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要約

電子常磁性共鳴 (EPR) 分光法は、フリーラジカルを測定する明確な方法です。選択的スピン プローブは、異なる細胞コンパートメント中のフリーラジカルの検出に使用します。治療、保存、および EPR 測定用サンプルを転送を容易にする生物学的サンプルを収集するために、実用的で効率的な手法を提案します。

要約

別の細胞およびティッシュ コンパートメントにおける活性酸素種 (ROS) の正確かつ特定の検出は生物学的設定におけるシグナル伝達レドックス調節の研究に不可欠です。電子常磁性共鳴 (EPR) は、フリーラジカルを明確に把握する唯一の直接の方法です。その利点は、高い特異性と特定の種の生理学的レベルを検出したが、データの正確な解釈を確保するため、専門的な技術、注意サンプル準備と適切なコントロールが必要です。繰返しヒドロキシルアミン スピン プローブは、スーパーオキシドまたは EPR 分光法によって定量することができますニトロキシド信号を生成するその他のラジカルと選択的に反応します。細胞膜透過性のスピン プローブおよび急速にミトコンドリアに蓄積するように設計スピン プローブ別の細胞コンパートメントに活性酸素濃度の測定を可能にします。

培養細胞、細胞透過性 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) と一緒に、細胞不浸透性のスーパーオキシド ジスムターゼ (SOD) 前処理なしの使用または細胞膜透過性 PEG SOD の使用には、細胞内活性酸素から細胞の分化。ミトコンドリア 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethyl-piperidine,1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido] ピペリジ ニウム塩化 (水戸-テンポ-H) の測定が可能になりますミトコンドリア ROS (主に活性酸素)。

スピン プローブと EPR 分光は、体内モデルにも適用できます。活性酸素は、肺などの組織と同様、血液や肺胞液などの細胞外液に検出できます。EPR 測定のための組織を処理して静脈内 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CPH) スピン プローブの生体を提供いくつかの方法が掲載されています。In vitroとin vivoモデルから得られた試料測定は室温で実行できますが、-80 ° C で保存および 77 K において EPR によって分析できるはまたサンプルは、特殊なチューブ安定-80 ° c で保存し、77 K、効率的、実用的を有効にして格納と転送のサンプルを容易に再現可能な方法で実行できます。

概要

酸化ストレスと活性酸素の対策がすべての器官システムで多様な病気の研究に重要な活性酸素種 (ROS) の検出は、半減期が短いと高い反応性のために挑戦。電子常磁性共鳴 (EPR) 法は、フリーラジカルの検出の最も明白な方法です。スピン プローブより一般的に使用される蛍光プローブ上の利点を持っています。蛍光プローブは、比較的安価で使いやすく、活性酸素の急速な敏感な検出を提供するが、彼らは人工信号、ROS 濃度と特異性1 の一般的な不足を計算することができないことに起因する深刻な制限を持ってください。.

EPR の生物学的研究のための使用を容易にするさまざまな生物学的関連性の高いフリーラジカル種と同様、pO2pH、酸化還元の範囲を測定できるプローブを合成されているスピン状態2,3, 4,5,6,7。スピン トラップは、短寿命ラジカルをキャプチャするため開発されているし、フォーム長期的付加、EPR8によって検出を容易にします。両方のクラス (スピン プローブとスピン トラップ) の利点と制限があります。スピン プローブの 1 つの一般的に使用されるクラスは、EPR サイレントと安定したニトロキシドを形成する短寿命ラジカルと反応して環状の hydroxylamines です。繰返し hydroxylamines 反応スーパーオキシドと 100 回スピン トラップ、細胞酸化防止剤との競争にそれらを有効にするよりも高速が彼らは特異性がないし、適切なコントロールとラジカルまたはソースを識別する阻害剤を使用する必要ニトロキシド信号を担当します。スピン トラップ展示特異性、間と異なるスペクトル スーパーオキシド スピン トラッピングとラジカルの生分解しやすいパターンによって閉じ込められた種、彼らが遅い速度をある付加体します。スピン トラッピングのためのアプリケーションは、生物医学研究9,10、11,12,13で十分に文書化されています。

