神経変性疾患を持つマウスの年齢依存性運動障害の歩行分析

要約

本研究で我々 は腹面が加齢マウス モデル (例えば、エンドフィリン突然変異体の神経変性の進行と同様、モーターの調整の微妙な変化を監視するイメージングに基づく運動歩行解析の使用方法を示すマウスの行)。

要約

モーターの動作テストは齧歯動物モデルの機能的関連性を決定するために使用されますが、新しくをテストするこれらの動物の治療法を開発しました。具体的には、歩行解析により再収集病、筋萎縮性側アルツハイマー病 (AD)、パーキンソン病 (PD) など運動能力に影響を与える神経変性疾患を中心に、人間の患者で観察される関連する表現型外側硬化症 (ALS)、および他。この線に沿った初期の研究で歩行パラメーターの測定は骨の折れるとコントロールしにくい要因に依存して (例えば、走行速度、連続運転)。腹面イメージング (VPI) システムの開発では、齧歯動物でこのメソッドの運動行動の評価のための便利なツールを作って、大規模な歩行分析を実行することは不可能。ここでは、提案する神経変性; のマウス ・ モデルにおける運動障害の年齢依存進行を調べる運動学的歩行分析を使用する方法の詳細なプロトコルエンドフィリン、変性損傷が徐々 に年齢とともに増加の低下レベルでのマウスの行は例として使用されます。

概要

神経変性疾患の患者・家族・社会に深刻な負担を課すこと、平均寿命が上がるにつれて、関心が大きくなるし、世界の人口でエージングを続けます。神経変性疾患の最も一般的な症状の一つはバランスと機動性の問題です。したがって、特性 (例えば、齧歯動物) の哺乳類の老化運動行動のモデル、またはモデルの神経変性の表現型を示すが生体内で関連性を示す特定の動物モデルまたは治療する貴重なツール病気の症状を改善することを目指して治療します。神経変性疾患の治療にほぼすべてのアプローチは最終的に人間の臨床試験の開始前に動物モデルでのテストが必要です。したがって、一貫して年齢の進行に沿って病に関連した表現型を定量化するための in vitroモデルの可能性を示した、候補薬ができるようにするために使用できる信頼性の高い、再現可能な動作テストすることが重要です。生きている動物の表現型を効果的に改善します。

齧歯動物の運動行動評価の 1 つの側面は、VPI (また呼ばれる腹面ビデオ撮影)^1,2で行うことができる運動歩行分析です。透明およびモーターを備えられたトレッドミル ベルト^1,2,3,4の頂上に歩いて齧歯動物の下側の連続記録この確立されたメソッドを使用します。ビデオ フィード データの解析が動的にかつ確実に要約齧歯動物の歩行パターンでは、もともとケールらで定義されているすべての 4 つの手足の「デジタル足プリント」を作成します² Amendeら³。

イメージングに基づく歩行分析の原則は、それぞれの個々 の足の時間をかけてトレッドミル ベルトと接触して手領域を測定することです。すべての姿勢は、足エリア (ブレーキの段階では) で、(推進中) 足の面積の減少の増加によって表されます。これは、信号が検出されない遊脚相が続きます。スイングやスタンス一緒にストライドを形成します。歩行ダイナミクスのパラメーターに加え、姿勢パラメーターは、記録したビデオから抽出できます。模範的なパラメーターと定義の表 1に掲げるとスタンス幅 (SW; 前部または後部足から吻尾軸までの複合距離) を含む、歩幅 (SL; 同じ足の 2 つの前進間の平均距離)、または足の配置角度 (吻尾軸に足の角度)。姿勢と歩行の動態データを許可 (姿勢パラメーターと複数のステップ変動) による動物のバランスと (歩行力学パラメーター) によって調整に関する結論を引き出す。運動失調係数 (SL 変動 [(最大で計算など、その他のパラメーターSL−min。SL) 意味する SL/])、後肢共有スタンス時間 (両後肢がベルトに接触している時間) または足ドラッグ (リフトオフの手による姿勢からベルトに足の総面積) も抽出することができます、様々 な神経変性 · ディ · 変更する報告されています。病モデル^5,6,7,8 (表 1参照)。

