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要約

多能性幹細胞から特殊な網膜細胞の生産は、網膜疾患の幹細胞を用いた治療法の開発のターニング ポイントです。本稿は、並進、基礎および臨床研究のオルガノイドの網膜と網膜色素上皮の効率的な生成の単純な方法をについて説明します。

要約

特殊化した細胞から多能性幹細胞の生産には、再生医療のための新しいアプローチを開発する強力なツールが用意されています。人間誘導された多能性幹細胞 (Ips) の使用は、iPSC 由来網膜細胞モデルが理解し失明を戦う主要な一歩前進をマーク網膜ジストロフィーを含む神経変性疾患研究に特に魅力的です。生成、成熟、および網膜オルガノイドを凍結するシンプルかつスケーラブルなプロトコルについて述べる。媒体を変更するに基づいて、このメソッドの主な利点は複数を避けるために、時間のかかる手順は、Ips の誘導分化で要求される一般的。付着性人間 iPSC 文化に定義されているメディアの継時的変化による網膜の開発の初期の段階を模倣、このプロトコルにより上方構造と網膜色素上皮 (RPE) 細胞を自己形成の同時発生、4 週間で再現性のある、効果的な方法。これらの構造体を含む網膜前駆細胞 (Rpc) は、Rpc の大人の人間の網膜内にある 7 網膜細胞型への分化を有効に浮遊培養条件でさらに成熟簡単に分離できます。また、網膜オルガノイドの凍結保存法と長期保存のための網膜色素上皮細胞について述べる。一緒に組み合わせることで、ここで説明する方法は、銀行の iPSC 由来網膜細胞または基礎・臨床研究のためのティッシュを制作し役に立つでしょう。

概要

網膜は中枢神経系 (CNS) の不可欠な部分で、自発的に次の外傷性の傷害または病気を再生する限られた容量。したがって、糖尿病網膜症、緑内障、網膜色素変性症 (RP) 加齢に伴う黄斑変性症 (AMD) などの決定的な網膜細胞の損失を引き起こす退行性の病態は、通常、不可逆的な失明に します。変性網膜を救出、破損したまたは失われた細胞を置き換えることを目指して幹細胞ベースの治療が最も有望なアプローチ1,2,3の 1 つで、主要な課題です。ヒト胚性幹細胞 (Esc) 細胞と多能性幹細胞または人間誘導された多能性幹細胞 (Ips) は、文化では、無限に拡張する能力を持っているし、任意のセルの種類を生成する可能性があります。網膜の開発の私達の理解と体外の改善の進歩人間 iPSC 分化がにより網膜 organoids7,8,9の生成のためのプロトコルします。 10、11,12。主要な網膜細胞、網膜神経節細胞 (Rgc)、光受容体、網膜色素上皮 (RPE) 細胞などのすべてが人間 Esc と Ips4,ので5,から正常に分化されている6. 永楽らによって開発された SFEB (胚様体のような骨材の無血清培養) 法に基づく13、網膜オルガノイドの自己形成は、定義された細胞外マトリックス成分7,10,14esc キーまたは iPSC 由来胚様体のような集計から入手できます。しかし、これらのプロトコルは複雑な治療法や創薬スクリーニングのため細胞の大量生産と常に互換性がないステップの多数を必要とします。したがって、人間の網膜の細胞を生成するメソッドの選択が重要とメソッドは、堅牢で拡張性が高く、かつ効率的なする必要があります。

ここでは、当社の以前の文書15に基づいて、我々 はフィーダー、xeno フリー状態で栽培される付着人間 Ips から網膜における自己形成を通じて網膜細胞のシンプルかつ効率的な世代のため各ステップをについて説明します。付着性人間 Ips の日常文化から始まって、このプロトコルは 4 週間で iPS 由来 RPE (hiRPE) 細胞と上方の構造の両方の世代を変更する単純な連続媒体のみを必要があります。手動分離後 hiRPE を展開して網膜の構造は浮動 organoids 網膜前駆細胞が生体内で人間と一貫性のある順番にすべての網膜細胞のタイプに区別することで培養できます。retinogenesis。最後に、研究の進歩や臨床の翻訳は、彼らの表現の特性と機能に影響を与えずに網膜全体 organoids と hiRPE 細胞の長期貯蔵を許可する凍結方法をについて説明します。

