JoVE Logo
著者
お問い合わせ

サインイン

このコンテンツを視聴するには、JoVE 購読が必要です。 サインイン又は無料トライアルを申し込む。

この記事について

  • 要約
  • 要約
  • 概要
  • プロトコル
  • 結果
  • ディスカッション
  • 開示事項
  • 謝辞
  • 資料
  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

結核菌抗原の血清学的診断試験を改善するために、肺外結核を検出する超常磁性鉄ナノプローブを開発しました。

要約

超常磁性鉄酸化物(SPIO)ナノ粒子と結核菌表面抗体(MtbsAb)を含む分子イメージングプローブを合成し、肺外結核(ETB)のイメージング感度を高めた。SPIOナノプローブを合成し、MtbsAbと共役した。精製されたスピオ・ムトブアブナノプローブをTEMおよびNMRを用いて特徴付けた。プローブの標的化能を決定するために、SPIO-MtbsAbナノプローブをインキュベートしたインビトロイメージングアッセイ用に、Mtb接種マウスに注入し、磁気共鳴(MR)を用いたインビボ検査を行った。Mtb細胞およびTHP1細胞の磁気共鳴画像(MRI)のコントラスト増強減少は、SPIO-MtbsAbナノプローブ濃度に比例することを示した。Mtb感染マウスへの静脈内SPIO-MtbsAbナノプローブ注射の30分後、肉芽腫部位のシグナル強度は、PBS注射を受けたマウスと比較してT2加重MR画像で14倍増加した。MtbsAbナノプローブは、ETB検出のための新しいモダリティとして使用することができます。

概要

世界的に、肺外結核(ETB)は結核(TB)のかなりの割合を表す。それにもかかわらず、ETB診断は、その陰湿な臨床プレゼンテーションと診断テストのパフォーマンスの低下のためにしばしば見逃されたり遅れたりします。偽りの結果は、酸速いバチルに対する痰の塗抹標本、組織病理学上の肉芽腫組織の欠如、または培養性結核(Mtb)の欠乏を含む。典型的な症例に比べて、ETBは頻繁に起こりにくく、Mtbバチルの解放をほとんど伴う。さらに、通常は、リンパ節、胸膜、および骨関節領域1などのアクセスが困難な部位で局在化している。従って、細菌学的確認を危険で困難にする適切な臨床検体を得るための侵襲的な手順は、2、3、4に必須である。

ETBの市販の抗体検出テストは、その広い範囲の感度(0.00-1.00)と特異性(0.59-1.00)を組み合わせたすべての肺外部位に対して、臨床検出にとって信頼性が低い。インターフェロンγ、培養濾液タンパク質(CFP)、および初期分泌抗原標的(ESAT)の酵素結合免疫スポット(ELISPOT)アッセイは、潜在的および活性な結核を診断するために使用されている。しかし、結果はETB6、7、8を診断するための異なる疾患部位間で異なる。また、皮膚PPD(精製タンパク質誘導体)およびクワンティフェロン-TBは、偽陰性結果9をしばしば提供した。量子フェロン-TB-2Gは全血免疫反応性アッセイであり、これは、罹患した臓器からの検体を必要とせず、これを代替診断ツール6、10、11とすることができる。ポリメラーゼ連鎖反応のような結核髄膜炎に典型的に使用される他の診断方法は、臨床診断12、13を自信を持って排除するには依然として無神経である。これらの従来のテストは、肺外感染部位を発見するための不十分な診断情報を示す。したがって、新しい診断モダリティが臨床的に必要とされる。

