 rpm で攪拌しながら 2.13 に 250 mL のバッファー E の手順で取得します。24-48 h の 500 rpm で連続攪拌しながら 4 ° C のリフォールディング ミックスを孵化させなさい。この手順で最終的なタンパク質濃度が 0.2 mg mL-1です。
  3. 8-10 L バケツにバッファー A の 7 L を準備し、24-48 h で行われる次のステップ (ステップ 3.4) の準備で 4 ° C まで冷却 (図 1のフローチャートを参照してください)。
  4. 28 mm 膨張した径 10 mM エチレンジアミン四酸ナトリウム塩 (EDTA Na2) 200 mL に 12-14 kDa の分子量カットオフの透析チューブの ~ 50 cm の部分を浸すし、ガスの炎で沸騰するまで加熱します。リンス 200 ml ddH2o. の透析膜
  5. 透析チューブ閉鎖と透析膜の一方の端をクランプし、250 mL の透析チューブに 3.2 で得られる混合物のリフォールディングを転送します。別のクランプの開放端を閉じます。漏れがないことを確認するための膜の整合性を確認します。
  6. 3.3 準備したバッファー A の予冷 7 L の透析バケツに透析チューブを配置します。電磁攪拌棒、攪拌しながら透析チューブに接触しないことを確保するに配置します。
  7. 500 rpm で攪拌を続けると 4 ° C でサンプルを透析しなさい、少なくとも 4 回 12 時間の期間にわたってバッファーを変更します。最後のバッファーの変更後に一晩を透析しなさいサンプルをまま。
    注意: 透析中にフォールディングする蛋白質を可能にする変性タンパク質溶液からは徐々 に尿素 (~ 3 M) の超過分は削除します。重い蛋白質の沈殿物は、透析の終わりに観察できます。
  8. バケツから透析チューブを外し、500 mL ビーカーにその内容を転送します。別段、氷上では、蛋白質溶液を維持します。
  9. 任意の沈殿したタンパク質を削除する 500 mL ガラス瓶の中に 0.43 μ m 孔サイズの膜を通して蛋白質の解決をフィルターします。

彼の6の清浄化・固定化金属イオンアフィニ ティー ・ クロマトグラフィーを使用して蛋白質のタグ

  1. 充電し、5 mL プレパックド キレート列を平衡します。
    1. 蠕動性ポンプ、接続チューブに閉じ込められた空気がないことを確保するため列に接続します。
    2. DdH2o. の 25-50 mL を介して渡すことによって列を洗う
    3. 0.1 M NiCl2の 3 mL を読み込んで、ddH2o. の 25 mL を通過して列を充電します。
    4. バッファー F (読み込みバッファー、20 mM トリス塩酸 pH 8.0、500 mM の NaCl、20 mM のイミダゾール) 25 mL でコラムを平衡させ。
  2. 1 M トリス-HCl pH 8.0、25 mL の 5 M の NaCl と 2 M イミダゾール溶液 2.5 mL 2.5 mL を追加することによってバッファー F の組成に 3.9 手順で取得したリフォールディングモモルチャリンの蛋白質のサンプルを調整します。
  3. (自由な蛋白質) 率を 5 mL/min 以下で流れを破棄する列にサンプルをロードします。
  4. 50-100 mL のバッファー F 非具体的バインドされたタンパク質を取り除き流れを破棄を洗い流します。
  5. 溶出が彼の6-Tlp3-25 mL のバッファー G (溶出バッファー、トリス-HCl、20 mM 500 mM, 500 mM のイミダゾールの塩化ナトリウム) と LBD (ブラッドフォード試薬を使用してによって決まります)、蛋白質を含んでいるフロースルー分数をプール。
  6. ブラッドフォードの試金を使用してプールのサンプルの蛋白質の集中を測定します。小さなの SDS-PAGE 解析の-20 ° C の場所因数を取る

