線虫ふるい: ローテク装置と小型の多細胞生物の並べ替えのための方法論

要約

現在のプロトコルを含むソートと年齢をマッチさせた集団のクリーニングの方法論線虫。それは研究用の線虫の実験的人口を取得するのに単純な安価なとカスタムメイドの効率的なツールを使用します。

要約

線虫(C. elegans) は基本的な生物医学の研究の範囲にわたって使用確立モデル生物です。線虫の研究コミュニティの中でc. の elegansの大規模な年齢をマッチさせた集団を維持する手頃な価格で効果的な方法の必要性があります。機械的に並べ替えと線虫のクリーニングの方法論を紹介します。私たちの目的は、均一サイズおよび実験での使用のためのライフ ステージの動物を取得するコスト効果の高い、効率的な高速、簡単なプロセスを提供することです。このツールは、線虫のふるいは、一般的な円錐ラボ チューブにスレッドし、線虫体サイズに基づいてを並べ替え特注蓋システムを使用してください。また線虫ふるい効果的にから転送する動物 1 つ培養プレート別急速な並べ替え、同期、および健康のマーカーに影響を与えることがなく洗浄できることを示す運動などストレス誘導性遺伝子記者。このアクセス可能な革新的なツールはc. の elegans個体群を維持するため高速で効率的、かつ非ストレスの多いオプションです。

概要

線虫、線虫はプレミア モデル生物です。研究室では、その栽培の簡単かつ制御された自然、に加えて彼らの全体のゲノムはシーケンス¹と各細胞の発生運命は²知られています。これらの機能により線虫は遺伝学的研究のため広く使用されているモデル生物です。しかし、これらの有益な特性と一緒にには、研究者のいくつかの課題を来る。彼らの急速な生成の時間、 c. の elegans集団食品のうち実行することができますすぐにおよび/または複数の世代の集団を混合になって、発達段階を一度に提示します。したがって、固体線虫成長媒体 (NGM) の実験は研究者が細菌の食料源を使い果たすし、新しい幼虫を開発する前に、新鮮なプレートに動物を物理的に移動する必要。子孫世代と混ざらないから実験集団を防ぐために必要な動物の頻繁に転送するよう、これは退屈なことができます。それでも、いくつかの実験には、両方の多数の動物と長時間ポイント (例えば、成人期に DNA または RNA の抽出) が必要があります。これは正確に同期の人口を維持して、動物の数が多いを転送の課題を化合物します。

NGM 上で培養した線虫を転送する現在の方法は、ピッキングや洗濯の動物プレート;化学的に (例えば、DNA 複製阻害剤フルオロデオキシウリジンまたは FUDR); 動物の治療またはウェルプレートで動物を並べ替えるにフローサイトメトリーを使用して。ピッキングには、個人または複数の動物^3,4を手動で転送する白金細線または、まつげで作られた手のひらツールの使用が含まれます。このメソッドの正確なが、スキルと時間が必要です、多数の動物の研究の制限。また 5 月を選ぶ可能性のある障害と力の不自然なと一貫性のない金額を個人をかけることによって物理的に有害な動物にストレスであります。洗濯と緩衝液の培養皿を洗浄し、新しい培養プレートにガラス パスツール ピペットで動物とソリューションを移すことを含みます。このメソッドでは複数の世代と動物の発達段階が一括で転送されるときに正確ではないが、迅速かつ効率的です。FUDR などの化学治療は、DNA 複製としたがって、配偶子の生産と卵の開発ブロックを介して子孫の生産を防ぐために養殖のメディアに溶解できます。しばらくの間効果的な正常発達プロセスを中断させないよう発達成熟後このメソッドを適用する必要があります、これはその管理³の前に動物を譲渡する必要がまだあることを意味します。このメソッドに複数携帯シグナル伝達経路、彼らの年齢として動物に顕著な影響の結果として (例えば、寿命延長または変更されたプロテオステイシス) c. の elegans使用^{5のひずみによっても影響します。 6,7,8,9,10}。フローサイトメトリー メソッドは自動的に並べ替えし、別¹¹1 つのウェル プレートから個々 のc. の elegansを転送します。この方法は非常に効果的かつ効率的な流れの cytometry の機器は高価であり、多くの研究者がアクセスできません。動物を転送する代わりに、温度に敏感、 fer 15や有限要素法 1、温度調整¹²と無菌になるなど突然変異体のモデルを使用します。突然変異動物の使用はいくつかの状況で役に立つ、これらの特定の系統の野生型の動物よりも遅い成長、エージングや健康的なワームの貧しい人々 の代表者として、変化のゲノムに依存しています。また、不妊を引き起こす温度シフトへの依存はまた静的な環境の欠如の結果、遺伝子表現^13,14,に影響を与える温度変化が容易に示されている¹⁵. 研究グループは以前のサイズ¹⁶ c. の elegansをフィルターするメッシュの使用を記述する技術を公開しています。しかし、このようなフィルターの使用と関連付けられるかもしれない全体的な健康の結果の変更テストの前の仕事を見つけることができませんでした。

