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要約

このプロトコルでは、GC-MS ベースのメタボローム解析のショウジョウバエ幼虫を準備する方法について説明します。

要約

メタボローム解析の分野の最近の進歩は、動物の代謝を研究するための強力な遺伝モデルとしてミバエショウジョウバエを確立しています。中間代謝の大 swaths を調査する能力を持つショウジョウバエ遺伝学的ツールの広大な配列を用いてメタボロミクス アプローチは、食事療法、遺伝子型、生活史のイベント、および環境手がかりとの間の複雑な相互作用を明らかにできます。さらに、メタボロミクス研究は酵素機構を発見し、一見異なる代謝経路間の未知の接続を明らかにできます。ショウジョウバエのコミュニティの間でこの技術のより広範な使用を促進するためにここで提供・ ガスクロマトグラフィー質量分析 (GC/MS) のショウジョウバエ幼虫サンプルを準備する方法について説明します詳細なプロトコル-メタボローム解析を用いた。我々 のプロトコルでは、幼虫の標本、代謝物抽出、化学誘導体化ガスクロマトグラフィー質量分析について説明します。このプロトコルを正常に完了は、解糖系と TCA サイクルに関与する有機酸、糖、アミノ酸を含む小型の極性代謝産物の相対量を測定できます。

概要

ミバエショウジョウバエは中間代謝を調節する分子機構を研究するための理想的なシステムとして浮上しています。ショウジョウバエやヒトの間保存ほとんどの代謝経路しかキー栄養センサーと成長レギュレータ、インスリン、Tor は、myc などが飛ぶ1,2で活躍も。その結果、糖尿病や肥満神経変性疾患やがんに至るまでの人間の病気の新陳代謝の基礎を探検するショウジョウバエを使用できます。この点で、ショウジョウバエ幼虫の発育は、好気性解糖作用または Warburg 効果として知られている代謝のプログラムを研究するための最適なフレームワークを提供します。同様に多くの腫瘍は、炭水化物からのバイオマスを生成する好気性解糖系を使用、だからショウジョウバエ幼虫をアクティブにして発達成長3,4,5を促進する好気性解糖系。幼虫の間これらの類似性と腫瘍代謝の理解方法有酸素の主要モデルとしてのショウジョウバエを確立規制生体内では、解糖系。

ハエが代謝を研究するための人気のあるモデルとして浮上しているにもかかわらず、ショウジョウバエ研究のほとんどは、個々 の代謝物3トレハロース、トリグリセリド、ATP などを測定するために設計されている方法に依存します。特定のプロトコルはそれぞれの代謝産物を測定する必要があるので試金ベースの研究、労働集約的な高価であり商業キットを使用して測定することができますこれらの化合物に向かってバイアスをかけた。これらの制限事項の解決策は、ショウジョウバエ代謝を勉強してより効率的かつ公平な手段を提供するメタボロミクスのフィールドから浮上しています。試金ベースの研究とは異なり単一のメタボローム解析は同時に数百の低分子代謝物を測定し、生物の代謝状態6、7の包括的な理解を提供できます。この手法は大幅ショウジョウバエ代謝の研究の範囲を拡大している、この新興分野8の未来を表します。

メタボローム研究は主に 3 つの技術を使用して実施した: (i) 核磁気共鳴 (NMR)、(ii) 液体クロマトグラフィー-質量分析 (LCMS)、および (iii) ガスクロマトグラフィー-質量分析法 (GC/MS)9。それぞれのアプローチ、明確な長所と短所、およびこれらの技術のすべては正常にショウジョウバエ代謝を研究に使用されています。以来、当研究室の研究は小さい、円形状の代謝に焦点を当てて、私たちは主に GC ・ MS ・ ベースの手法を採用しています。GC-MS 数再現性が高く、ピークの解像度、感度などの利点を持つユーザーを提供していますの迅速な同定では、標準的な電子衝撃 (EI) スペクトル ライブラリの可用性発見代謝機能10,11。GC-MS のサンプルの準備は多少複雑し、細部にまで細心の注意が必要です。収集、洗浄、および重量を量った、代謝反応を迅速に消光方法で凍結する必要がありますサンプル。さらに、ハエの死骸は標準的な均質化のプロトコルに耐性があるように最適な代謝物抽出ビーズミルを必要とします。最後に、ガスクロマトグラフィー質量分析したサンプルは検出12前に化学的誘導体化を受ける必要があります。以前に発行されたメソッドは、すべてのこれらの手順3,13,14記述、再現性をもって高品質データを生成する初心者ユーザーことができますビジュアル プロトコルがまだ必要です。ここで GC MS メタボロミクス分析ショウジョウバエ幼虫サンプルを準備する方法を示します。このプロトコルでは、再現性をもって中央炭素代謝を構成する小さな極性代謝物の多くを測定することができます。