5. 彼の6-タグの除去 TEV プロテアーゼ (オプション) を使用して

  1. 準備、バッファー H (TEV 胸の谷間バッファー、10 mM トリス塩酸 pH 8.0、150 mM の NaCl, 1% (v/v) グリセロール、2 mM DTT) 4 L 4 ° C に冷却し、なさい。
  2. 透析チューブの約 5-7 cm カット (直径 2 ~ 3 cm) ddH2o. の 200 mL に浸し、
  3. 彼の6を追加-彼 TEV プロテアーゼをタグ付き6-1 TEV 最終的なモル比 4.5 の手順で作製したタグ タンパク質: 8 蛋白質。
  4. 透析チューブ閉鎖チューブの一方の端をクランプし、タンパク質/TEV プロテアーゼ混合物でそれを埋めます。もう一方の端を閉じて、漏れがないことを確認します。
  5. 透析 (ステップ 5.1) のバッファー時間の予冷 4 L にチューブし、連続 4 ° C の孵化場所 2 h. 変更バッファーの攪拌と完了する TEV を介した開裂反応できるように一晩透析を続けます。
  6. 一方で、準備し、クール (4 ° C) 4 L バッファーの (10 mM トリス塩酸 pH 8.0、150 mM の NaCl, 1% (v/v) グリセロール) 次の日の準備のために。
  7. オーバー ナイト透析後手順 5.6 で覚悟のバッファーにバッファーを交換し、4 ° C でさらに 1-2 時間を透析しなさい
  8. 透析バケツからチューブを削除、チューブの一方の端を外すし、タンパク質溶液を 50 mL ファルコン チューブに転送します。0.43 μ m 孔サイズのシリンジ フィルターを通してソリューションをフィルター特に明記しない限り、氷の上保管してください。
  9. サンプルの体積を測定し、バッファー F の組成にトリス, 塩化ナトリウム, イミダゾールの集中を調整 (例:バッファー J でタンパク質溶液の 25 ml を追加する 1 M トリス-HCl pH 8.0, 5 の M の NaCl の 1.75 mL 0.25 mL と 2 M イミダゾールの 0.25 mL)。
  10. 手順 4.1 で説明した 5 mL HiTrap キレート HP 列を準備します。
  11. 列にサンプルをロード (流量: 5 mL/分) し、フロースルー、タグなしの Tlp3 LBD (42-291 残基) が含まれている収集します。分解されていないたんぱく質、劈開、彼の6-タグと彼の6- TEV は、列で保持されます。
  12. 洗い流す 5 mL バッファー F (読み込みバッファー) を通過し、溶出液を収集するすべてのタグなしタンパク質を許可します。
  13. プール、溶出液は 5.11 と 5.12 の手順で取得した、タンパク質の濃度を測定します。小さな因数を取るし、SDS-PAGE 解析のための-20 ° C で保存します。

6 Tlp3 LBD のサイズ排除クロマトグラフィー (ゲル濾過)

  1. バッファー A の 1 L (10 mM トリス塩酸 pH 8.0、150 mM の NaCl) を準備し、0.43 μ m の膜を使ってフィルター処理します。
  2. 4 mL/min の流速でバッファー A 26/60 サイズ排除カラムを平衡します。
  3. 手順 5.13 15 mL 遠心濃縮器を用いた 10 kDa カットオフ (4 ° C、4,000 x g) 3-4 mL の量で得られる蛋白質のサンプルを集中します。
  4. 13,000 × g、任意の沈殿したタンパク質を削除する 30 分のための 4 ° C での遠心分離によって蛋白質の解決を明らかにします。
  5. 事前釣合い 26/60 ゲルろ過クロマトグラフィにサンプルをロードします。モニター UV トレース 4 mL/分の流量でバッファー A のクロマトグラフィーを実行します。Tlp3 LBD は 210-220 mL の保存ボリュームでた。ピーク画分をプールします。
  6. タンパク質濃度を測定します。小さなを取る SDS-PAGE 分析用分注。

7 蛋白質の浄化の様々 な段階で収集されたサンプルの SDS ページの分析

  1. 1 L の SDS ページ実行バッファー (バッファー J) を用意し、25 mM を含むトリス, 250 mM グリシン pH 8.3、および 0.1% (w/v) ナトリウム dodecyl 硫酸 (SDS)。
  2. SDS ページの読み込みバッファー (バッファー K) × 5 の 10 mL を準備、0.25 M トリス-HCl pH 6.8 を含む 10% (w/v) SDS、グリセリン 50% (v/v)、1 mM DTT、0.05% ブロモフェノール ブルーします。
  3. 浄化の別の手順中に収集される因数を許可 (1.3、2.3、2.13、4.6、5.13、6.6 のステップ) を再開します。
  4. 各サンプルの総蛋白 5 x SDS ページの読み込み、バッファーし、ddH2O. 10 μ L にボリュームを調整の 2 μ L で 15 μ g に対応する量を混ぜる
  5. 95 ° C、5-10 分でサンプルを加熱、30 s や転送のための 10,000 x g でそれらをスピン クリーン チューブにサンプル。
  6. 15% ポリアクリルアミドのゲルの分離を用いた SDS-PAGE ゲルの準備 (5 mL 2.5 mL 30% (w/v) bis-アクリルアミド、1.2 mL の 1.5 M トリス-HCl pH 8.8, 1.2 mL ddH2O、50 μ L の 10% (w/v) SDS、50 μ L 20% (w/v) 過硫酸アンモニウム (AP)、3 μ L テトラメチルエチレンジアミン (TEMED)5% ポリアクリルアミド ゲルのスタック (2 mL: 340 μ L 30% (w/v) bis-アクリルアミドの 250 μ L 1 M トリス pH 6.8, 1.37 mL ddH2O, 20 μ L 10% (w/v) SDS、20 μ L 20% (w/v) 2 μ L TEMED APS)。
  7. 電気泳動装置を組み立てるし、製造元の推奨に従ってバッファーを実行する SDS ページ × 1 でそれを埋めます。
  8. タンパク質分子量マーカーと 7.5 の手順で作製したサンプルをロードします。25 の定電流で電気泳動を行う mA。
  9. 容器にゲルを転送、Coomassie の青染色液 25% (v/v) イソプロパノール、酢酸 10% (v/v) と 0.03% (w/v) ブリリアント ブルー R-250 を含む ddH2O. 追加 150 mL でそれをすすいでください。室温で 30 分間水平回転プラットフォーム上のコンテナーを配置します。
  10. DdH2O でゲルを洗浄し、5% (v/v) メタノールと 7% (v/v) 酢酸脱染め色液に配置します。1 h の水平回転プラットフォームを使用してミキシングしながらすすぐ。
  11. ゲルをイメージし、分析します。