こうして、線虫研究コミュニティ内で培養皿間動物の大きい数を転送するための手頃な価格、効率的、迅速、かつ正確な方法の必要性があります。(名前は線虫ふるい) 装置とその製造と線虫研究コミュニティのニーズを満たす操作の関連付けられているプロトコルの改良、アクセス可能な部分を開発しました。ここで、我々 は線虫ふるいとその使用方法の設計を共有し、一般的な健康または任意のストレス マーカー標準手動狩りと一般的使用、治療と比較した場合、その使用が影響しませんを紹介不妊治療を制限する化学 FUDR。

プロトコル

1線虫ふるいの構築とその利用。

1. 構築プロトコル
   1. 50 mL コニカル チューブ (図 1 a) から 2 蓋を取得します。
   2. (下の図 1 bから見た) ときに蓋の内側の唇の内側中心領域を削除するブンゼン バーナーと熱い金属プローブまたははんだごてを使用してまたはドリルを歩んだ。
      注: はプラスチック製の蓋をカットする熱を使用して怪我のリスクが軽減されるためブレードすることが望ましいです。
   3. きれいとカットエッジの砂そして湾曲したファイルや研削工具 (例えばドレメル) ロータリーで表面をトップします。図 1を参照してください。
   4. 適切な直径 (図 1) にモノフィラメント メッシュの円をカットします。このため、モノフィラメント ナイロン メッシュ シートの上にふたをトレースし、線のすぐ内側をカットします。
   5. 接着剤がプラスチック (図 1E) に適用される 2 つの蓋の密着力が向上する蓋の上面に溝/スラッシュをカットします。
   6. エタノールとの蓋をきれいにし乾燥させます。
   7. シアノアクリ レート系接着剤を外側の縁を維持する両方の蓋の上面に適用します。
      注: 少しの接着剤は、長い道のりを行きます。
   8. テーブル 1によるとモノフィラメント メッシュを 1 つ接着蓋 (図 1 階) に横たわっていた。メッシュの上に反転 2 番目のふたを配置します。両方の蓋はそのトップを一緒に必要です。しっかりと一緒に (図 1) を押します。メッシュを張ったことを確認します。
      注: 安全策、蓋にメッシュを配置する使用ピンセットとして。
   9. 一度接着剤の初期の層が乾燥している、蓋隙間の外側周囲にシアノアクリ レート系接着剤のリングを適用します。これは整合性を追加し、離れてまたは漏れている任意の剥離防止、寛大であります。
   10. モノフィラメント メッシュのメッシュ孔径フィルターをラベル付けします。
       注: ここでは、我々 使用 2 つのメッシュ孔径-20 μ m、50 μ m。
2. 使用プロトコル
   1. あらかじめふるいを濡れています。
      1. M9 などの食塩液をピペット [Na₂HPO₄の 6 g、KH₂PO₄1 L の純水 H₂O と MgSO₄ (1 M) の 1 つの mL の 3 g, 塩化ナトリウム 5 g]¹⁷、液滴フォームまでふるいの中心を通る、、凝縮してフィルターの下部 (図 2 a) の中心部に出る。必要に応じて、図形を下 (例えばキムワイプ) 糸くずのワイプを適用またはメッシュの水分液滴を広めます。
      2. 50 mL の円錐管にふるいを置きます。'廃棄物管' として管のラベル (図 2 b)。
   2. 寒天プレートにc. の elegansの人口を洗います。
      1. M9 バッファーを洗浄し、時 (図 2) モノフィラメント メッシュ 1 mL の甲板上でワームを含む媒体を配置します。メッシュの中心で動作することを確認します。プレートからすべてのワームを洗います。
         注: 通常、60 mm の板の M9 の 3 mL で十分です。
      2. 、ピペッティングで失われたワームの数を最小限に抑えるガラス パスツール ピペットを使用して (必要に応じて繰り返す) メッシュ中心にプレートからワームを移動します。
      3. 上から M9 バッファーが付いているフィルターをすすいでください。また、メッシュの中心で動作し、その地域のすべてのワームを洗浄することを確認します。すべての細菌や小さいワームは、メッシュを通過したことを確認する必要な回数だけを洗います。
   3. ふるいのサイズ一致動物を収穫します。
      1. 1.2.2.3 新しいコレクション チューブ (図 2 D) の内側に直面してのステップから大人のワームで、ふるいの上に新しい 50 mL のコニカル チューブを取り付けます。
      2. 最初 (廃棄物管) を削除し、すぐにふるいと液滴が移行するを防ぐために新しい管を裏返して (図 2 e)。
         注: 不妊が必要ない場合ワイプを使用糸くず (例えばキムワイプ) 芯液を反転する前にメッシュの底から。
      3. 新しい上面 (図 2 f) から新しい 50 mL のチューブに M9 を使用してメッシュをすすいでください。もう一度、メッシュ センターで動作し、メッシュの下側に液滴を維持します。
      4. 解決または優しくそれらをスピンダウンするワームを許可する (例えば、< 16 x g) 約 1 分 (図 2)。
      5. 下に理想的にワームは、ペレットから緩衝液を吸い出しなさい > 0.5 mL またはペレットを乱すことがなく、できるだけ多くの流体を削除します。
      6. ガラス NGM プレート上にパスツール ピペットを使用してワームのピペットし、乾燥させます。スペース複数液滴を新しいプレートにので、彼らはより高速な (図 2 H) を乾燥.
   4. ふるいをクリーンアップします。
      1. エタノールや逆浸透膜の水でやさしく、徹底的にふるいをすすぎます。乾燥させてください。
      2. 無期限の将来使用するための清潔な容器に保管してください。
      3. メッシュ「サグ」外観を開発するときは、それを破棄します。