分子イメージングは、生体内で疾患プロセスの特定の分子標的を直接スクリーニングできる新しいツールを設計することを目的としている14,15.超常磁性鉄酸化物(SPIO)は、T2重み付けされたNMR造影剤であり、磁気共鳴(MR)画像化(MRI)16、17の特異性および感度を有意に高めることができる。この新しい機能イメージングモダリティは、リガンド受容体相互作用を通じて分子レベルで組織変化を正確にスケッチすることができます。本研究では、新しい分子イメージングプローブを、SPIOナノ粒子を含み、ETB診断のためにMtb表面抗体(MtbsAb)と共役するために合成した。SPIOナノプローブは、検査18、19の下で組織および身体に対して最小限の侵襲性を示す。さらに、これらのナノプローブは、その常磁性特性のために低濃度で正確なMR画像を示すことができます。さらに、SPIOナノプローブは、鉄イオンの存在が正常な生理学の一部であるため、アレルギー反応を最も少なからず引き出します。ここで、ETBを標的とするSPIO-MtbsAbナノプローブの感度および特異性を、細胞モデルおよび動物モデルの両方で評価した。その結果、ナノプローブがETB診断用の超高感度イメージング剤として適用可能であることを実証した。

プロトコル

動物実験に関するすべてのプロトコルは、国立実験動物の管理および使用に関する衛生ガイドライン(第8版、2011)に従って、実験動物の繁殖のための標準的な操作手順に従い、によって承認されています制度的な動物のケアと使用委員会。

1. SPIOナノ粒子合成

  1. デキストランコーティングされた酸化鉄磁性ナノ粒子を調製するには、デキストランT-40(5mL;50%w/w)と水性FeCl3×6H2O(0.45 g;2.77 mmol)およびFeCl2×4H2O(0.32 g;2.52 mmol)溶液を室温で激しく攪拌する。
  2. NH4OH (10 mL; 7.5% v/v) を迅速に追加します。
  3. さらに1時間黒懸濁液をかき混ぜます;その後、17,300 x gで10分間遠心分離し、凝集物を取り除く。
  4. ゲル濾過クロマトグラフィー20によって、結合されていないデキストランT-40から最終的なSPIO製品を分離します。
  5. 反応混合物(総体積=5 mL)を2.5cm×33cmカラムにロードし、pH 7.0で0.1M NaAcetateと0.15M NaClを含む緩衝液を用いて溶出させます。
  6. 精製デキストランコーティングされた酸化鉄磁性ナノ粒子をボイド体積に集め、塩酸とフェノール/硫酸法20を用いて、330nmと490nmの鉄とデキストランのカラム溶出物をアッセイします。

2. SPIO-MtbsAb合成

  1. 以前に報告された方法21,22を使用して SPIO 結合 EDBE を合成する 。
  2. SPIO-EDBE-コハク酸エステル(SA)を合成する。
    1. SPIO-EDBEおよびSA(1g;10 μmol)のアルカリ溶液(5 M NaOH;10 mL))を室温で24時間かき混ぜます。
    2. 分子多孔膜チューブ(12,000-14,000 MWカットオフ)を用いて蒸留水の2Lの20の変化を用いて溶液を透析する。変更ごとに 6 h。
  3. 最後に、4.5 mg/mL MtbsAbの400μLにSPIO-EDBE-SA(Feの4mg/mL)を100 μL加え、1-ヒドロキシベンゾゾトリアゾールおよび(ベンゾトリリアゾール-1-イロキシ)トリピロリジノホスホオニウムを用いてSPIO-MtbsAbを合成し、24溶液中で溶液中で溶液を攪拌する。
  4. 最後に、ゲル濾過クロマトグラフィーを介してアンバウンド抗体から溶液を分離する。
  5. 反応混合物(5 mL)を2.5cm×33cmカラムに積み込み、PBSバッファーを用いて溶出させます。ビチンポニン酸タンパク質アッセイキット23を用いてAb-ナノ粒子複合体(すなわちナノプローブ)を確認する。

3. 粒子形態観察・緩和層測定

  1. 100kVの電圧で透過型電子顕微鏡を用いて、平均粒子径、形態、サイズ分布を調べます。
    1. 複合分散液を200メッシュの銅グリッドにドロップキャストし、室温で空気乾燥してから顕微鏡に積み込みます。
  2. NMR緩和計を用いてナノプローブの緩和時間値(T1およびT2)を20MHzおよび37.0°C±0.1°Cで測定します。
    1. 各測定の前に、リラックスメーターを調整します。
    2. 反転回復とCarr-Cell-Meiboom-Gillパルスシーケンスを通じて生成された8つのデータポイントからr1およびr2の値をそれぞれ記録し、r1およびr2の緩和度20を決定する。