プロトコル

1. 卵のコレクション

  1. 成人男性と目的遺伝子の処女の女性を収集します。3-5 日間の年齢標準ブルーミントン メディアで食品瓶でこれらの動物を個別に。
  2. 新しい食品バイアルに 50 の処女の女性と男性 25 名を転送することによって適切な交配を設定します。
    注: 独立したわれわれの六つの最小値は、各遺伝子型を設定する必要があります。1 つだけのサンプルは、各交配 (すなわち、六つの独立した交配から収集された 6 サンプル) から収集されます。
  3. 糖蜜産卵キャップを準備します。
    1. H2O 2 L フラスコでの 700 ml 115 mL の糖蜜、寒天の 29 g を混ぜます。
    2. 糖蜜のホット プレート上の寒天培地の混合物を沸かしなさい。
    3. 70 ° C に冷却します。
    4. 酸ミックス (85% リン酸と 1 l H2O; の 209 mL プロピオン酸 20 mL の 25 mL を追加します。茶色のびんの店) と 95% のエタノールでは、10 %p ヒドロキシ安息香酸メチルエステルの 10 mL。
    5. 35 × 10 mm2細胞培養用ディッシュのフタと底の両方の部分に糖蜜寒天を注ぐ。
      注: 糖蜜に寒天を注ぐ、前に必ず蓋や 35 x 10 mm2プレートの基本が (ステップ 1.6 で説明)ショウジョウバエストック ボトルの口にぴったりを合わせて。使用板のブランドに応じてベースを使用できないがあります。
  4. 蒸留水を追加して貼り付ける新鮮な酵母をアクティブにするまで、混合物ドライ イースト (5 g 酵母/7 mL 水) なる固体表面 (すなわち、ピーナッツ バターの一貫性) を簡単に広げることができるペーストです。
  5. 糖蜜産卵キャップの表面にペーストを酵母の約 1.5 g を広めます。
  6. プラスチック 6 オンスショウジョウバエストック ボトル 22 G 針を使用しての反対側に 4 つの空気穴を突きます。
  7. 培養ボトルに食品バイアルから新しく合致のハエを転送します。
    注: ハエはどちらかによって転送できる CO2を使用して、一時的な麻酔薬としてまたはバイアル瓶の口の中の上部を押しながら鋭く、ベンチトップに対してボトルの底をタップします。
  8. すぐにショウジョウバエストック ボトルの口の中に表面に酵母ペーストと糖蜜産卵キャップを配置します。研究所テープを使用して、安全な場所で産卵キャップ。
    注記: ハエは転送する前に麻酔をした場合、ボトルを配置する水平ベンチトップすべてのハエが回復するまで。ハエが完全にモバイル、文化の下部に糖蜜産卵キャップ付きインキュベーターにボトルを置きます。
  9. ストック ボトルを反転、ベンチトップに対してボトルの底をタップ、古い卵キャップを取り外し、すぐに瓶の口に新しい卵の帽子を置くことによって最初の 2 日の日に少なくとも 1 回の糖蜜産卵キャップを取り付けます。古い産卵キャップを破棄します。
    注: この手順により女性が自分の卵を保持していないと同期集団のコレクションが可能します。
  10. 3 日 2 時間後置換後ストック ボトルに新しい産卵キャップを配置し、破棄します。4 時間後 2 回目の産卵のキャップを取り外して。日付、時刻、および遺伝子型を持つこの産卵キャップの下部にラベルを付けます。
    注: この 4 h ウィンドウ中に収集された卵は分析のために使用されます。この同期化手順は、特定の発達段階の分析に重要です。卵は数日間この方法で収集できます。
  11. 60 × 15 mm2ペトリ プレートと所望の温度と湿度がインキュベーターに場所に産卵キャップを挿入します。
  12. 産卵キャップは飢餓、人口密度や汚染の問題を毎日検査してください。
    メモ: 幼虫は継続的な発展を確保するための十分な食糧へのアクセスが必要です。必要に応じて、新鮮な酵母ペーストを実験で使用されるすべての産卵キャップを広げることができます。さらに、幼虫個体群密度が高すぎる、幼虫はさまよう培養プレートに始まります。高い人口密度と放浪しながら経験した飢餓の中間の発作は、一貫性のないデータになりますので、メタボローム解析のこれらのサンプルを使用しない必要があります。〜 80-100 の密度は中東第 2 齢幼虫 (L2) プレートごと、または 40-50 中間第 3 齢幼虫 (L3) 板あたりをお勧めです。目に見えない細菌やカビで汚染されているサンプルを破棄する必要があります。