プロトコル

このペーパーで説明したプロトコルの Institut de la ビジョンの研究倫理委員会のガイドラインに従います。Institut de la ビジョンは、現在のフランス語の規則に従って人間の標本の操作を許可されています。検体の取り扱い"Comité デ保護デ Personnes (CPP) イル V"の倫理的な承認後にヘルシンキの教義に従って患者データ保護と国民の規則に従います。

1. 文化メディアと料理の準備

  1. 文化メディア
    1. IPSC 媒体、専用のフィーダー無料条件16多能性幹細胞の培養に化学的に培地を使用します。製造元のプロトコルに従って媒体の 500 mL を準備します。
    2. 使用基底 iPSC (Bi) 媒体 iPSC は化学的に線維芽細胞成長因子 2 (FGF2) や変形の成長要因ベータ (β) なし媒体を定義されています。
    3. 500 ml 1 %n2 サプリメント (BiN2 中)、Bi 培の 10 単位/ml、ペニシリンとストレプトマイシンの 10 mg/mL。
    4. 視覚 N2 ベース (ProN2 中) からなる媒質の DMEM:Nutrient 混合 F-12 (DMEM/f12 キーを 1:1、L グルタミン)、1% メモリ必須でないアミノ酸、1 %n2 サプリメント、10 単位/mL ペニシリンとストレプトマイシンの 10 mg/mL の 500 mL を準備します。
    5. 視覚 B27 ベース メディア (ProB27 中) を DMEM:Nutrient 混合 F-12 (DMEM/f12 キー、1:1、L グルタミン)、1% メモリ必須でないアミノ酸の構成の準備、2 %b27 を補う、10 単位/mL ペニシリンとストレプトマイシンの 10 mg/mL。
  2. 培養容器の準備
    1. 人間 iPSC 文化の
      1. ビトロネクチン溶液 5 μ g/mL の 1x PBS でビトロネクチンの 10 mL を準備します。10 mL の 1x PBS、解凍ビトロネクチン原液 (100 x) の 100 μ L を追加します。
      2. 0.5 μ g/cm2に対応する 6 cm 培養皿ごとビトロネクチン溶液 2 mL を配布します。それを室温 (RT) で 1 時間インキュベートします。真空吸引システムまたは 5 mL ピペットを使用して誤嚥によるビトロネクチン ソリューションを削除します。
      3. 6 cm 皿あたり iPSC 培地 4 mL を追加します。
      4. 料理使用前に 30 分以上の 37 ° C、5% CO2セル文化のインキュベーターで孵化させなさい。
    2. 人間の iPSC 由来 RPE (hiRPE) 細胞培養
    3. 製造元のプロトコルによると井戸をコートするのに多能性幹細胞修飾マトリックスまたは基板を使用します。十分なマトリックスまたは全体の成長の表面領域をカバーする基板を追加します。たとえば、よく 24 ウェル プレート、T-25 cm2フラスコで行列の 3 mL あたり行列の 300 μ L を入れてください。
    4. 37 ° C で 1 時間の最小値のためコーティング培養容器を孵化させなさい真空吸引のシステムまたは 5 mL ピペットを使用してマトリックスを削除します。
    5. 24 ウェルプレートのウェルあたり ProN2 培地 1 mL を追加し、暖かいし、媒体を平衡に 30 分間の最小値のためのインキュベーターに培養器を戻ります。T-25 cm2フラスコ、5.2 を参照してください。