4. 細胞イメージング

  1. 10%のウシ胎児血清、50μg/mLゲンタマイシン硫酸、100単位/mLペニシリンGナトリウム、100μgのストレプトマイシン硫酸塩、0.25 μg/mL菌類を含むRPMI 1640でヒト単球THP-1を培養し、5%CO2インキュバターで5%CO2インキュバターで5%のCO2インキュバーターを有する。
  2. ミコバクテリウム・ボビスBCGの106コロニー形成ユニット(CFU)を備えたSPIO-MtbsAbナノプローブ(2mM)をマイクロ遠心分離管(1mL)で1時間5%CO2インキュベーターに1×107活性化単球でプレインキュベートした。
  3. 遠心管は200×gで、上清を捨てます。ペレットを培地(200 μL)に再溶解します。
  4. 高速勾配エコーパルスシーケンスを使用してサンプルをスキャンします(繰り返し時間(TR)= 500;エコー時間(TE) = 20;フリップ角度 = 10°) を介して 3.0-T MRI ナノプローブの特異性と感度を決定する21,22.

5. BCG(バチルス・カルメット=ゲリン)接種

  1. Sauton培地で凍結乾燥ワクチンまたは細菌ストックを再構成し、前述の24のように適切に分散するまで生理食塩水でストックを希釈する。
  2. ADIMMUNE(台湾・台北)から得られたM.ボビスBCGの生きた減衰株を接種する(Connaught株;イムシストアベンティス、パスツール・メリユー)は、前に説明したように、マウスの左右の小肩甲骨皮膚に皮内に0.1 mL/マウス(すなわち、107 CFU)の体積で23。陰性制御としてマウスに生理用アルコールを注入する。BCG接種後、毎日動物をモニターする。
  3. 二酸化炭素安楽死を用いた細菌接種1ヶ月後に動物を犠牲にする。皮内接種部位から組織を収穫する。組織を10%ホルマリンで固定し、5〜10 μmでシリアルセクションのパラフィンに埋め込み、酸性速細菌24のヘマトキシリン/エオシンおよびツィエル・ニールセン染色剤と鉄鉄25のベルリンブルーを含む染色組織セクション。

6. インビボ MRI

  1. 動物麻酔のために、ケタミン(体重80mg/kg)とキシラジン(体重12mg/kg)をマウスに皮下注射します。
  2. マウスの尾静脈にSPIO-TbsAbプローブ(2nmol/200 μL)を注入します。MR画像マウスは、プローブ注射の前と直後、そしてT2重み付き高速スピンエコー画像(TR = 3000;)TE = 90;視野 = 8)。
  3. シグナル強度(SI)を用いてすべてのMR画像を定量的に分析し、Mtb肉芽肉芽腫の中心と肉芽腫領域に隣接する背中の筋肉の比較位置に対して、定義された対象領域の測定を行います。
  4. 式を使用して、SI測定前(SIpre;制御)と0-3h(SIpost)の注入後(SIpost)を用いて相対信号の増強を計算する

    [(シポスト - シプレ)/シプレ] × 100

    ここでSIpreは、前強化されたスキャン上の病変のSIであり、シポストは後強化スキャン21、22上の病変のSIである。

結果

SPIO-MtbsAbナノプローブ合成と特性評価
SPIOナノ粒子は、MtbsAbと共役するように設計された。SPIOナノ粒子の表面上で安定化されたデキストランをエピクロロヒドリンにより架橋した。SPIOナノ粒子は、その後EDBEと組み込まれ、デキストラン末端で一次アミン官能基を活性化した。その後、SAを共役してSPIO-EDBE-SAを形成した。カップリング剤の存在下で、SPIO-EDBE-SAを用いたMtbsAbのコ?...