このプロジェクトの目的は実験を設計するための実用的な EPR 方法を示しますし、異なる細胞コンパートメント体外と異なる組織コンパートメント体内にプローブ スピンを使用して活性酸素を検出するサンプルを準備します。複数の原稿は、マウスモデルの解析の異なる細胞コンパートメントの体外およびプロセスの組織をターゲットに細胞膜透過性、細胞不浸透性、そしてミトコンドリア標的スピン プローブを使用して、これらの目標に関連するプロトコルを公開しています。14,15します正確なことを確認する別の細胞コンパートメントの in vitro 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) スピン プローブを用いた活性酸素を測定するためのアプローチを検証することによって文献のこのボディに基づいて構築。測定、結果が偏る可能性があります潜在的な技術的な問題を強調表示します。我々 はまた CMH スピン プローブを用いた肺組織、気管支肺胞洗浄液、血で EPR 測定を実行するメソッドを提供します。これらの研究は、マウス組織を収穫する前に別のスピン プローブ、CPH を注入する手法し同様、組織を処理するさまざまな方法を比較します。最後に、ストレージの 77 K において EPR 測定前にサンプルの転送を許可するポリテトラフルオロ エチレン (PTFE) チューブのサンプルを格納するための実用的な方法を開発します。

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プロトコル

すべての動物の研究は、コロラド州デンバー機関動物ケアおよび使用委員会の大学によって承認されました。

1. 試薬の調製

  1. ジエチレントリアミン酸 (DTPA) 株式 (150 mM)
    1. DTPA の 2.95 g を追加 (393.35 g/mol) 10 mL の脱イオン水に。
    2. DTPA を解散するには、1 M 水酸化ナトリウムを滴下追加し、7.0 の pH にもたらします。
    3. 150 mM の最終 DTPA 濃度の水で 50 mL にボリュームをもたらし、4 ° C で保存
  2. リン酸バッファー生理食塩水 (PBS) (50 mM、pH 7.4)
    1. 5 M の塩化ナトリウム (NaCl) (58.44 g/mol; 29.22 g/100 mL) を準備します。
    2. カリウム リン酸二塩基 HK2PO4 (174.18 g/mol; 17.42 g/100 mL) の 1 M を準備します。
    3. カリウム リン酸一塩基 KH2PO4 (136.1 g/mol; 13.61 g/100 mL) の 1 M を準備します。りん酸一 1 M カリウム リン酸水素 4.24 mL と 1 M カリウムの 0.760 mL と 5 M の NaCl の 3 mL を混ぜます。PH を確認してください。
    4. 脱イオン水 100 mL にボリュームをもたらします。
    5. 短期 (日) 室内温度 (RT) と長期 (数週間) ストレージのための 4 ° C で保存します。
  3. 100 μ M DTPA を含む促進バッファー (khb 東日本放送)
    1. 50 mL の円錐形遠心分離機管 150 mM DTPA 原液の 33.3 μ L を追加します。
    2. 促進バッファー (khb 東日本放送) で 50 mL のボリュームをもたらします。
    3. 毎日 DTPA と新鮮なバッファーを準備し、室温維持
  4. ショ糖を含むトリス EDTA バッファー
    1. 0.5 M トリス在庫を準備: 150 mL の脱イオン水でトリス基地 (121.14 g/mol) の 15.14 g を溶かします。HCl を使用して、7.8 に pH を調整し、250 mL の最終巻にもたらします。
    2. ショ糖の 21.4 g を溶解 (342.29 g/mol; 最終濃度 = 0.25 mM) 150 mL の脱イオン水に。
    3. 10 mM の最終的なトリス濃度を達成するためにショ糖にトリス株式の 5 mL を追加します。