2. メンテナンスおよび拡張の人間の Ips

  1. 人間 Ips のメンテナンス
    1. IPSC 15 mL チューブ中の 3 mL を準備し、使用前に 15 分以上の RT でそれを維持します。1.2.1 に従ってコーティング 6 センチメートルの皿を準備します。
    2. 30 37 ° C の水浴中で-150 ° C のフリーザーまたは液体窒素タンクから人間 Ips の極低温サンプルを解凍 s。
    3. 慎重に消毒消毒液スプレーを使用してセラム。室温で加温 iPSC 媒体の 3 mL を含む 15 の mL の管に、cryotube から解凍人間 Ips を転送します。
    4. 3 分間遠心 110 x g でチューブ吸引真空吸引システムまたは 5 mL ピペットを使用して上清を削除します。
    5. IPSC 培地 2 mL ピペットを使用してビトロネクチン コーティング 6 cm 培養皿から 1 mL の細胞ペレットを再懸濁し、セルを皿に転送します。24 h 以上の 37 ° C、5% CO2インキュベーターに媒体を変更する前に皿を戻ります。
      注: ROCK 阻害剤の Y-27632 10 μ M でなどは、アポトーシスを抑える 6 cm 培養皿で iPSC 媒体に追加できます。
    6. 毎日媒体を変更し、毎週ヒトの Ips を渡します。
  2. 人間 Ips の継
    1. 7 日間の培養後古典的な 70-80% の合流点で人間の iPSC を渡します。
    2. 1.2.1 の手順で説明されているように継 6 cm 料理を準備します。合流 Ips で皿から iPSC 媒体を削除し、室温 6 分間解離液 2 mL を追加
      注: インキュベーション時間は iPSC クローンに依存します。スタートとして 6 分インキュベーションをしてみてください。
    3. 真空吸引のシステムまたは 5 mL ピペットを使用して解離ソリューションを削除し、iPSC 培地 2 mL 加温した再懸濁しますで iPSC 植民地 1,000 μ L ピペットで 5-10 倍上下それらをピペッティングでを追加します。
      注意: は、過剰なピペッティングから単一細胞解離を避けます。
    4. 新しい 6 cm 培養皿で再懸濁細胞塊の 30 を 200 μ L を転送します。24 h 以上の 37 ° C、5% CO2セル文化インキュベーターに媒体を変更する前に皿を戻ります。
      注: 再懸濁細胞塊の通過に必要な量は、iPSC クローンに依存します。
    5. 毎日媒体を変更し、毎週ヒトの Ips を渡します。

3. 網膜オルガノイドの世代

  1. 植民地が 60-70% の合流点 (図 1 b) に達したら、図 1 aに描き出しましたプロトコルに従う iPSC 分化を開始します。
  2. 6 cm 皿あたり Bi 媒体の 4 mL を準備します。37 ° c. に Bi 媒体をウォーム アップします。IPSC 媒体を双方向メディアに変更します。0 (D0) の日として、この時間に注意してください。
  3. D2 で Bi 培地での文化を以前 37 ° C で暖め、BiN2 中に切り替える2-3 日毎に媒体を変更します。
  4. 図 1に示すように, 神経上皮芽によって創発的自己形成網膜オルガノイドを識別する-1E。
    注: 光学カップに、発達段階に対応するこれらの初期網膜 organoids は下流の実験のため手動で分離できます。

4. 網膜オルガノイドの成熟

  1. D28、準備 ProB27 培最初 FGF2 の 10 ng/ml の 4 mL/井戸を含む 6 ウェル プレート (図 1 a)。
    注: は、プレートにメディアを追加する前にすぐに融合 FGF2 を追加します。
    注意: FGF2 フィルターを適用しません。
  2. 6 cm 料理から網膜構造を手動で回復します。図 1Eに示すように針と上皮細胞内芽のまわりを垂直縞を作る構造を分離し、そっと針でそれらをスクラッチして、オルガノイドをデタッチします。
  3. 1,000 μ L ピペットを使用して 10-15 オルガノイドを吸引し、ProB27 媒体を含んでいる 6 ウェル プレートの単一の井戸のそれらを転送します。
  4. ProB27 中細胞文化のインキュベーターで浮遊培養条件で 37 ° C、5% CO2で網膜オルガノイドを維持します。培地の半分に 2 〜 3 日ごとを変更します。
    注: は、D35 まで FGF2 とオルガノイドを扱います。
  5. D35 で培地の半分を削除し、FGF2 なし 37 ° C で新鮮な prewarmed ProB27 媒体を追加します。
  6. 培地の半分に網膜のセルタイプの出現によると必要な網膜細胞の種類を取得する必要が、図 2で示した時間の間に 2 〜 3 日ごとを変更します。