2. 幼虫のサンプル コレクション

  1. 目的のステージまで幼虫を年齢します。L3 幼虫を収集する場合は、L2-L3 脱皮でサンプルを再同期します。再同期は発達マイルス トーン15として前方の気門を使用する前に説明したメソッドを使用してを実行して一般的です。また、半ば L3 幼虫はsgs3レポーター遺伝子16を使用して同期できます。
    注: この点で、我々 は見つける L2 半ば幼虫 (産卵後 ~ 60 h) は、幼虫の発育は比較的同期的にこの段階でほとんどの解析に最適です、慎重に収集されたサンプルは、この timepoint を開発する十分な食べ物を持っていると、サンプルごとのペット数は管理しやすい (下記参照) です。L3 開発中に発生する多数のエクジソン パルス代謝に劇的な効果を持っているし、同期されていない集団にアーティファクトが生成されますので、追加の同期ステップは L3 幼虫に必要です。
  2. フワリと寒天を酵母ペーストに解離性の針を使用します。新しい糖蜜寒天キャップに酵母を配置します。
    注: 糖蜜寒天と酵母ペースト間のインターフェイスでほとんどの幼虫を食べる。
  3. 小さなブラシを使用して、新たに公開された糖蜜寒天表面から幼虫を収集します。氷の上の 1.5 mL 遠心チューブに幼虫を配置します。
    注: 各発達段階のための適切なサンプル サイズは次のとおり: 50 1 齢幼虫 (L1);25 L2 半ば幼虫。20 初期 L3 幼虫。15 L3 半ばや後半の L3 幼虫。
  4. 洗浄し、大規模なサンプル セットを収集しながら小ロット (4 ~ 6 サンプル) のサンプル (ステップ 2.3 2.8 から) を凍結します。サンプルは、チューブで幼虫を配置する 20 分以内冷凍する必要があります。
    注: その他の管がステップ 3 のサンプル伝達と干渉するかもしれないのでエッペン 1.5 mL フレックス チューブを使用をお勧めします。Microfuge の管に採取する必要があります。3.1 の手順で記載されているビーズ チューブにサンプルを収集しません。セラミック ビーズは、不正確な質量測定の結果とサンプルに汚染物質を紹介食塩洗浄液を保持します。
  5. 冷たい 0.9 %1 mL を加える、管に蓋を閉めるし、幼虫を洗浄する徹底的にチューブを垂直方向に反転します。
  6. 〜 30 の氷の上に戻ってチューブを置く s。この時間の間に幼虫は、管の底に沈みますが、酵母懸濁液のままになります。すべての幼虫は、緩やかなペレットを形成している、一度は、NaCl 水溶液を 1 mL ピペットを使用してを削除します。
  7. ステップ 2.4 および 2.5 ステップを二度、繰り返すまたは最終的な洗浄ソリューションがするまでオフに。
    注: 追加の洗浄手順も採取試料に酵母の過剰な量が含まれている場合必要ことがあります。
  8. 遠心分離機の 4 ° C で 1 分間 2,000 × gでサンプル
  9. 200 μ L ピペットを使用してすべての残液を削除します。
  10. すぐに液体窒素でサンプルを凍結します。
    注: プロトコルをこの手順で一時停止できます。サンプルは-80 ° C で 3 ヶ月までに保存できます。