    4. 1 mM の最終的な集中を達成するためにトリス ショ糖に 0.5 M EDTA ストックの 0.5 mL を追加します。
    5. PH を確認し、7.4 に調整します。
    6. 250 mL の脱イオン水での最終巻に持参し、4 ° C で保存
  5. 牛赤血球銅/亜鉛スーパーオキシド ジスムターゼ (SOD) 株式 (30,000 U/mL)
    1. 1 mL の PBS (約 5.7 mg、多くの SOD の活性に応じて) で SOD の 30,000 U を再構築します。
    2. よく、因数を混合し、短期 (6-12 ヶ月) の-20 ° c と長期保存用-80 ° C で保存します。
  6. SOD 作業ソリューション (1000 U/mL)
    1. 870 μ L の滅菌 PBS に 30,000 U/mL SOD 株式の 30 μ 因数を転送します。
    2. 氷の上のソリューションを保持し、新鮮な使用します。
  7. ホルボール 12-ミリスタート 13-アセタート (PMA) 株式 (5 mM)
    1. PMA の 1 mg を溶解 (616.83 g/mol) DMSO の 325 μ L で (最終濃度 5 mm)。
    2. 因数 5 mM PMA ソリューションし、-20 ° C で保存
  8. PMA 作業ソリューション (125 μ M)
    1. 390 μ L の滅菌 PBS に 5 mM PMA 株式の 10 μ L の因数を希釈します。
    2. 氷の上のソリューションを保持し、新鮮な使用します。
    3. PMA の車両制御、390 μ L の PBS で DMSO の 10 μ L を使用します。
  9. 塩化ジフェニル (DIP) (2.5 mM)
    1. 3.2 mg を溶解 4 ml の 2.5 mM の在庫を取得する (316.57 g/mol) をつけます。
    2. ソリューションを準備し、それを使用して、新鮮です。
  10. デフェロキサミン メシル酸塩 (DFO) (20 mM)
    1. DFO の 4.5 mg を溶解 (656.79 g/mol) 20 の mM の在庫を取得する 340 μ L で。
    2. ソリューションを準備し、それを使用して、新鮮です。
  11. アンチマイシン A (AA) 株式 (5 mM) の準備
    1. AA の 5.4 mg を溶解 (532 g/mol) エタノール 2 mL 中 (最終濃度 5 mm)。
    2. ガラスの瓶、-20 ° C で店で在庫の約数
  12. スピン プローブの準備
    1. バブル 50 mM リン酸バッファー バッファーから溶存酸素を取り除くに 30 分間、窒素を含む 100 μ M DTPA。
    2. -20 ° C のフリーザーからスピン プローブを削除でき、RT (10-15 分) に来てコンテナー。
    3. 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine· の 2.4 mg を量りHCl (CMH) (237.8 g/mol)
    4. CMH を最終濃度 10 mM の脱酸素化リン酸バッファーの 1 mL に溶解します。
    5. 5 mg 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethylpiperidine,1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido]piperidinium 二塩化 (水戸-テンポ-H) (529.1 g/mol) の重量を量り。
    6. 水戸-テンポ-H を最終濃度 9.5 mM の脱酸素化リン酸バッファーの 1 mL に溶解します。
    7. 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine· 4.9 mg を量りHCl (CPH) (223.7 g/mol)。
    8. CPH を 22 mM の最終的な集中の脱酸素化リン酸バッファーの 1 mL に溶解します。
    9. 因数とストア-80 ° c (凍結融解は推奨しません)。