ディスカッション

関連する研究と同様に、SPIO-MtbsAbナノプローブに関する我々の知見は、Mtb27,28に対して有意な特異性を示した。皮下Mtb肉芽腫は、マウスモデルにおいて結核注射の1ヶ月後に発見された。典型的な結核肉芽腫性の細胞学の所見は、リンパ球浸潤、上皮性マクロファージの存在、および新血管新生を含んでいた。酸速いバチル菌を結核病変に散乱し、Mtb...

開示事項

著者の誰も、この研究で調べた材料に独自の関心を持っていません。

謝辞

著者らは、台湾経済省(NSC-101-2120-M-038-001、MOST 104-2622-B-038 -007、MOST 105-2622-B-038-004)からの資金援助に感謝しています。この原稿はウォレス・アカデミック・エディット編集編集によって編集されました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
(benzotriazol-1-yloxy) tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphateSigma-Aldrich
1-hydroxybenzotriazoleSigma-Aldrich
dextran(T-40)GE Healthcare Bio-sciences AB
epichlorohydrin, 2,2'-(ethylenedioxy)bis(ethylamine)Sigma-Aldrich
ferric chloride hexahydrateFluka
ferrous chloride tetrahydrateFluka
Human monocytic THP-1
M. bovis BCGPasteur MérieuxConnaught strain; ImmuCyst Aventis
MRIGE medical Systems3.0-T, Signa
NH4OHFluka
NMR relaxometerBrukerNMS-120 Minispec
Sephacryl S-300GE Healthcare Bio-sciences AB
Sephadex G-25GE Healthcare Bio-sciences AB
SPECTRUM molecular porous membrane tubing, 12,000 -14,000 MW cut offSpectrum Laboratories Inc
TB surface antibody- Polyclonal Antibody to MtbAcris Antibodies GmbHBP2027
transmission electron microscopeJEOLJEM-2000 EX II