2.線虫ふるい選別法の検証

1. 一般的なメンテナンス
   1. すべての実験の文化ワーム標準線虫成長媒体¹⁷ (NGM の 1 L で構成されています, 塩化ナトリウム 3 g、975 mL 二重蒸留水 1 mL 1 M CaCl₂のコレステロール 5 mg/mL の 1 mL の寒天培地の 17 g ペプトンの 2.5 g、1 M MgSO₄の 1 mL、1 M KHPO₄、25 mL と 100 mg/mL ストレプトマイシンの 0.5 mL) 25 ° C で
2. 実験的な治療管理
   1. 3 つの治療群の比較: ピック、フルオロデオキシウリジン (FUDR) と線虫ふるい。
      1. FUDR 治療グループのすべての子孫の生産を防ぐために 100 μ M の最終的な集中に NGM メディアに 100 mg/mL FUDR を追加し、ワーム一日おきを食糧の枯渇を避けるために新鮮な NGM プレートに転送します。
      2. ピックアップ グループの選択し、プラチナ ループを使用して手動でワームを転送します。
      3. 線虫ふるい治療グループの手順 1.2、NGM プレート上にワームをピペットします。
3. 線虫ふるい割合収量
   1. ふるいはc. の elegansのソートにどのように効果的な定量化する 25 の ° C を (すなわち、産卵後 48 h) で成人の 1 日に時代同期の N2 動物を成長し、新鮮な NGM プレートにそれらを選ぶことによって転送 (合計 N = 50 または N = トレあたり 100 動物atment グループ)。
   2. 回復の 24 h は NGM プレートに新しい人口を転送した後は、以下線虫ふるいとプロトコル (手順 1.2 参照) と正常に転送された動物の数をカウントします。
   3. 100 (%) を掛けた伝冒頭に開始番号と比較して転送される動物の数の比率としてパーセントの利回りを計算します。
4. Healthspan の試金
   注: スコア運動クラス、咽頭ポンプ速度と、前方と後方の穏やかなタッチ応答の両方の healthspan パラメーターを 2、4、6、および 8 歳同期 N2 動物 25 ° C で維持のため成人の日に
   1. 運動の追跡
      1. クラス ベースのシステム (クラス A、B、および C) に基づく運動スコアを割り当てる次のハーンらの方法¹⁸. 統計解析ソフトウェアで序数物流統計モデルを使用して 3 つの実験グループの効果を比較します。
         注: クラス A 個人は、通常、正弦波パターンで自発的に移動します。B クラス個人は著しく正弦波運動で移動し、肝いりの動きを奨励する必要があります。クラス C 催促に応えて彼らの頭や尾を移動が、寒天の間で移動することができます。
   2. 咽頭ポンプ速度
      1. 1 分の最終倍率 X 600 で実体顕微鏡下で視覚的に動物のターミナル咽頭電球のグラインダーの動きを数えます。
      2. Α で一方向の分散分析と統計解析の実施 = 0.05 とボンフェローニ後テスト α = 0.05。
   3. タッチレス ポンス
      1. 優しいタッチの応答を記録し、3 つの治療群間で比較します。カリクストらによって記述された手法に基づく試金を実行します。¹⁹。
      2. レコード前方と後方、そっと尾または動物の頭部 (5 x、交互の頭と尾) にわたって垂直まつげピックのストロークによって応答をタップします。
      3. 0 ~ 5 の規模で 1 ポイントとしてストロークの逆方向に前部・後部の応答の任意の動きを獲得します。
