JoVE Logo
著者
お問い合わせ

サインイン

このコンテンツを視聴するには、JoVE 購読が必要です。 サインイン又は無料トライアルを申し込む。

この記事について

  • 要約
  • 要約
  • 概要
  • プロトコル
  • 結果
  • ディスカッション
  • 開示事項
  • 謝辞
  • 資料
  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

このプロトコルは当てて神経細胞樹状パターン形成の複雑さ (NDAC) の定量分析、ショウジョウバエ、樹状突起の形態形成の研究に使用することができます。

要約

樹状突起、ニューロンは、分岐予測、樹状突起の形態が神経系の開発の間にシナプス組織を反映しています。ショウジョウバエ幼虫の神経樹状パターン形成 (da) は、神経樹状突起、神経系の発達における遺伝子の機能の形態を研究するための理想的なモデルです。Da 細胞の 4 つのクラスがあります。クラス IV は larval ボディ壁のほぼ全領域をカバーする分岐パターンと最も複雑です。クラス IV の神経樹状パターン形成の複雑さ (NDAC) 4 つのパラメーターを使用してSOX5のショウジョウバエ相同をサイレンシングの効果を特徴付けた以前: 樹状突起の長さ、デンドライト カバレッジの表面積、分岐、および分岐構造の合計数。このプロトコルは NDAC 定量分析、幼生解離、共焦点顕微鏡と ImageJ ソフトウェアを使用して画像解析手順で構成されるワークフローを示します。Da ニューロンの開発とその基になる機構にさらなる洞察力、神経機能の理解を改善し、神経の根本的な原因についての手がかりを提供して神経発達障害。

概要

樹状突起、ニューロンの分岐予測であるは、他のニューロン1,2からニューロンの感覚およびシナプス入力を含むフィールドをカバーします。樹枝状結晶はシナプスの形成の重要なコンポーネントおよびニューロンに電気刺激の伝播し同様、シナプスの入力の統合において重要な役割を果たします。樹状分枝 (da) は、新しいシナプスを作成する新しい樹状分枝ニューロンを形成するプロセスです。Da 支店密度などグループ化パターンの形態と開発多段階の生物学的プロセスの結果、神経機能に相関の高い。このプロトコルの目的はの神経 dendritric 楔形の複雑さの定量分析のためのメソッドを提供するショウジョウバエ。

樹状突起の複雑さは、シナプスの種類、接続、およびパートナーのニューロンからの入力を決定します。分岐パターンおよび樹枝状結晶の密度は樹状フィールド3,4上に収束する信号処理に関与しています。樹状突起は、開発調整の柔軟性を持っています。例えば、シナプス合図では、体性感覚ニューロン発達段階と成熟した神経系5のデンドライト組織に影響を及ぼす。神経接続の確立は、形態形成と樹状突起の成熟に依存します。樹状突起の奇形は神経機能障害に関連付けられます。研究は、da ニューロンの形態形成の異常がアルツハイマー病 (AD)、パーキンソン病 (PD)、ハンチントン病 (HD) を含む複数の神経変性疾患、ルー ・ ゲーリック病の病因に貢献することを示されている/筋萎縮性側索硬化症 (ALS)6,7,8。シナプス変化は衰退とニューロン機能7,8の減損とのコンサートで、広告の初期の段階で表示されます。ただし、デンドライト病理学がこれらの神経変性疾患の病因に貢献する方法の具体的な内容は、とらえどころのないままです。

規制当局、タンパク質9,10、転写因子、細胞表面の受容器11,12 配位子の Wnt ファミリーなどの複雑なネットワークをエンコードする遺伝子によって樹状突起の発達の制御します。.ショウジョウバエda ニューロンから成る 4 つのクラス (クラス I、II III、IV)、クラス IV の da ニューロンは最も複雑な分岐パターンを持っているし、より良い理解形態13、強力な実験的システムとして採用されています。 14。初期形態形成における過剰発現や RNAi はクラス IV の da ニューロンの遺伝子のサイレンシングは分岐パターンとデンドライト剪定13の変化の結果します。神経細胞の樹状突起パターン形成の定量分析のための実用的な方法を開発することが重要です。

我々 は以前にSOX5のショウジョウバエ相同を黙らせる、 Sox102F、導いた短い樹状突起の da ニューロンとクラス IV da ニューロン15の複雑さを軽減します。ショウジョウバエにおける神経樹状パターン形成の複雑さ (NDAC) の定量分析の手順を紹介します。このプロトコルは、以前説明した方法論からの適応は、da ニューロンの開発を試金する簡潔な方法を提供します。ロバストな画像のラベル付け、3 齢幼虫の体壁16,17,18,19の da ニューロンを示しています。NDAC と体内の発達の違いを調査したい人のための貴重なプロトコルです。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