パラメーター	ユニット	定義
スイング ・ タイム	ms	足はベルトとの接触時間の期間
立ち時間	ms	足はベルトとの接触時間
% ブレーキ	立ち時間の %	姿勢の時間足、ブレーキの段階の割合
% を推進します。	立ち時間の %	足は、推進段階スタンス時間の割合
スタンス幅	cm	前部または後部足から吻尾軸までの距離合計
ストライドの長さ	cm	同じ足の 2 つの前進間の平均距離
ストライド	前進/s	1 秒あたりの完全な大またの数
足の配置角度	度	動物の吻尾軸に関連して足の角度
運動失調の係数	a.u.	SL [(max SL-min SL)/平均によって計算された SL 変動]
% 共有姿勢	スタンスの %	後肢共有姿勢の時間;両後肢が同時にベルトと接触している時間
足ドラッグ	mm2	リフトオフの手による姿勢からベルトに足の総面積
肢荷重	cm2	最大ダ/dT;速報段階では足の変化の最大レート
ステップ角度変動	度	後肢の間の角度の標準偏差は、SL と SW の関数として足します。

表 1。腹面イメージングによってテストすることができますキー歩行パラメーターの定義。

神経変性疾患モデルマウスの運動行動の評価は与えられた年齢での特定のモデルの表現型の重症度に応じて挑戦することができます。いくつか病気、最も目立つように PD を強力なモーター動作 (歩行) 赤字は、患者と動物モデルの両方。PD の 4 つの主症状の一つは加齢とともに進行し、PD⁹の初期の段階で既に重度の歩行障害のマニフェスト運動緩慢です。急性の PD モデル 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP) が奏効の齧歯動物の研究は既に VPI 歩行分析^10、11,12を使用しています。しかし、このモデルの急性の性質を考えると、これらの研究は対処できません加齢に伴う運動障害の進行。いくつかの最近の研究はたとえば^13,14,15, 加齢とともに病気の進行を理解することの関連性を強調して神経変性変化高齢マウスにおける歩行分析を行った.

運動障害に加えて神経変性疾患の動物モデルはしばしば検討タスクに焦点を当て問題を抱えるし、加齢と共に特に顕著な認知障害を示します。このような表現型はモーターの動作テストの結果に影響を与えます。すなわち、rotarod テスト¹⁶、運動障害を調べる最も広く使用されている試験の一つは、認知、注意、およびストレス^17,18に依存します。モーターを備えられたトレッドミルの上を歩く意欲は、またこれらの要因によって異なります記録の読み出しを実行すると、標準的な機能であるし、これまで変更された認知の影響は小さい。ストレスと注意の影響は、全体的な実行能力ではなくスイング ・ スタンス時間の応力、および注意^19、20SL のような特定のパラメーターで表示ことがあります。

運動学的歩行分析のアプローチをさらに齧歯動物モデルの課題を調整するオプションを持つことの利点を提供しています。調整可能な角度とスピードでトレッドミルにより、歩行速度 0.1 ~ 99.9 cm/s、重度の歩行障害を持つ齧歯類は遅い速度で実行することができますように (~ 10 cm/s)。高速走行速度で測定できる非障害動物 (30 - 40 cm/s)。テストの動物が一定の速度で実行することができるかどうかの観察は、それ自体で結果を提供します。さらに、齧歯類は、ゴニオメータの助けを借りて、希望の角度にトレッドミルを傾けることによってまたは加重そりをマウスまたはラットの後肢にアタッチすることにより減少、上下、傾斜を実行するさらに挑戦しました。