3. ビーズ チューブにサンプルを転送

  1. 各幼虫サンプルは 1.4 mm のセラミック ビーズを含む 2 mL タンパーエビデント チューブ 1.5 mL および microfuge の管から移らなければなりません。この転送手順の準備で、(蓋の上のマーキングが 4.4 のステップ中に破壊されます) 2 mL タンパーエビデント ビーズ チューブの側のラベルにエタノール証拠マーカーを使用します。
  2. 風袋 0.01 mg を正確に計測できる分析用天秤を使用してラベルの付いたビーズ チューブの質量。
  3. 幼虫のサンプルあった-80 ° C で保存されている場合は、転送する前に液体窒素でサンプル チューブを配置します。
  4. 液体窒素から 1.5 mL のサンプル チューブを削除する長い鉗子を使用してデュワー。
  5. ニトリル手袋をはめて、つかむ、凍結チューブ、反転、および冷凍のペレットを除去するベンチトップに対してチューブのふたを鋭くポンドします。すぐにペレットを 2 mL の事前 tared タンパーエビデント ビード管に注ぐ。ペレットは、除去に失敗した場合、チューブを液体窒素に戻るし、繰り返します。、
    注: 幼虫の餌がないすべての microfuge の管から取り除かれます。推奨以外の管を使用している場合は、幼虫の餌を分析用試料を収集する前に剥がれことができるかどうかを決定します。
  6. すぐに幼虫のペレット、ビード管を合わせた質量を測定します。すぐに液体窒素にサンプル チューブを配置します。幼虫の餌メタボローム データを正規化する質量が使用されます。
    注: プロトコルをこの手順で一時停止できます。サンプルは-80 ° C で 3 ヶ月までに保存できます。

4. サンプル抽出

  1. クーラー-20 ° C ベンチトップにサンプル チューブを配置します。
  2. 各チューブに 2 μ G/ml d4 コハク酸を含んでいる prechilled (-20 ° C) 90% のメタノールの 0.8 mL を追加します。-20 ° C ベンチトップのクーラーにサンプルを返します。
    注: d4 コハク酸を内部標準として提供しています。HPLC グレード H2O とメタノールのみ使用します。メタノール、有機溶剤は揮発性空気変位ピペットの使用を正確に測定することは困難、この手順と次の手順をすべての肯定的な変位のピペットの使用をお勧めします。
  3. 空ビーズ チューブに 2 μ G/ml d4 コハク酸を含んでいる prechilled (-20 ° C) 90% のメタノールの 0.8 mL を追加することによって陰性対照を設定します。
  4. 6.45 m/s の 4 ° C 温度制御室にあるビーズ工場ホモジナイザーを使用時の 30 秒サンプルを均質化します。
    注: 迅速かつ完全に幼虫の餌を均質化する失敗は、メタボロミクス解析における変動性の共通のソースです。のみ冷凍 30 内幼虫組織を破壊することが可能なホモジナイザーを使用 s。
  5. 均質化試料管を-20 ° C ベンチトップ クーラーに戻り、少なくとも 1 時間-20 ° C のフリーザーにそれらを孵化させなさい。
  6. 結果として得られる沈殿物を削除する 4 ° C で 5 分間 20,000 × gまたは最大速度でチューブを遠心します。
  7. 新しい 1.5 mL 遠心チューブに上清の 600 μ L を転送します。沈殿物は不可します。上清をピペッティングしながら沈殿物ペレットなり剥がれ場合、すべての上澄みをチューブに戻ります、手順 4.6。
  8. 真空遠心分離機のサンプル チューブを配置します。遠心分離機をシールする前に、すべてのチューブが開いていることを確認します。すべての溶媒を除去するまで室温でサンプルを乾燥 (このステップで通常かかる完了する 〜 16 h)。
    注: 必要に応じて、プロトコルはこの段階で休止できます。乾燥したサンプルは-80 ° C で保存できます。