プロトコル

1. 実験準備

  1. 次の試薬の準備: ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (PBS);トリトン X-100;0.2 %pbst (PBS + 0.2% トリトン X-100);32% パラホルムアルデヒド (PFA) 4% 使用前に希釈シリコーンのエラストマー ベースと硬化剤;antifade マウント媒体 (例えば、延長金);指の爪のポーランド語。
  2. 次の機器を準備: 解剖顕微鏡 2 シャープな鉗子と顕微解剖、解剖皿、顕微鏡のスライドや coverslips、共焦点顕微鏡を作るためのシャーレ用ピン数顕微解剖用ハサミと、フィジー ImageJ ソフトウェアがインストールされたコンピューター。

2. 幼虫コレクション

  1. それぞれ W1118野生型ハエや ppk GAL4、UAS GFP と UA Sox102F RNAi ハエを仲間します。文化は、25 ° C で標準状態で飛ぶ
  2. 5 〜 6 日 UA Sox102F RNAi の 3 齢幼虫を収集/ppk GAL4 や UAS GFP、UAS GFP ppk GAL4/+ 解離ピンセットで慎重にコントロール。

3. 幼虫の郭清

注: このセクションのすべての手順は、顕微解剖顕微鏡の下で運営されています。倍率は調査官次第です。最適な視力表示を調整しようとします。4 〜 6 倍の倍率をお勧めします。

  1. 基本シリコーン ・ エラストマー製解剖皿と組織培養シャーレに幼虫を配置します。
  2. 背側、上向きにできるように幼虫口フックをピン留めし、幼虫の尾をピンします。オープン アップ マーカーである正中線を公開するためにできるだけ途中で背側を配置します。
  3. 本体の水分を維持するために幼虫に 200 μ L の PBS を追加します。
  4. 吻側に尾側から 2 つの気管の背側正中線に沿ってはさみでカットをします。幼虫の体の 4 つのコーナーのそれぞれで小さい切り傷を作る。
  5. 体が平らので体の 4 つのコーナーのそれぞれにピンを配置します。
  6. 4% で幼虫の体壁を修正する PFA 室温で 25 分。
  7. Pbst; 5 分繰り返し 2 回以上洗ってください。
  8. 組織からピンを削除します。組織を転送 antifade 実装中、スライド ガラスの上にカバーし、カバー スリップをマウントします。1 時間乾燥空気し、指の爪のポーランド語でエッジをシールします。

4. 画像の処理

注: 画像は倒立共焦点顕微鏡システムを使用して撮影されました。ユーザーは、(推奨) 20 × 対物を使用してサンプルを写真することができます。

  1. Z シリーズ画像をキャプチャします。共焦点顕微鏡のソフトウェアで「Z シリーズをキャプチャ」ダイアログ ボックスを開きます。Z シリーズのイメージをキャプチャする範囲を決定します。
    1. 「上と下」ボタンををクリックしてします。上部と下部位置し、入力する値を決定する「下:"と"トップ:"ボックス。0.5 μ m として「Z シリーズを取り込み」ダイアログ ボックスの「ステップ」を設定します。Z シリーズ画像を取得する「今すぐ実行」ボタンをクリックしてします。
  2. *.Tiff または *.nd2 ファイルとしてイメージを保存します。
  3. イメージング後、4 ° C で暗いホルダーにスライドを格納します。

5. 樹状突起の評価

注: GFP タンパク質だったが、UAS GFP で co 過剰発現、ppk GAL4 飛んで GFP 蛍光分析のための da ニューロン。長さ、分岐、および第 3 齢幼虫の da ニューロンの構造を定量化しました。解析パラメーターには、長さ樹状突起 (μ m)、表面積 (2μ m)、枝、および分岐構造 (%) の合計数が含まれます。図 1は、詳細に解析パラメーターを示します。