患者で変異が単一のタンパク質の多くの研究に加えて不良エンドサイトーシス プロセスと神経変性^{13,21,22、間のリンクの最近の増加の意識があります。 23,24,25,26,,2728}。エンドフィリン A の減らされたレベルを持つモデルをマウス (今後エンドフィリン) 両方クラスリン依存性エンドサイトーシス^13,21,の^29,30,31の主要プレイヤー^,32,33,45とクラスリン依存エンドサイトーシス³⁴、神経変性を示し、自発運動^13,21の年齢に依存して障害が判明しました。3 つの遺伝子をエンコード エンドフィリン蛋白質の家族: エンドフィリン エンドフィリン 2、1 とエンドフィリン 3。特に、エンドフィリン蛋白質の枯渇から生じる表現型は数によって大幅に異なりますエンドフィリン遺伝子^13,21を不足しています。トリプル ノック アウト (KO) エンドフィリン遺伝子は致死が誕生と両方のエンドフィリン 1 と 2 失敗繁栄し、出産後 3 週間以内に死亡することがなくマウス後わずか数時間、3 つの endophilins のいずれかの単一の KO を示しています明白な表現型のテスト条件²¹。他エンドフィリン変異遺伝子は減らされた寿命を表示し、年齢¹³の増加と運動障害を開発します。例、エンドフィリン 1KO 2HT 3KO マウス表示歩行変化と運動協調性問題 (運動学的歩行分析と rotarod によってテスト) としての同腹子ながら、生後 3 か月ですでにエンドフィリン 1KO 2WT 3KO 動物表示重要です年齢¹³の 15 ヶ月間は運動協調性が減少します。これらのモデルにおける表現型の広大な多様性のため、識別し、さまざまな動物のモーター認知能力と時代に対応する課題を統合することができますテストを適用する必要です。ここでは、発症および神経変性変化 (すなわち、エンドフィリン変異体) を示すマウス モデルにおける運動障害の進行を評価する運動学的歩行分析に活用実験の手順を詳しく説明します。様々 な年齢や歩行障害の重要度が異なるで歩行パラメーターの測定が含まれます。

プロトコル

ここで報告したすべての動物実験は動物福祉のためのヨーロッパの指針に基づいて実施される (2010/63/EU) Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (ラーベス)、登録番号 14 の承認で/1701。

1. 研究デザイン

1. 動物の行動の仕事は、慎重な計画を必要とする実験を設計しながら次のパラメーターを検討します。
   1. グループごとに必要な動物の数です。
      1. (例えばパス、EDA、または GPower) 必要なグループのサイズを計算する統計ソフトウェアを使用します。
         注: グループのサイズは、動物と表現型の重症度との相違に依存します。動歩行解析のためネズミの数は通常 10-20 グループごとであります。
   2. 実験動物のセックス。
      1. 動物の系統によって、実験に及ぼすエストロゲンのレベルを検討します。
         注: 多くの行動研究は、実験に及ぼすエストロゲンの影響を避けるために男性に集中します。これらの影響は、動物の背景系統によってもっとまたはより少なく強い。
      2. 男女が使用される場合、性の影響をテストし、必要があるときに独立して 2 つの男女を評価します。
   3. 実験動物の時代。
      1. のみ 1 回限りのポイントが必要な場合は、大人動物 (2 ヶ月以上の年齢の方) を使用します。
      2. 加齢とともにモーター動作の変更を検討するときは、いくつかの時間ポイントを選択します。最も早く可能な時間ポイントは 1 ヶ月、マウスは、母親から引き離されます。例えば、 1、2、または 3 か月ごと定期的に動物をテストします。
2. 動物の動作テストを実施する地元当局からの承認を申請します。
3. 実験動物の調達計画を立てます。
   1. 繁殖計画を立てる、またはとき、実験開始日に十分な実験動物が利用できるようにタイムリーに動物のディストリビューターにお問い合わせください。
   2. 新しい部屋の/設定、実験中に保持されている場合、1 週間の習慣になって動物を許可します。