8. 円二色性 (CD) 分光分析の二次構造リフォールディングモモルチャリンの純粋な蛋白質の

  1. 0.5 - 1 mg の透析チューブに 6.6 のステップで得られるリフォールディングモモルチャリンのタンパク質を転送し、5 L の L のバッファー (50 mM リン酸ナトリウム pH 7.4)、4 ° C に冷却を含む透析バケツ連続攪拌しながら 4 ° C でサンプルを透析しなさいし、少なくとも 3-4 バッファー変更を実行に一晩を透析しなさいサンプルを離れる前に 2-4 h 以上。
  2. 0.06 mg mL-1 10 kDa カットオフ遠心濃縮器を用いた透析タンパク質溶液を集中します。
  3. 13,000 × g、30 分のための 4 ° C での遠心分離によって解決策を明らかにします。
  4. 25 ° C 以上で、性分光を用いた 20 nm 分-1のスキャン レート 200 260 nm の波長範囲でサンプルの遠紫外 CD スペクトルを記録します。空のコントロールとして透析バッファーを使用します。3 通の録音を繰り返し、平均スペクトルを生成します。
  5. 二次構造体の内容を計算による CD スペクトル、DichroWeb から CDSSTR プログラムを使用してサーバー25 (http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk)。

結果

彼の6の組換え発現-Tlp3-大腸菌の LBD 封入体の蛋白質の沈殿で起因しました。ステップ 2.13 で計算された細菌培養の 1 L から式収量だった彼の6の約 100 mg-Tlp3-LBD 封入体に堆積します。封入体、タンパク質リフォールディング アフィニ ティー ・ クロマトグラフィー、タグの削除、サイズ排除クロマトグラフィーによる精製・脱色成っている蛋白質...

ディスカッション

表現と細菌の化学受容器 Tlp3 のペリプラズム LBD の封入体から巻き戻しのための簡単な手順が表示されます。純粋な蛋白質の準備エシェリヒア属大腸菌、浄化および封入体の脱色でペット プラスミド エンコード遺伝子の過剰発現は、連続の親和性によって精製し変性タンパク質のリフォールディングとサイズ排除クロマトグラフィーの手順を実行します。容易に尿素変性とリフォール...

開示事項

著者は競合する金銭的な利益を宣言しません。

謝辞

ゆう c. リューにありがとう Tlp3 LBD 生産の彼の初期の作品。Mayra A. マチューカ Departamento Admistrativo de サイエンス、テクノロジー e Innovación COLCIENCIAS 博士奨学金に恩義ている。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Tris baseAMRESCO497
Sodium chloride (NaCl)MERK MILLIPORE1064041000
AmpicillinG-BIOSCIENCESA051-B
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)MERCK52332
Triton x-100AMRESCO694
Isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG)ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTDAST0487
UreaAMRESCOVWRC0568
DithiothreitolASTRAL SCIENTIFIC PTY LTDC-1029
L-arginine monohydrochlorideSIGMA-ALDRICHA5131
Reduced L-glutathioneSIGMA-ALDRICHG4251
Oxidized L-glutathioneSIGMA-ALDRICHG4376
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)SIGMA-ALDRICH7558-79-4
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)SIGMA-ALDRICH10049-21-5
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA)AMRESCOVWRC20302.260
ImidazoleSIGMA-ALDRICHI2399
GlycerolASTRAL SCIENTIFIC PTY LTDBIOGB0232
Nickel chloride (NiCl2)SIGMA-ALDRICH339350
GlycineAMRESCOVWRC0167
Sodium dodecyl sulfate (SDS)SIGMA-ALDRICHL4509
Unstained Protein Ladder, Broad Range (10-250 kDa)NEW ENGLAND BIOLABSP7703
Amicon Ultracel centrifugal concentrator (Millipore)MERCKUFC901096
50 mL Falcon tubeFALCONBDAA352070
Dialysis tubingLIVINGSTONE INTERNATIONAL PTYDialysis
Snakeskin dialysis tubingTHERMO SCIENTIFIC™68100
Prepacked HiTrap Chelating HP columnGE HEALTHCARE LIFE SCIENCES17-0408-01
EmulsiFlex-C5 high-pressure homogeniserAVESTINEmulsiFlex™ - C5
Peristaltic Pump P-1GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES18-1110-91
Superdex 200 HiLoad 26/60 size-exclusion column GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES28989336
JASCO J-815 spectropolarimeterJASCOJ-815

参考文献

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