  1. 樹状突起の長さ
    注: 樹状突起の長さは、トレーサーのプラグインというラベルの付いたすべての樹状突起の合計です。
    1. セットアップおよびフィジー ImageJ (https://fiji.sc/)20ソフトウェアを実行します。画像のいくつかのチャンネルがある場合、別々 のチャンネルに画像を分割します。
      注: このプロトコルのイメージは、GFP の 1 つのチャンネルのみが。
    2. 実行"画像 |スタック |Z プロジェクト"Z 投影; を取得するには新しいウィンドウが表示され、名 ' Z-投影。投影型の「最大強度」をクリックしてしスタート スライスとスライスによっては停止間数を整理する個々 の好みに応じて。"OK"をクリックします。Z 投影画像樹状突起を明確に提示することが表示されます。
    3. 神経突起をトレースします。
      1. 選択して"プラグイン |分割 |単純な神経突起トレーサー"ウィンドウに樹状突起をトレースします。ニューロン相馬を見つけ、樹状突起細胞体とこの樹状突起の先端のもう一つの点からの 1 つのポイントをクリックします。
        注: 青い線と 2 つの点は、プログラムが接続されます。
      2. パスが明らか場合プラグイン ・ ウィンドウで"Y"キーを押しますデンドライトのパスは、可視画像で選択されたパスの端点までトレースされます。同じプラグイン ウィンドウを「完全なパス」をクリックします。セグメントが完了した (図 2)。
        注: いくつかの樹状突起は小さなセグメントに分割された経路の出発点から遠くなったセグメントは、トレーサーの完全なパスを提供するために結合されました。
    4. パスが完了した後は、枝が、新しいポイントに戻る。新しいパスを作成できるで。「すべてパス」ウィンドウ ボックス (図 3) すべてパス長さ値が表示されます。トレース ファイルを保存し、図 2に示すように、未完成のトレースを続行します。
    5. クリックすると、樹状突起の長さデータをエクスポート"ファイル |*.Cvs として"ウィンドウでエクスポート 'プラグイン'。次にすべてのパスの長さを合計し、データ分析/表計算ソフトへデータをエクスポートします。(図 3)。
  2. Da ニューロンの表面積
    1. ' フィジー ImageJ」ウィンドウでフリーハンド描画ツールを選択します。パスをトレースし、端点を接続します。[分析] メニューを選択"測定 |領域"です。[分析] メニューから「メジャー」をクリックします。選択領域 (図 4) の値を持つ新しいボックスに結果が表示されます。データ分析ソフトウェアにそれをコピーします。
  3. 合計の番号の枝と da ニューロンの分岐構造
    1. 「分析」を開くことによって枝の総数を計算し、「レンダリング |分析された白骨パス」[プラグイン] ウィンドウ (図 5) をトレースの。
      注: アーバの構造は、枝のレベルの合計です。細胞体と樹状突起先端間パスを定義し、1 つのパスはプライマリのアーバーは、ニューロンの細胞体から樹状突起など複数の分岐を含めることができます。セカンダリのアーバーは、第三紀、第四紀となおアーバーでプライマリからの分岐です。樹状突起の分岐の構造は、枝のレベルによって区切られています。たとえば、プライマリの % は、枝分岐の合計数で割った値と数です。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

結果

Da ニューロンの樹状突起は、da 神経相馬と GFP 蛍光分析の樹状のアーバー (UA GFP; ppk GAL4) co 過剰発現の GFP でラベル付けされました。Da ニューロンの樹状突起の形態は、倒立共焦点顕微鏡 (図 2) でイメージしました。

Da ニューロンの樹状突起は、フィジー ImageJ ソフトウェアを使用して追跡しました。...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

ディスカッション

表皮を刺激する樹状突起、ニューロンの入力領域とどのように情報の受信を検出し、個々 のニューロンによって処理の形態を決定します。開発デンドライト形態は、デンドライト組織の遺伝子の調節を反映しています。末梢神経系のショウジョウバエ幼虫の da ニューロンは樹状突起の形成のための研究のための重要なモデル: 1) 哺乳類11,12; ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

我々 はイメージングの技術援助のためウィリアム A. Eimer を感謝したいです。この作品は 【 R.E.T] を治療アルツハイマー病の資金によって支えられた、国立衛生研究所の 【 R01AG014713 ・ R.E.T; に R01MH60009R03AR063271、アダムローリーに R15EB019704] 国立科学財団 [アダムローリーに NSF1455613]。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Phosphate buffered saline(PBS)Gibco Life Sciences10010-023
TritonX-100Fisher Scientific9002-93-1
Paraformaldehyde(PFA)Electron Microscopy Sciences15714-S
Sylgard 184 silicone elastomer base and curing agentDow Corning Corportation3097366-0516;3097358-1004
ProLong Gold Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36931
Fingernail polish CVS72180
Stereo microscopeNikonSMZ800
Confocal microscopeNikonEclipse Ti-E
Petri dishFalcon353001
ForcepsDumont11255-20
Scissors Roboz Surgical Instrument CoRS-5611
Insect Pins Roboz Surgical Instrument CoRS-6082-25
Microscope slides and cover slipsFisher Scientific15-188-52