2. ビデオ録画

注: 運動学的歩行分析の使用を示すためには、ここで市販イメージング システムとその付属のイメージング解析ソフトウェア (材料の表を参照) を使用します。

1. コンピューターと撮像素子のソフトウェアを起動します。
2. ホームおり、観察してみるとバランスの重さによって健康状態とそれぞれの動物の幸福を決定します。
3. 必要に応じて、ブラシで動物の足に赤い指塗料を適用優しく。予備のきれいなケージで 〜 5 分間乾燥する塗料を許可します。
   メモ: は、塗料は足と体のコントラストを高めるために動物の腹部を塗装しないでください。黒指塗料の修正のために便利を持っていると便利です。褐色の毛皮を持つ動物のため、この手順は必要またはケースの足が同定の入れ墨をされました。1 つの動物の足を描画するを選択した場合同じグループとコントロール グループのすべての動物は、同様に塗装する必要があります。
4. 装置の右上のパネルでトレッドミルの速度を設定します。1 つ以上の走行速度を適用する場合は、まず最も遅い速度から始めます。
5. 試験室に動物を配置 (商工会議所を閉じるとき、尾や足をクランプを避けるため)。チャンバー内に暗い布をカバーでき、各動物に 1-2 分を調整します。
6. 「オン」の位置にトレッドミル光ロータリー スイッチを回すことによって試験室でライト点灯します。トレッドミルのロータリー スイッチ、トレッドミルを開始する「転送」を撮像素子のソフトウェアで「レコード」ボタンをクリックします。
   注: トレッドミルを実行中それが動物パフォーマンスを慎重に常に観察することが重要: 動物をトレッドミルの速度に追いつかない場合は、トレッドミルを直ちに停止または歩行に関連して非二次症状を示しています (などてんかん発作)。試験条件は、再調整する必要があります。
7. 安定走行に動物 (ないクイック エスケープの側面、前面、または背面に) 記録少なくとも 5 のトレッドミルを停止する前に s。撮像素子ソフトウェアを「停止」をクリックして録音を停止、トレッドミルのロータリー スイッチを「オフ」ポジションに向けます。
   注: 動物の不安定な実行を避けるために立ちますいくつか秒間に実行できるようにするか (「フォワード」ではなく「逆」トレッドミルのロータリー スイッチを回す)、他の方向で実行するそれらを許可します。
8. (分析に使用)、ビデオのセクションの開始と終点を設定することができますメニューを開きますイメージャ ソフトウェアで「処理」ボタンをクリックしてします。これを行うには、ビデオを移動する画面の下部にスライダーを使用します。
9. 始点または終点として現在の時間ポイントを選択するをクリックして"からフレーム #"および"to"それぞれ。一定の速度で安定して動作する動物の少なくとも 7 手順/足 (合計で 14 のステップ) が記載されていることを確認します。
10. 動物の個体識別、出生年月日、重量、およびセックスを入力します。コンピューターまたはサーバー上の目的の場所にデータを保存します。「カメラ」レコーディング インターフェイスに戻りますをクリックします。
11. 複数の実行速度は、記録する必要があります、手順 2.6 2.10 を目的の実行速度に。次のビデオを記録する前に赤いペンキがまだ前足で、それ以外の場合手順 2.3 に存在するを確認します。
12. 録音後、その家のケージに動物をリリースします。動物を削除すると、次の実験動物の準備に消毒剤と石鹸水とトレッドミル ベルトを徹底的にきれい。