      4. Α で一方向の分散分析と統計解析の実施 = 0.05 とボンフェローニ後テスト α = 0.05。
5. 多産の試金
   1. 再生への線虫ふるいの影響の使用を決定するには、時代同期の N2 動物を 25 ° C で成人期の 2 日目に成長します。
   2. 60 h 卵を産むが後、転送プラチナ ピックと線虫ふるい NGM プレートに新しい動物、それらに回復する 4 h を与える (20-30 分のふるわれたプレートを乾燥する)。
   3. まつげを介して動物選ぶ NGM プレート プレート個別に回復後、卵を産むための 24 時間を与えるし、動物を削除します。別の 24 h の 25 ° C で通常の条件の下で開発する各プレートの子孫を許可します。
      注: まつげピックは人間のまつげマニキュア液をパスツール ピペットの最後に確保し、エタノールで消毒します。
   4. 実行可能な F1 世代の個体数を数えます。Α で T 検定を使用して統計分析を実行 = 0.05。
      注: 実行可能な子孫が正常に孵化し、幼虫の定期的サイクルを通じて彼らの開発を開始する卵としてと見なされます。
6. 蛍光レポーター ストレス応答の試金
   1. ストレスの潜在的なマーカーを検出するための 3 つの一般的に使用される蛍光レポーター アッセイを実行: ひずみ [TJ356-zIs356 (pDAF-16::DAF-16-GFP; rol 6)]²⁰; 細胞の核に DAF 16::GFP 転座hsp 16.2 式 [TJ375 gpIs1 (hsp-16.2p::GFP)]²¹;sod 3 式 [CF1553-muIs84([pAD76]sod-3p::GFP+rol-6[su1006])]²².
   2. 各試金のための文化 20 の ° C の 3 つの治療グループから時代同期の動物、成年期の 3 日目でそれらを調べて: 否定的なコントロールを使用して (日常的にプラチナ ピックを使って手動で動物のグループを移転)、(日常的に肯定的な制御、手動でプラチナを選ぶと確立されたストレス動物のグループを転送)、と線虫ふるい (篩を動物を通過し、イメージングの直前に NGM 上で 30 分間回復し)。
   3. DAF 16::GFP のアッセイで熱は²⁰をイメージングする前に 30 分の 37 ° C で肯定的な対照動物を衝撃します。Hsp 16.2 試金のため熱衝撃 90 分、²¹をイメージングする前に 20 h 肯定的な制御動物です。Sod 3 試金のため²²をイメージングする前に 4 h 100 mM パラコートと陽性対照動物を扱います。
   4. まつげを選ぶとすぐにワームを収穫し、ワームを動けなく 36% poloxamer 407 界面活性剤溶液 1 μ L を観察するそれらをマウントします。
   5. 別の coverslip でマウントされたワームをサンドイッチします。標準的なガラス顕微鏡スライド、画像 2 つ coverslips FITC フィルター (80 X の全体倍率) の倒立蛍光顕微鏡に 8 倍の倍率と一定の露出を使用してワームをマウントします。
   6. DAF 16::GFP 試金の 3 つのグループ間の違いを検出するには、DAF 16::GFP レポーター (原子力記者が細胞質と中間に位置する場合記者が核、細胞質へ転流する場合の位置に基づいて動物を分類します。記者核および細胞質の両方である)。
   7. 統計解析ソフトウェアの序数物流統計モデルを使用して結果を比較します。Hsp 16.2 と sod 3 式の試金は α で一方通行 ANOVA を使用 = 0.05 とテューキー投稿アドホックテスト α = 0.05 頭部領域の合計蛍光性を比較します。