5 世代と増幅人間 iPSC 由来網膜色素上皮 (hiRPE) 細胞

  1. 人間 hiRPE 細胞の生成
    1. 植民地が3 a を図の図式プロトコルに従う、60-70% の合流点に達したら、Ips を分化に従事します。
    2. 双方向メディアの 6 cm 皿あたり 4 mL を準備し、37 ° C で Bi 媒体を温めるIPSC 媒体を双方向メディアに変更します。0 (D0) の日として、この時間に注意してください。
    3. D2 で Bi 培地での文化を 37 ° C で暖められた以前 BiN2 媒体に切り替える2-3 日毎に媒体を変更します。
    4. D28 で媒体を図 3 aに示すように以前、37 ° C で暖められた新鮮な ProN2 ミディアムに変更します。
      注: この手順は、手順 4 で説明した organoid ピッキング後行うことができます。
    5. 2-3 日毎に ProN2 媒体を変更します。
    6. D42 で図 3Bに示すように、色素性パッチの観測による創発的 hiRPE セルを識別します。
      注: hiRPE 細胞の色素沈着は、iPSC クローンによって D56 に D35 間表示されます。
  2. HiRPE 細胞の増幅
    1. D42 で以前手順 1.2.2 マトリックスでコーティングし、ウェルあたり ProN2 培地 1 mL を含む 24 ウェル プレートを準備します。使用する前に CO2を 37 ° C、5% でインキュベーターで 15 分のプレートを配置します。
    2. 6 センチメートルの皿から hiRPE パッチを手動で回復します。パッチを分離、色素上皮を針で垂直紋を行い、慎重に針を掻くことによってシートを切断します。1,000 μ L ピペットを使用して色素の 10 のパッチを吸引し、24 ウェル プレートの単一の井戸のそれらを転送します。
    3. 媒体を変更する前に 48 h の CO2を 37 ° C、5% で ProN2 中細胞文化のインキュベーターで hiRPE パッチをしてください。0 (hiRPEp0) としてこの hiRPE 細胞の一節に注意してください。ProN2 培地で 2-3 日毎に媒体を変更します。
    4. HiRPEp0 セルを渡すという、セルが合流。
      1. 真空吸引システムを使用してメディアを削除し、5 mL のピペットを使用して PBS の 1 mL でも 1 x を洗ってください。
      2. 真空吸引システムを使用して PBS を破棄、0.25% トリプシンの井戸あたり 200 μ L を追加し、37 ° C でインキュベーターで 15 分以上インキュベートトリプシンを不活化する ProB27 媒体の 800 μ L を追加します。
        注: トリプシン処理を停止する ProN2 媒体の使用はお勧めしません。
      3. それを上下にピペッティングによる hiRPE 細胞のシートを切り離して考えます。15 mL チューブに細胞懸濁液を置き、110 x g で 5 分間遠心します。
        注: ProB27 中の過剰を削除する ProN2 メディア追加洗浄を行うことができます。
      4. 上澄みを除去し、37 ° C に加温 ProN2 培地 2 mL に優しく細胞ペレットを再懸濁します細胞カウンターでセルをカウントします。
      5. 125 万の細胞を取るし、マトリックス コーティング T-25 cm2フラスコに置いて (手順 2.2.2 参照) ProN2 培地 5 mL を含む 37 ° C に加温1 (hiRPEp1) としてこの hiRPE 細胞の一節に注意してください。
    5. 媒体を変更する前に 48 h の CO2を 37 ° C、5% で細胞文化のインキュベーターで ProN2 中の hiRPE 細胞を維持します。
    6. 2-3 日毎にメディアを変更します。HiRPEp1 細胞が合流点に達したら、次の通路または凍結保存を実行します。