2. 活性酸素の生体外の検出

  1. RT で PMA 刺激の未加工 264.7 のセルの合計、細胞外と細胞内の活性酸素の検出
    1. 以下の適切な無菌テクニックは未加工 264.7 のセルの雪解け、DMEM 培地 10 %fbs (低エンドトキシン フリー) と 1% 抗真菌薬/アンピシリン CO2インキュベーターで 37 ° c でそれらを通過します。
    2. 種子 1 x 106 6 ウェル プレート 1 日治療前に細胞/ウェルで未加工 264.7 のセル。
    3. 優しくメディアを取り出し、1 mL の khb 東日本放送のバッファーに一度セルを洗浄します。
    4. Khb 東日本放送の各ウェルに 100 μ M DTPA を含むを追加し、次 500 μ L の容量で治療します。
    5. SOD、前処理井戸追加 SOD 実用的なソリューションの 15 μ L/ウェル (1000 U/mL; SOD の最終濃度 = 30 U/mL) CMH と PMA の添加前に 37 ° C で 10 分間インキュベートし、。
    6. 10 mM CMH 株式 12.5 μ L/ウェルを追加 (最終濃度 = 0.25 mM)。
    7. 125 μ M PMA 実用的なソリューションの 40 μ L/ウェルを追加 (最終濃度 = 10 μ M) や 40 μ L 車 (390 μ L の PBS で DMSO の株式 10 μ)。
    8. CO2のインキュベーターで 37 ° C で 50 分間インキュベートします。
    9. インキュベーターからプレートを削除し、氷の上すぐに配置します。
    10. チューブ ラベル、別の 1.5 mL の各ウェルからバッファーを収集します。全体の氷の上を保ちます。
    11. 100 μ M DTPA を含む新鮮な khb 東日本放送のバッファーを 100 μ l 添加細胞をこすり、ゆっくりを上下に数回ピペッティングによって再懸濁します。再懸濁細胞の中で氷の上を保ちます。
    12. 負荷サンプル手順 2.1.10 と 2.1.11 (50 μ L) キャピラリー チューブのそれぞれで採取しました。両端をシールし、EPR を実行します。
      注: は常にチューブをテストまたはよく (セル) のないバッファーでプローブを含む (同じ濃度 = 0.25 mM)、プローブのバック グラウンド強度は温度コントロールとして細胞 (同じインキュベーション時間と温度) と同じ条件の下で扱われる時間に依存します。
    13. 次に EPR 買収パラメーターを設定: マイクロ波周波数 = 9.65 GHz の;センター フィールド = 3432 G;変調振幅 = 2.0 G;掃引幅 = 80 G;マイクロ波電力 = 19.9 mW。スキャンの合計数 = 10;掃引時間 = 12.11 s;時定数 = 20.48 ms。
  2. 未加工 264.7 のセルのミトコンドリア活性酸素検出
    1. 2.1.1 2.1.2 に手順種子未加工 264.7 のセル実験の前日。
    2. メディアを削除し、1 mL の khb 東日本放送のバッファーに一度セルを洗浄します。
    3. 各ウェルに 100 μ M DTPA を含む khb 東日本放送の 200 μ L を追加します。
    4. 5.3 μ L/ウェル 9.5 mM 水戸テンポ H 株式を追加 (最終濃度 = 0.25 mM)
    5. 室温 10 分間インキュベートします。
    6. アンチマイシン A (AA)、エタノールの原液を 5 mM の 1 μ L/ウェルを追加 (最終濃度 25 μ M を =)。
    7. CO2のインキュベーターで 37 ° C で 50 分間インキュベートします。
    8. インキュベーターからプレートを削除し、氷の上すぐに配置します。
    9. 軽く細胞をこすり、上下にピペッティングによって再懸濁します。氷の上を保ちます。
    10. キャピラリー チューブのサンプルをロードします。両端をシールします。
    11. EPR の設定に関する前のセクションを参照してください。
  3. 77 K で未加工 264.7 のセル中の過酸化物の検出
    1. 事前に用意された PTFE チューブ長さ (3/16"x 1/8" ID OD) で 1 〜 2 インチの手順 1.1.10 で収集バッファーに配置します。簡単に挿入して、指から削除できるので、PTFE チューブがストレート確認デュワー。PTFE チューブの一方の端を閉じる、PTFE チューブに細胞懸濁液 (100 に 150 μ L) またはバッファーをピペットおよび第 2 ストッパー付きチューブをシールにゴム栓を使用します。
    2. フラッシュは、液体窒素でサンプルを凍結します。サンプルは-80 ° C で保存用ラベル凍結保存チューブに転送またはすぐに実行できます。
    3. 指を埋める液体窒素と挿入、指にサンプルを含む PTFE チューブ デュワー デュワー。確認サンプルは共振器の能動的空間の中央に配置し、77 K で EPR を実行
      注: 窒素ガスの流れ、装置の開発を開始、測定前に 15-30 分、共振器中の水分の凝縮を防ぐために測定中にこのフローを続行します。
    4. 次に EPR 買収パラメーターを設定: マイクロ波周波数 = 9.65 GHz の;センター フィールド = 3438 G;変調振幅 = 4.0 G;掃引幅 = 150 G;マイクロ波電力 = 0.316 mW。スキャンの合計数 = 10;スイープ時間 = 60 s;時定数 = 1.28 ms。