結果

線虫ふるい 2 のスクリュー キャップの簡単な洗浄法を用いた生物の生きている人口を抽出するために使用目的の発達年齢の体径より不織布ナイロン モノフィラメント メッシュの領域を確保で構成されます。標準の円錐管に添付し、機械的にチューブでさらにメンテナンス及び実験 (例えば、転送または遺伝の収穫) を行う準備ができて希望の動物を残し...

ディスカッション

ここで、デザインと並べ替えと線虫を維持するためのツールとしてアクセス可能な効果的な線虫のふるいの使用を紹介しました。このツールには、手動で集団、化学処理 (例えばFUDR)、および分離動物のより高価な方法を洗濯、個々 の動物を狩りにいくつかの利点があります。まず、線虫ふるい効率的かつ迅速に (20 分以内) 動物 (表 2) の大規模な混合?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Safety glasses	Uline	S-21076
Protective heat resistant glove	Grainger	Item # 3AT17 Mfr. Model # 3AT17 Catalog Page # 1703
50 mL conical tube	Falcon	14-432-22
Synthetic Nylon mesh	Dynamic Aqua-Supply Ltd	NTX20 and NTX50
Cyanoacrylate glue	Scotch Super Glue Liquid	SAD114
Pliers	Vampliers	VMPVT-001-8
Dremmel tool with circular file	Lowe's	Item # 525945 Model # 100-LG
FUDR	Sigma	F0503
M9 chemicals ( NaCl, Na2HPO4, KH2PO4, MgSO4)	Sigma	S7653, RES20908-A7, 1551139, M7506
NGM plate chemicals (Bactopeptone, Agar, KH2PO4, K2HPO4, CaCl2,Cholesterol, Streptomycin)	BD Biosciences (bactopeptone) , Lab express (agar), Sigma ( rest)	BD bioscience 211677, Lab Express 1001,  Sigma 1551139, 1551128, C1016, C8667, S6501
Pluronic F-127	Sigma	P2443
Paraquat dichloride hydrate	Sigma	36541
Inverted fluorescence microscope	Olympus	FSX100