参考文献

  1. Wassle, H., Boycott, B. B. Functional architecture of the mammalian retina. Physiol Rev. 71 (2), 447-480 (1991).
  2. MacNeil, M. A., Masland, R. H. Extreme diversity among amacrine cells: implications for function. Neuron. 20 (5), 971-982 (1998).
  3. Losonczy, A., Makara, J. K., Magee, J. C. Compartmentalized dendritic plasticity and input feature storage in neurons. Nature. 452 (7186), 436-441 (2008).
  4. Spruston, N. Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration. Nat Rev Neurosci. 9 (3), 206-221 (2008).
  5. Jaworski, J., et al. Dynamic microtubules regulate dendritic spine morphology and synaptic plasticity. Neuron. 61 (1), 85-100 (2009).
  6. Kweon, J. H., Kim, S., Lee, S. B. The cellular basis of dendrite pathology in neurodegenerative diseases. BMB Rep. 50 (1), 5-11 (2016).
  7. Baloyannis, S. J. Dendritic pathology in Alzheimer's disease. J Neurol Sci. 283 (1-2), 153-157 (2009).
  8. Masliah, E., Terry, R. D., Alford, M., DeTeresa, R., Hansen, L. A. Cortical and subcortical patterns of synaptophysinlike immunoreactivity in Alzheimer's disease. Am J Pathol. 138 (1), 235-246 (1991).
  9. Wayman, G. A., et al. Activity-dependent dendritic arborization mediated by CaM-kinase I activation and enhanced CREB-dependent transcription of Wnt-2. Neuron. 50 (6), 897-909 (2006).
  10. Rosso, S. B., Sussman, D., Wynshaw-Boris, A., Salinas, P. C. Wnt signaling through Dishevelled, Rac and JNK regulates dendritic development. Nat Neurosci. 8 (1), 34-42 (2005).
  11. Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Different levels of the homeodomain protein cut regulate distinct dendrite branching patterns of Drosophila multidendritic neurons. Cell. 112 (6), 805-818 (2003).
  12. Sugimura, K., Satoh, D., Estes, P., Crews, S., Uemura, T. Development of morphological diversity of dendrites in Drosophila by the BTB-zinc finger protein abrupt. Neuron. 43 (6), 809-822 (2004).
  13. Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: mechanisms of dendritic arborization. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).
  14. Sears, J. C., Broihier, H. T. FoxO regulates microtubule dynamics and polarity to promote dendrite branching in Drosophila sensory neurons. Dev Biol. 418 (1), 40-54 (2016).
  15. Li, A., et al. Silencing of the Drosophila ortholog of SOX5 leads to abnormal neuronal development and behavioral impairment. Hum Mol Genet. 26 (8), 1472-1482 (2017).
  16. Misra, M., et al. A Genome-Wide Screen for Dendritically Localized RNAs Identifies Genes Required for Dendrite Morphogenesis. G3 (Bethesda). 6 (8), 2397-2405 (2016).
  17. Emoto, K., et al. Control of dendritic branching and tiling by the Tricornered-kinase/Furry signaling pathway in Drosophila sensory neurons. Cell. 119 (2), 245-256 (2004).
  18. Olesnicky, E. C., et al. Extensive use of RNA-binding proteins in Drosophila sensory neuron dendrite morphogenesis. G3 (Bethesda). 4 (2), 297-306 (2014).
  19. Parrish, J. Z., Xu, P., Kim, C. C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. The microRNA bantam functions in epithelial cells to regulate scaling growth of dendrite arbors in drosophila sensory neurons. Neuron. 63 (6), 788-802 (2009).
  20. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  21. Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136 (7), 1049-1061 (2009).
  22. Jinushi-Nakao, S., et al. Knot/Collier and cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape. Neuron. 56 (6), 963-978 (2007).
  23. Crozatier, M., Vincent, A. Control of multidendritic neuron differentiation in Drosophila: the role of Collier. Dev Biol. 315 (1), 232-242 (2008).
  24. Copf, T. Importance of gene dosage in controlling dendritic arbor formation during development. Eur J Neurosci. 42 (6), 2234-2249 (2015).
  25. Rosso, S. B., Inestrosa, N. C. WNT signaling in neuronal maturation and synaptogenesis. Front Cell Neurosci. 7, 103(2013).
  26. Engel, T., Hernandez, F., Avila, J., Lucas, J. J. Full reversal of Alzheimer's disease-like phenotype in a mouse model with conditional overexpression of glycogen synthase kinase-3. J Neurosci. 26 (19), 5083-5090 (2006).
  27. Longair, M. H., Baker, D. A., Armstrong, J. D. Simple Neurite Tracer: open source software for reconstruction, visualization and analysis of neuronal processes. Bioinformatics. 27 (17), 2453-2454 (2011).
  28. Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. NeuriteTracer: a novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth. J Neurosci Methods. 168 (1), 134-139 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

転載および許可

このJoVE論文のテキスト又は図を再利用するための許可を申請します

許可を申請

さらに記事を探す

143

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

個人情報保護方針

利用規約

一般データ保護規則

お問い合わせ

図書館への推薦

JoVE ニュースレター

研究

教育

著者

図書館員

JoVEについて

Copyright © 2023 MyJoVE Corporation. All rights reserved