3. ビデオ処理

1. 解析ソフトウェアを起動し、「勉強フォルダーを選択」をクリックして記録されたビデオのフォルダーを選択します。
2. 1 つのビデオ、またはいくつかのビデオ、連続して処理することができますをクリックして"go"を選択します。
3. 「再描画」関数を使用してマウスを実行している領域を選択このセクションは、マウスと白背景のみ含める必要があります。
4. 「逆」トレッドミル関数が以前に使用した場合は、選択"被験者の鼻は右側になるかどうかはチェックしてください >>>"ビデオの左右反転だけ左に実行している動物を分析するソフトウェアが設計されているので。「受け入れる」続行するをクリックします。
5. 「リフレッシュ」関数を使用して、既定のマスクを参照してくださいし、あしあとソフトウェアを検出します。
   メモ: 左側の元のビデオが表示され、提案の足の印刷物の黒と白の画像は右側。
6. 分析のための動物の鼻の周りの赤い部分を除外マスクを変更する「長さ」と「幅」ボックスに値を入力します。色は、足と同様、その領域をマスキングしないと足と鼻の領域を誤って分類するソフトウェア可能性があります。
7. 調整スライダー「フィルター ノイズ」と「毛皮と暗いパッチをフィルター」黒と白の足の印刷を最適化します。~ 800-950 黒い動物のために、動物の正確な毛の色によって、茶色または白い動物のため 700 ~ 800 には、「ノイズ フィルター」のスライダーを設定します。設定が満足のいく「ok」を選択します。
   注:「毛皮と暗いパッチをフィルター」スライダー依存方法「赤」の前足です。塗られた足の値は通常、約 100-120、非塗装の足の最高値は周り 50-100。これらの設定は、毛皮と、足の色の調整に依存する、すべての動物のために最適化する必要があります。印刷の黒と白の足として可能な限りほとんどのバック グラウンド ノイズと足の明確な表現が必要です。
8. 最初の調整を渡された 1 つまたは複数の動画を選択 (ラベルの付いた"@ @"ビデオの名の前に) これらのビデオの解析を開始する「行く」関数を選択。
   注: 分析は、動画ごと 2-5 分します。この手順が実験者からの入力を必要としないので、一晩いくつかのビデオの解析を実行することが可能です。
9. 分析ビデオを選択 (ラベルの付いた"@")"go"をクリックしてそれぞれの独立した足 (歩行力学) を時間をかけてベルトとの接触 (cm²) 足エリアが画いてある今に注意してください。元のビデオと計算された足の選択範囲を印刷を比較、「動画再生」機能を使用します。
10. 次の (3) のツールを使用して、ソフトウェアによって小さな誤りを修正します。
    1. 例えばソフトウェアが対応する足がベルトと接触してないのに、信号を記録するとき、間違った信号を削除するのには「正しい」のオプションを使用します。関連する領域を拡大表示するをクリックし、2 番目のクリックで削除するオブジェクトの左の枠と 3 番目をクリックすると右側の境界線をマークします。
    2. などにもかかわらず、足はベルトとの接触に、いくつかのフレームの信号を記録してないとき、2 つの信号を結合するのにには、「接続」オプションを使用します。一度をクリックして関連する領域を拡大表示し途中で結合する 2 つのオブジェクトをダブルクリックします。
    3. 時間ポイントを分析から完全に削除するのに「削除」オプションを使用します。「正しい」または「接続」機能、例えば、左後肢足に左前肢足から信号が誤って記録されるときに間違いを修正できない場合にのみこのオプションを使用します。関連する領域を拡大表示するをクリックし、2 番目のクリックで削除する領域の左枠と 3 番目をクリックすると右側の境界線をマークします。
       のみメモ: 小さな誤りを修正するツールを使用することがあります。(例えば、 1 つの足からの信号は非常に弱い場合) の組織的失敗を訂正できない: ビデオを解析から除外する必要があり、それぞれの動物の記録、可能なときに繰り返し。「動画再生」オプションは、「正しい」後は、もはや利用可能なノートでは、「接続」または「削除」オプションが使用されていますと編集ツールすべての 3 にリセットされます「元に戻す」ボタンをクリックしますします。
11. 「次に上肢」を選択 4 手足進むには最後の足の後「次の肢」をクリックするソフトウェア分析を完了し、、4 つスクリーンにこの動物の結果を示します。

4. 歩行分析

1. 1 つの実験からすべての動画を分析するときすべての動画を選択し、「結果を再編成」をクリックして結果 (スプレッドシート ファイル内のパラメーターの一覧) をエクスポートします。
2. 終了の"reorganized_stride_info"ファイルを開くし、このスプレッドシートに含まれていない情報を追加: グループ情報 (例えば遺伝子、治療)、年齢、および別に保存された動物の長さと幅の測定スプレッドシート ファイル終了"SFI_TFI_PFI_reorganized_stride_info"
3. 必要に応じて、動物の幅または長さを歩行パラメーターの正規化などSL 動物の長さと SW に動物の幅に。
4. グループ、年齢、および走行速度で結果を並べ替える: すべてのこれらの条件を個別に分析します。
   注: 年齢や実行速度は、同じグループ内で併用はできません。
5. 平均値、標準偏差、およびすべての実験条件の各パラメーターの平均値の標準誤差を計算します。
6. 実験デザインによると統計分析を行う、2 尾tを使用するなど-変異/扱った動物野生型 (WT) を比較するテスト/制御、または ANOVA のいくつかの独立したグループを比較します。
7. 一見まったく測定パラメーター: 良い結果を視覚化する各パラメーターをプロットすると便利です。任意のパラメーターの統計的な差異が存在する場合は、かどうか他の依存のパラメーターを適宜変更することを確認してください。
   注: たとえば、SL は特定のテスト グループに大幅に減少した場合もこう高いストライド (走行速度が同じである) ので、その結果増加 SW (姿勢の安定性を維持する) ために。
8. モデル、最も関連のあるおよび/またはヒトの疾患の観察に匹敵するパラメーターを選択します。プレゼンテーション、グループごとに代表的な動画を作成し、以来、微妙な歩容変更がビデオから明白ではない多くの場合、関連するパラメーターの読み出しを示すグラフでそれらを補完します。