3. EPR 測定流体

  1. 全血
    1. PBS または前述の16,17として単独で PBS に溶解した気管内ブレオマイシン (症例; 1 U/mL で 100 μ L) の単回投与でマウス (8-12 週齢) を扱います。
    2. 続いて急激と頚部転位吸入イソフルラン (1.5-4%) を投与することによってマウスを安楽死させます。注射器でヘパリン (1000 USP/mL) 100 μ M DTPA と 1.5 mL チューブへの転送を含むコーティングに右心室に血液を吸引します。
    3. 別 1.5 mL チューブでは 15 μ L の PBS 100 μ M DTPA を含むを追加、150 μ L の容量と最終 CMH 濃度 0.2 mM の血 132 μ に CMH (10 mM) の 3 μ L。
    4. 37 の ° C の水浴中で 10 分の血液を孵化させなさい。
    5. 水浴からチューブを取り外します。
    6. キャピラリー チューブの血液を読み込むことによって、因数を取るし、EPR アクイジション ・ パラメーターは次の RT で EPR を実行: マイクロ波周波数 = 9.65 GHz の;センター フィールド = 3432 G;変調振幅 = 1.0 G;掃引幅 = 80 G;マイクロ波電力 = 19.9 mW。スキャンの合計数 = 3;掃引時間 = 12.11 s;時定数 = 20.48 さんまたは、サンプルで説明されているステップ 2.3 として冷凍フラッシュすることができます 77 k. EPR 集録パラメーターの測定は、次の: マイクロ波周波数 = 9.65 GHz の;センター フィールド = 3438 G;変調振幅 = 4.0 G;掃引幅 = 150 G;マイクロ波電力 = 0.316 mW。スキャンの合計数 = 2;スイープ時間 = 60 s;時定数 = 1.28 ms。
  2. 気管支肺胞洗浄液 (BALF)
    1. 安楽死した後 (手順 3.1.2 を参照)、ゆっくり浸透させると 1 mL の PBS 100 μ M DTPA 3 回、注射器を介してカニューレは、気管を含むの撤退による BALF を収集します。
    2. 1.5 mL チューブに BALF CMH (10 mM)、最終濃度が 0.2 mm の 4 μ L で 200 μ L を扱います。
    3. BALF 37 ° c 水のお風呂で 50 分間インキュベートします。
    4. 風呂の水のチューブを取り出して、氷の上に置きます。
    5. キャピラリー チューブと RT で実行 EPR と同じ EPR 設定、BALF 負荷においてステップ 1.1.13、または 2.3 の手順で説明されているようにフラッシュが液体窒素で凍結します。
  3. 77 K で血および BALF の EPR 測定
    1. 血を収集するために上記のプロトコルに従う (ステップ 3.1.1。 3.1.4 に) および BALF (3.2.4 に 3.2.1 のステップ)。
    2. 処理された血液または ptfe チューブ (1-2 の) BALF の場所 150 μ L。ゴム栓を使用して、サンプルとチューブをシールする別のストッパーを追加する前に PTFE チューブの一方の端を閉じます。
    3. フラッシュは、液体窒素でサンプルを凍結します。
    4. 77 k. 実行冷凍 CMH でデュワーと血液サンプルを扱われる一週間で指を使って PTFE チューブの凍結試料で EPR を実行する詳細については、セクション 2.3 を参照してください。