5. 化学的誘導体化

  1. 乾燥のサンプルあった-80 ° C で保存されている場合、真空、遠心分離機で未開封のサンプル チューブを配置し、30 分間乾燥します。この手順は、サンプル チューブを開く前に実行する必要があります。
    注: この手順は、冷凍庫から削除されたときおよび microfuge の管の外側に収集結露を削除します。プロトコルのこの部分は H2O に非常に敏感、余分な予防措置は、可能な限りすべての試薬を濡れないように取られなければなりません。
  2. 40 mg/mL methoxylamine 塩酸塩 (MOX) 無水ピリジンの溶液を準備します。無水ピリジンを使用のみです。Mox 燃料とピリジン、デシケーターに保管し、毎日 MOX ソリューションを準備します。
    注意: MOX とピリジン、有毒です。発煙のフードでこのソリューションを準備します。
    1. 1 mL のガラス製注射器を乾燥させる熱銃を使用します。
    2. 無水ピリジンの瓶に注射器の針を挿入します。ピリジン 1 mL を削除し、mox 燃料の 40 mg を含むおよび microfuge の管を追加します。
    3. アルゴンを用いる無水ピリジンのボトルをフラッシュします。ボトルを密封し、デシケータに戻ります。
    4. 600 rpm で 10 分間に 35 ° C で熱ミキサーでチューブをインキュベートし、ピリジンで mox 燃料を溶解します。
  3. 乾燥のサンプルに無水ピリジン溶液中 40 mg/mL MOX の 40 μ L を追加します。
  4. 10 s と簡単に遠心分離機の渦 (10,000 × g 20 s)。
  5. 30 ° C 熱ミキサーで 600 rpm で 1 時間インキュベートします。
  6. 20,000 × gまたは粒子状物質を削除する 5 分の最大速度の遠心分離機します。
  7. 非アクティブになる 250 μ L ガラス微量挿入するとオートサンプラー バイアルに清 25 μ L を転送します。
  8. N- メチル -N- trimethylsilyltrifluoracetamide (MSTFA) を含有 1% を 40 μ l 添加のクラブ。
    注意: MSTFA は有毒です。発煙のフードには、この手順を実行します。
    注: 可能な場合、この手順はオープン オートサンプラーで完了ことができます。
  9. オートサンプラー バイアルのキャップを置き、クリンパ ツールを使用して密封します。
  10. 37 ° C でサンプル間揺れ (250 rpm) で 1 時間インキュベートします。
  11. 以前 desceribed3脂肪酸のメチル エステル標準 (FAMES) ソリューションを準備します。直前に注入ロボット オートサンプラーを使用してオートサンプラー バイアルに FAMES の 3 μ L を追加します。
    注: FAMEs、保持時間シフトを調整し、計測器の性能を確認する使用されます。ロボットのオートサンプラーを使用しない場合は、段階 5.8 FAMEs を追加できます。

6. GC-MS 検出

注: ほとんどの場合、ユーザーを行いますこの手順質量分析の中核施設の支援を受けて。このプロトコルは、30 m、5 m のガードカラムの GC カラムで使用する設計されています。