参考文献

  1. Small, P. M., et al. Treatment of tuberculosis in patients with advanced human immunodeficiency virus infection. New England Journal of Medicine. 324, 289-294 (1991).
  2. Alvarez, S., McCabe, W. R. Extrapulmonary tuberculosis revisited: a review of experience at Boston City and other hospitals. Medicine. 63, 25-55 (1984).
  3. Ozbay, B., Uzun, K. Extrapulmonary tuberculosis in high prevalence of tuberculosis and low prevalence of HIV. Clinics in Chest Medicine. 23, 351-354 (2002).
  4. Ebdrup, L., Storgaard, M., Jensen-Fangel, S., Obel, N. Ten years of extrapulmonary tuberculosis in a Danish university clinic. Scandinavian Journal of Infectious Diseases. 35, 244-246 (2003).
  5. Steingart, K. R., et al. A systematic review of commercial serological antibody detection tests for the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis. Postgraduate Medical Journal. 83, 705-712 (2007).
  6. Liao, C. H., et al. Diagnostic performance of an enzyme-linked immunospot assay for interferon-gamma in extrapulmonary tuberculosis varies between different sites of disease. Journal of Infection. 59, 402-408 (2009).
  7. Kim, S. H., et al. Diagnostic usefulness of a T-cell based assay for extrapulmonary tuberculosis. Archives of Internal Medicine. 167, 2255-2259 (2007).
  8. Kim, S. H., et al. Diagnostic usefulness of a T-cell-based assay for extrapulmonary tuberculosis in immunocompromised patients. The American Journal of Medicine. 122, 189-195 (2009).
  9. Pai, M., Zwerling, A., Menzies, D. Systematic review: T-cell-based assays for the diagnosis of latent tuberculosis infection: an update. Annals of Internal Medicine. 149, 177-184 (2008).
  10. Kobashi, Y., et al. Clinical utility of a T cell-based assay in the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis. Respirology. 14, 276-281 (2009).
  11. Paluch-Oles, J., Magrys, A., Kot, E., Koziol-Montewka, M. Rapid identification of tuberculosis epididymo-orchitis by INNO-LiPA Rif TB and QuantiFERON-TB Gold In Tube tests: case report. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 66, 314-317 (2010).
  12. Kaneko, K., Onodera, O., Miyatake, T., Tsuji, S. Rapid diagnosis of tuberculous meningitis by polymerase chain reaction (PCR). Neurology. 40, 1617 (1990).
  13. Bhigjee, A. I., et al. Diagnosis of tuberculous meningitis: clinical and laboratory parameters. International Journal of Infectious Diseases. 11, 348-354 (2007).
  14. Miyawaki, A., Sawano, A., Kogure, T. Lighting up cells: labelling proteins with fluorophores. Nature Cell Biology. , 1-7 (2003).
  15. Weissleder, R., Mahmood, U. Molecular imaging. Radiology. 219, 316-333 (2001).
  16. Gupta, A. K., Gupta, M. Synthesis and surface engineering of iron oxide nanoparticles for biomedical applications. Biomaterials. 26, 3995-4021 (2005).
  17. Talelli, M., et al. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles encapsulated in biodegradable thermosensitive polymeric micelles: toward a targeted nanomedicine suitable for image-guided drug delivery. Langmuir. 25, 2060-2067 (2009).
  18. Cho, W. S., et al. Pulmonary toxicity and kinetic study of Cy5.5-conjugated superparamagnetic iron oxide nanoparticles by optical imaging. Toxicology and Applied Pharmacology. , 106-115 (2009).
  19. Mahmoudi, M., Simchi, A., Milani, A. S., Stroeve, P. Cell toxicity of superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Journal of Colloid and Interface Science. 336, 510-518 (2009).
  20. Chen, T. J., et al. Targeted folic acid-PEG nanoparticles for noninvasive imaging of folate receptor by MRI. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 87, 165-175 (2008).
  21. Chen, T. J., et al. Targeted Herceptin-dextran iron oxide nanoparticles for noninvasive imaging of HER2/neu receptors using MRI. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 14, 253-260 (2009).
  22. Weissleder, R., et al. Ultrasmall superparamagnetic iron oxide: an intravenous contrast agent for assessing lymph nodes with MR imaging. Radiology. 175, 494-498 (1990).
  23. Wang, J., Wakeham, J., Harkness, R., Xing, Z. Macrophages are a significant source of type 1 cytokines during mycobacterial infection. Journal of Clinical Investigation. 103, 1023-1029 (1999).
  24. Angra, P., Ridderhof, J., Smithwick, R. Comparison of two different strengths of carbol fuchsin in Ziehl-Neelsen staining for detecting acid-fast bacilli. Journal of Clinical Microbiology. 41, 3459 (2003).
  25. Woods, A. E., Ellis, R. . Laboratory Histopathology- A Complete Reference. 1st edn. , 6-11 (1994).
  26. Lee, C. N., et al. Super-paramagnetic iron oxide nanoparticles for use in extrapulmonary tuberculosis diagnosis. Clinical Microbiology and Infection. 18, 149-157 (2012).
  27. Lee, H., Yoon, T. J., Weissleder, R. Ultrasensitive detection of bacteria using core-shell nanoparticles and an NMR-filter system. Angewandte Chemie International Edition. 48, 5657-5660 (2009).
  28. Fan, Z., et al. Popcorn-shaped magnetic core-plasmonic shell multifunctional nanoparticles for the targeted magnetic separation and enrichment, label-free SERS imaging, and photothermal destruction of multidrug-resistant bacteria. Chemistry. 19, 2839-2847 (2013).
  29. Nishie, A., et al. In vitro imaging of human monocytic cellular activity using superparamagnetic iron oxide. Computerized Medical Imaging and Graphics. 31, 638-642 (2007).
  30. von Zur Muhlen, C., et al. Superparamagnetic iron oxide binding and uptake as imaged by magnetic resonance is mediated by the integrin receptor Mac-1 (CD11b/CD18): implications on imaging of atherosclerotic plaques. Atherosclerosis. 193, 102-111 (2007).

転載および許可

このJoVE論文のテキスト又は図を再利用するための許可を申請します

許可を申請

さらに記事を探す

156

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

個人情報保護方針

利用規約

一般データ保護規則

お問い合わせ

図書館への推薦

JoVE ニュースレター

研究

教育

著者

図書館員

JoVEについて

Copyright © 2023 MyJoVE Corporation. All rights reserved