4. EPR 測定肺組織

  1. 冷凍肺組織をフラッシュします。
    1. 3.2.1 の手順で BALF を収集した後、胸が開き、肺は血液を削除する右心室を介して冷 PBS の 10 mL でフラッシュします。フラッシュは、液体窒素で肺の組織を凍結します。冷凍の肺組織は、EPR 測定に使用されるまで最大 6 ヶ月間-80 ° C で保存できます。
    2. ピンセットでドライアイスに肺組織を安定させるし、シングル エッジ刃を使用して肺組織の複数の小さい部分 (5-15 mg) をカットします。
    3. 1.5 mL チューブに組織の重量を量るスケールのチューブを場所しスケールを風袋、組織部分を追加し、重量を記録します。
    4. 1.5 mL チューブに組織、DTPA し CMH (0.2 mM) の 4 μ L、200 μ L の総ボリュームを達成するためを含む khb 東日本放送の 196 μ L を追加します。
    5. 37 の ° C の水浴中で 1 時間インキュベートします。
    6. (数秒) の 3,884 × g で遠心機でスピンダウンします。
    7. 氷の場所し、PTFE チューブに上清の 150 μ L をピペット 77 K 測定の凍結するセクション 2.3 で説明されているようです。
      注: このメソッドの傷害の不均一性の考慮する必要があります。ブレオマイシンによる肺傷害のため非常に異種の損傷であることを考えればお勧め各マウスから肺のさまざまな部分からいくつかの組織の部分をカットします。または、組織のより大きい部分は、khb 東日本放送のバッファー 1:6 の重量・体積比 (mg/μ L) で 100 μ M DTPA を含む下記のように均質化することができます。
  2. 新鮮な肺組織のショ糖バッファーに保存
    1. 3.1.2 のステップで行う血液を削除する冷 PBS の lavaged の肺をフラッシュします。
    2. ガラスやテフロン乳棒と Dounce 組織グラインダーを用いた 1:6 肺/バッファー (mg/μ L) 比 0.25 M ショ糖を含むトリス EDTA バッファーの新鮮な肺組織をホモジナイズしてください。
    3. 肺の 50 μ L を含む 100 μ M DTPA khb 東日本放送の 450 μ L に追加します。
    4. Khb 東日本放送で肺を磨砕液の 98 μ L に 1.5 mL チューブ (100 μ L の総ボリューム) で、最終濃度が 0.2 mm 10 mM 在庫の CMH の 2 μ L を追加します。
    5. 37 ° C 水のお風呂で 20 分間インキュベートします。
    6. 氷のサンプルを置き、キャピラリー チューブでそれらをロードします。RT (2.1.13 のステップで使用される設定) で EPR を実行します。
    7. 特定の種と異なる阻害剤を使用してソースの貢献度をテストするため事前 98 μ L の最終巻を達成するために khb 東日本放送で調整阻害剤 + 肺ホモジネートの 88 μ L を扱います。この実験阻害剤には SOD の 10 μ L が含まれている (100 U/mL)、デフェロキサミンの 4 μ L (DFO; 最終濃度 = 800 μ M)、または塩化ジフェニルの 4 μ L (DIP; 最終濃度 100 μ M を =)。37 の ° C の水浴中で 20 分間インキュベートします。
    8. CMH の 2 μ L を追加し、37 ° C、EPR 測定に続いて上記のように別の 20 分間インキュベートします。ショ糖バッファーを含む CMH khb 東日本放送で 1 回一致する空白のサンプルが含まれます。また、今後測定-80 ° C で残りの肺乳剤 (ステップ 3.1.2) の因数を格納します。
      注: 必要に応じて、合計ボリュームを拡張できます。
  3. スピン プローブは体内(常温組織細胞を使用して) 投与マウスから肺組織の EPR 測定
    1. CPH 原液を準備するには、フィルター処理および脱酸素化の 50 mM リン酸バッファーの 1 mL の CPH の 4.9 mg を溶解します。
    2. 20-30 秒までピンチをつま先に無理解の吸入イソフルラン (1.5-4%) を持つマウスを麻酔します。25 g マウス体重 CPH スピン プローブの 100 μ L 注入マウス経由でretroorbital ルート (最終投与量 = 20 mg/kg)、preve へ目の領域にプロパラカイン 0.5 %hcl の一滴を追加、retroorbital 注射後すぐに 1 のため循環させてプローブとnt の目の痛みと乾燥。1 h のマウスを監視し、組織採取に進みます。
    3. 前述のように肺組織を収穫し、フラッシュ凍結肺。
    4. ドライアイスで凍結するティッシュの 20-30 mg をカットし、正確な重量を記録します。
    5. クリーニング ワイプ、表面の水を吸収すると組織を軽く拭きます。
    6. (アクセサリー組織サンプルの EPR 測定が可能) 組織細胞のウィンドウ内で組織を置き、合計スピンを決定する EPR を実行します。データは、組織の mg 当たり合計スピンとして表現できます。