6. 網膜 Organoids と hiRPE 細胞の凍結保存

  1. 網膜全体オルガノイドの
    1. 5 に 20 網膜 organoids、ピペットを使用してを選択し、極低温バイアル内に配置します。チューブの下部オルガノイドを触れることがなく 1,000 μ L ピペットを持つ任意の余分なメディアを削除し、冷たい凍結保存中の 250 μ L を追加 (材料の表を参照してください)。
    2. 4 h の転送の最小-80 ° C のイソプロパノール ベースの凍結容器でバイアル-150 ° C のフリーザーや長期保存用液体窒素タンクに凍結バイアルをフリーズします。
  2. HiRPE セル
    1. 通路 1、セルが合流 hiRPE 細胞を分離します。
      注: hiRPEp0 細胞の凍結保存はお勧めできません。
    2. 真空吸引システムを使用して T-25 cm2フラスコから培地を吸引し、それを洗って 3 mL の 5 mL のピペットを使用して PBS で 1 x。
    3. 真空吸引システムを使用して PBS を削除、0.25% トリプシンの 1 mL を追加し、37 ° C でインキュベーターで 15 分以上インキュベートトリプシン処理を停止する ProB27 培地 5 mL を追加します。
      注: トリプシンを不活化する ProN2 媒体の使用はお勧めしません。
    4. 10 mL のピペットを使用して上下ピペッティングによる hiRPE 細胞のシートを切り離して考えます。細胞カウンターにセルをカウントします。15 mL チューブに細胞懸濁液を置き、110 x g で 5 分間遠心します。
      注: ProB27 中の過剰を削除する ProN2 メディア追加洗浄が行えます。
    5. 真空吸引を使用して上清を吸引し、軽く 200 万細胞凍結保存中の 250 μ L を取得する細胞を再懸濁します。
    6. 転送極低温バイアルあたり細胞懸濁液を 250 μ l 添加します。4 h の最小-80 ° C のイソプロパノール ベースの凍結容器でバイアルを凍結します。
    7. -150 ° C のフリーザーや長期保存用液体窒素タンクに凍結バイアルを転送します。

7. 融解網膜オルガノイドの hiRPE セル

  1. 網膜全体オルガノイドの融解
    1. 37 ° C で温かい ProB27 媒体 (2 mL セラム チューブごとに必要となります)。
    2. -150 ° C のフリーザーまたは液体窒素タンク、極低温バイアル網膜 organoids 37 ° c の水浴中 30 s. 駆除の消毒液スプレーを使用して慎重にセラムを解凍します。
    3. バイアル、予め温めておいた ProB27 培地 1 mL を追加します。転送ピペットを 1.5 mL チューブに、オルガノイドを転送します。
    4. チューブの底の網膜の構造に触れることがなくピペッティング媒体をそっと取り外します。予め温めておいた ProB27 媒体のより多くの時間 1 mL 1 オルガノイドを洗います。
    5. 転送ピペットを使い、オルガノイドを吸引し、ProB27 中で加温し、37 ° C、5% CO2でインキュベーターで平衡を含む 6 ウェル プレートの 1 で配置します。
      注: は、6 ウェル プレートのウェルあたり 10-15 網膜オルガノイドを配置します。
    6. 半分媒体の出現、に従って必要な網膜のセルタイプを取得する必要がある図 2で説明した時間の間に 2 〜 3 日ごとを変更します。
  2. HiRPE 細胞の融解
    1. 37 ° C で温かい ProN2 媒体 (8 mL セラム チューブごとに必要となります)。
    2. -150 ° C のフリーザーまたは液体窒素タンク、雪解けの hiRPEp1 細胞の低温サンプル 37 ° c の水浴に孵化によって 30 s. 駆除のセラム慎重に消毒液スプレーを使用します。
    3. チューブを開きと予め温めておいた ProN2 培地 1 mL を追加、予め温めておいた ProN2 培地 2 mL を含む 15 mL チューブに細胞懸濁液を転送します。それを 110 x g で 5 分間遠心します。
    4. 上澄みを除去し、37 ° C に加温 ProN2 培地 2 mL に優しく細胞ペレットを再懸濁します
    5. 細胞カウンターでセルをカウントします。
    6. 125 万の細胞を取るし、マトリックス コーティング T-25 cm2フラスコに置いて (手順 2.2.2 参照) ProN2 培地 5 mL を含む 37 ° C に加温この段階で 2 (hiRPEp2) として、通路に注意してください。
    7. 媒体を変更する前に 48 h の CO2を 37 ° C、5% で ProN2 中細胞文化のインキュベーターで hiRPEp2 細胞を保ちます。
    8. 2-3 日毎にメディアを変更します。HiRPE 細胞が合流点に達したら、次の通路または凍結保存を実行します。
      注: 培養 2 週間後支柱 800 万 hiRPE 細胞を収集できます。