  1. サンプル順序をランダム化します。
  2. GC-MS を準備します。
    1. セット 1 mL/分にヘリウム キャリア ガス流量。
    2. 入口温度を 250 ° C に設定します。
    3. 次の温度勾配を実行する GC をプログラムします。
      1. 初期温度 95 ° C 1 分保持します。
      2. 2 分のホールドで 40 ° C/分の速度で 110 ° C に温度を上げます。
      3. 5 ° C/分ランプで 250 ° C に増加します。
      4. 4 分の最終的な把握と 25 ° C/分の速度で 330 ° C に増加します。
    4. 3.5 分溶媒の遅延を設定します。
      注: 時間は、GC-MS のシステムによると変更できます。この手順の目的は、検出器の損傷から MSTFA と MOX を防ぐためです。
  3. Derivatized サンプルの 1 μ L を (10:1 の比率に分割) GC/MS に注入します。
    注: は、ピークの強度が低すぎる場合に 2 μ L のサンプルを挿入します。サンプルの注入の順序をランダム化する必要があります。
  4. 動作フルスキャン モードで質量質量範囲 50-500 m/z。

7. データ解析

  1. ターゲットや不特定多数に向けたアプローチを使用してメタボローム データを分析します。ターゲットを絞った分析は以下述べる乳酸測定などの代謝物質の定義されたセットの豊富さを測定に焦点を当てた。対照的に、不特定多数に向けた解析は、2 つのサンプルのセット間で大きく変更は任意の代謝機能を識別するために公平なアプローチを使用します。
    注: 当研究室主とを使用無料のプログラム MetAlign17 MetaboAnalyst18,19データ分析のため。ユーザーをデータ処理20,21に専念して、詳細なプロトコルを我々 参照してください両方品質管理、正規化、およびデータ処理手順の十分な説明は本稿の範囲外なので 22。さらに、この分析に必要な手順を説明するフローチャート見つけることができます他の場所で8。

結果

乳酸脱水素酵素dLDH 活動4、および遺伝的にマッチさせた対照群がない突然変異体 (dLDH) L2 半ば幼虫採集し、上記のプロトコルに従って処理されます。コントロールと比較すると、変異体幼虫は乳酸、ピルビン酸、L 2-ヒドロキシグルタル酸4で大幅な変更を表わします。スペクトルは、Agilent GC6890 5973i MS システムに買収されまし...

ディスカッション

メタボロミクスは、中間代謝を構成する代謝反応を調査するための比類のない機会を提供します。この技術の感度は、ただし、遺伝的背景、発達の指示、およびさまざまな環境ストレス、温度、湿度、人口密度、栄養アベイラビリティなどに影響を受けやすいデータを渡します。そのため、高品質で再現可能なメタボロミクス解析高度に制御条件下でサンプルを収集することが必要です。い?...

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

インディアナ大学質量分光施設とこのプロトコルの最適化の支援のためのユタ大学のメタボロミクス中核施設のメンバーに感謝します。J.M.T. は、によって、国立医学研究所の一般的な受賞番号 R35GM119557 の下で健康の国民の協会のサポートします。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Unsulfured blackstrap molassesGood Food, INC
Drosophila Agar Type IIGenesee Scientific66-103
PyridineEMD MilliporePX2012-7
Methoxyamine hydrocholoride (MOX)MP Biomedicals, LLC155405
MSTFA with 1% trimethylchlorosilaneSigma69478
Fleischmann’s Active dry yeastAB Mauri Food Inc2192
6oz Drosophila stock bottleGenesee Scientific32-130
Soft tissue homogenizing mix (2 mL tubes) Omni InternationalSKU:19-627
Vial insert, 250 µL deactivated glass with polymer feetAgilent5181-8872
Succinic acid-2,2,3,3-d4Sigma293075
SpeedVacThermo SC210A
o-Phosphoric acidFisher ScientificA242-1
Propionic acidSigmaP5561
p-Hydroxy benzoic acid methyl esterGenesee Scientific20-258
Bead RuptorOmni InternationalSKU:19-040E
ThermoMixer F1.5Eppendorf5384000012
MultiTherm Shaker with a 24 X 12 mm blockBenchmark ScientificH5000
MethanolSigma34860
1.5 mL centrifuge tubeEppendorf22364111
Falcon 35 X 10 mm tissue culture dishCorning Incorporated353001
GC columnPhenomexZB-5MSi

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