5. データの解析

  1. ベンチ上 EMXnano EPR 分光器のキセノン ソフトウェアに組み込まれている SpinFit モジュールを使用して EPR スペクトルをシミュレートします。SpinCount モジュールによるニトロキシド濃度を決定します。また、4-ヒドロキシ テンポや TEMPOL など安定したニトロキシドの検量線を作ることができるとサンプルと標準信号の強さを比較することにより濃度を得ることができます。
  2. 77 K で収集したデータ、SpinCount に続いて二重積分を使用します。

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結果

CMH を用いた活性酸素検出は、X を使用して検証された/XO 活性酸素生成カタラーゼの影響 (図 1 a) をしていた SOD、によって完全に、ニトロキシド (CM.) 信号抑制されたを示すためのシステム。合計、細胞の過酸化物は、SOD 前処理 +/-細胞膜透過性の CMH スピン プローブでインキュベーターの細胞によって未加工 264.7 のセルで評価されました...

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ディスカッション

生物学的設定でフリーラジカル産生の評価は理解の酸化還元規制で、健康と病気、シグナル伝達で重要ですがこれらの種の測定が高いフリーラジカル種の半減期が短いために挑戦と技術一般的に使用されるメソッドの制限。フリーラジカルの検出のためだけに明確な方法である、EPR は酸化還元の生物学で貴重な強力なツールです。このプロジェクトは、実験計画と異なる細胞コンパートメン...

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開示事項

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謝辞

この作品は、コロラド大学大学院医学研究科長の戦略的研究基盤賞、R01 HL086680-09 ・ 1R35HL139726-01、E.N.G.、UCD CFReT 奨学 (彼) によって支えられました。著者に感謝博士サンドラ イートンと博士ギャレス イートン (デンバーの大学)、博士ジェラルド ローゼンと博士ジョセフ p. 花王 (メリーランド大学)、博士スジャータ ベンカタラマン (コロラド大学デンバー) 役に立つ議論のためジョアン Maltzahn、アシュリーTrumpie とアイビー ・ マクダーモット (コロラド大学デンバー) のテクニカル サポート。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEMLifeTech10566-016cell culture media
Diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA)Sigma AldrichD6518-5G
sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific  BP358-212used to prepare 50 mM phosphate saline buffer  according to Sigma aldrish  
potassium phosphate dibasic (HK2PO4 )Fisher Scientific  BP363-500used to prepare 50 mM phosphate saline buffer  according to Sigma aldrish  
potassium phosphate monobasic (KH2PO4 )Sigma AldrichP-5379used to prepare 50 mM phosphate saline buffer  according to Sigma aldrish  
Krebs-Henseleit buffer (KHB) (Alfa Aesar, Hill)J67820
Bovine erythrocyte superoxide dismutase (SOD)Sigma Aldrich S7571-30KU
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma AldrichP1585-1MGDissolve in DMSO
Antimycin A (AA)Sigma AldrichA8674-25MGDissolve in Ethanol and store in glass vials(MW used is the averaged molecular weights for four lots)
1-Hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CMH)Enzo Life SciencesALX-430-117-M050
1-Hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CPH)Enzo Life SciencesALX-430-078-M250
1-Hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethylpiperidine, 1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido]piperidinium dichloride ( mito-TEMPO-H)Enzo Life SciencesALX-430-171-M005
1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-4-yl-trimethylammonium chloride . HCl (CAT1H)Enzo Life SciencesALX-430-131-M250
Heparin Sagent PharmaceuticalsNDC 25021-400-10
Diphenyliodonium chloride Sigma Aldrich43088
Deferoxamin mesylate saltSigma AldrichD9533-1G
CritosealLeica39215003
BRAND disposable BLAUBRAND micropipettes, intraMarkSigma Aldrich708733Capillaries
PTFE FRACTIONAL FLUOROPOLYMER TUBING
3/16” OD x 1/8” ID		NORELL1598774ATeflon tubing 
SILICONE RUBBER STOPPERS FOR NMR SAMPLE TUBES  FOR THIN WALL TUBES HAVING AN OD OF 4mm-5mm (3.2mm TO 4.2mm ID) TS-4-5-SRNORELL94987
EMXnano Bench-Top EPR spectrometer Bruker BioSpin GmbHE7004002
EMX NANO TISSUE CELLBruker BioSpin GmbHE7004542

参考文献

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