結果

フィーダー無料条件16で培った人間 iPSC の差別化のための最初のステップです (図 1 a) の分化を促進する双方向の媒体を使用して自己複製機械をシャット ダウンします。双方向メディアを補完する D2 での Ips 細胞神経および網膜の系統へのガイドに N2 サプリメントで。この過程は D28 の周りで上方芽の外観につながります (

ディスカッション

このプロトコルでは、網膜色素上皮細胞と網膜 Rgc と xeno、フィーダー フリー条件のひと多能性幹細胞から視細胞を含む網膜のオルガノイドを生成する方法について説明します。ここに示すよい製造業練習 (GMP) プロセス、栽培法との互換性により、RPE 細胞、Rgc、幹細胞ベースの治療法や薬の開発のための視細胞と iPSC 由来の網膜細胞の大規模な生産網膜変性疾患の将来の治療発見アプローチ...

開示事項

サシャ ライヒマン、オリヴィエ ・ Goureau、ホセ ・ アラン ・ サヘルひと多能性幹細胞からの網膜細胞の生成に関連する特許発明に。

謝辞

著者は、彼らの重要な読書のため、ここで説明する方法と G. ガリアルディ M. Garita の設定時に、入力のための Goureau のチームのメンバーに感謝したいと思います。この作品は、ANR からの補助金によって支えられた (GPiPS: ANR-2010-RFCS005;SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02)、網膜フランス協会との技術移転会社船型研究 Lutech。それはまた Investissements d'Avenir プログラム (ANR-11-アイデックス-0004-02) 内で ANR 支え LABEX LIFESENSES (ANR-10-LABX-65) のフレームで行われました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, TruncatedThermoFisher ScientificA14700Coating
CTS Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, TruncatedThermoFisher ScientificA27940Coating
Essential 8 MediumThermoFisher ScientificA1517001medium
Essential 6 MediumThermoFisher ScientificA1516401medium
CTS (Cell Therapy Systems) N-2 SupplementThermoFisher ScientificA1370701supplement CTS
N-2 Supplement (100X)ThermoFisher Scientific17502048supplement
B-27 Supplement (50X), serum freeThermoFisher Scientific17504044supplement
CTS B-27 Supplement, XenoFreeThermoFisher ScientificA1486701supplement CTS
DMEM/F-12ThermoFisher Scientific11320074medium
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)ThermoFisher Scientific11140035supplement
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)ThermoFisher Scientific15140122antibiotic
CellStart CTSThermoFisher ScientificA1014201Matrix CTS
Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane MatrixThermoFisher ScientificA1569601Matrix
Gentle Cell Dissociation ReagentStemcell Technologies7174dissociation solution
Cryostem Freezing Mediaclinisciences05-710-1DCryopreservation medium
Fibroblast growth factor 2 (FGF2)Preprotech100-18BFGF2
Fibroblast growth factor 2 (FGF2) animal freePreprotechAF-100-18BFGF2 Xeno free
AGANI needle 23GTerumoAN*2332R1Needle
Flask 25 cm² Tissue Culture TreatedFalcon353109T-25 cm²
24 well plate Tissue Culture TreatedCostar352624-well plate
6 well plate Tissue Culture TreatedCostar35166-well plate

参考文献

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