5. トラブルシューティング

注: いくつかの動物は、不安の表現型、特にマウス モデルもトレッドミル上で実行のような単純なタスクを実行する難しさがあります。下位の不安レベルを取ることができるし、実行を奨励する手順を次に示します。

1. 慣れや肯定的な施行。
   1. 最初のテストの前に 2 〜 3 日で試験室にマウスを置き、暗い布でカバー、ライトをオフのままにします。マウス 〜 5 分追加チョウの新しい環境や試験室にチョコレート/ナット バターを (例えばヌテッラ) 肯定的な連合を形成する可能性がありますので調整をしましょう。
2. 空気のパフ/リアの境界によって否定的な施行。
   1. マウスは空気のパフや、その背後にある運動好きではないと妨害から実行されます。実行をやる気にさせるには、穏やかな空気のパフや試験室は、試験室の前部の方にマウスを奨励するためのリアの境界を形成する柔軟なバーのリズミカルな動きを使用します。
3. 起動が遅い。
   1. 高速の実行速度をテストするとき低速でトレッドミルを起動し、目的のテスト条件に向かってトレッドミルの速度をゆっくり増加します。
4. 自由な動きを最小限に抑えます。
   1. テスト部屋の長さは、前面と背面の 2 つの調節可能なバーによって制限されます。試験動物が走行速度を維持、着実に実行されない場合より安定した実行の結果を商工会議所の長さを制限します。
5. 上記測定が成功しなかった場合は、次の日に実行を記録します。動物はまだ後 3 日間のテストを実行することを拒否、発見として記録し、さらにテストから動物を除外します。
   注: 歩行分析の結果は、良い品質のビデオ録画に依存します。動画は慎重に記録されている場合、解析中に動画を除外する理由はないです。ビデオの品質が不足している場合明らかになる段階 3.6 デジタル足のプリントを作成するためのパラメーターが設定されているとき。足と鼻以外の部位が赤表示されます (例えば性器や腹部に指塗料マイメロディ周り不足している毛皮のため)、品質が大幅に低下します。3.6 のステップで調整できるだけ小さな問題を修正する、これは許容可能な信号/ノイズ比にビデオをもたらすことはできません、する場合、解析から除外する必要がありますビデオと記録が繰り返される必要があります。したがって、録音が実行された後すぐに動画を分析することをお勧めします。

結果

運動学的歩行分析の使用を説明するために行った歩行分析いくつかエンドフィリン突然変異系統と同様に、時代の進展と WT c57bl/6 j マウスに市販の計測器とソフトウェアを使用して (テーブルを参照してくださいの材料)。このセットアップでは、透明なトレッドミルの下の高速カメラはマウス (図 1 a) の実行を記録します。ソフトウ?...

ディスカッション

神経変性疾患、特に PD 運動協調性は深刻な影響を受けるのような病気のためのモデルの特性評価に有用なアプローチは、運動の協調性を学ぶします。運動歩行分析の機能分析の助けを借りて、我々 は弱い神経変性とそれ故に比較的控えめな表現型歩行問題の発症で動物の歩行またはモデルの微妙な変化を識別できます。小さな歩行異常、重度の運動障害を含む神経変性疾患の様々 なモデル?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
DigiGait	Mouse Specifics, Inc., Framingham, Massachusetts, USA		DigiGait Imager and Analysis Software are included with the hardware
non-transparent blanket or dark cloth			cover the test chamber to reduce the animal's feeling of exposure/stress
balance	e.g. Satorius		balance with 0.1 g accuracy and a maximum load of at least 100 g
red finger paint	e.g. Kreul or Staedtler		for increasing the contrast between paws and animal’s body
small paint brush			soft brush to apply finger paint to the animal paws
diluted detergent			for cleaning
disinfectant, e.g. Meliseptol or 70% ethanol	e.g. B.Braun		for desinfection