マウスにおける糸球体濾過率の経皮吸収測定

要約

ここで経皮 GFR モニターを使用してマウスを自由に移動して、意識し、糸球体濾過率 (GFR) を測定するためのプロトコルを説明します。

要約

糸球体濾過率 (GFR) の経皮的分析は、急性腎障害、慢性腎臓病のマウスやラットのモデルで腎機能を評価するために使用されている確立された技術です。測定システムは、意識、自由に移動する動物の背中の皮膚に直接接続されている、外因性の GFR トレーサー フルオレセイン イソチオ シアン酸 (FITC) の排泄動態を測定する小型蛍光検出器で構成されています共役 sinistrin (アナログ菊芋)。このシステムは、ラットで詳細に記載されています。ただし、サイズが小さいためマウスにおける経皮的 GFR の測定技術問題が増えます。本稿で我々 したがって数年以上はマウスでこのアッセイを行っている人、3 つの異なる研究者の結合された経験に基づくマウスの経皮 GFR モニターを使用する最初の詳細な実用的なガイドを提供します。

概要

経皮の使用 GFR マウス モニター シュライバーと同僚によって 2012 年に報告された、このテクニックを使用して得られる GFR 測定を比較することによって検証された結果によって得られる FITC sinistrin ボーラス クリアランスからの直接測定シリアルの血中には¹を。日には、経皮的 GFR モニターがラットおよびマウスで使用されている 35 のピアレビュー論文があった (雑誌記事と前臨床の GFR モニターが使用された会議抄録の定期的に更新されるリストはで見つけることができます、MediBeacon のウェブサイト²)。ラットおよびマウスの経皮 GFR 測定は出版物^1,3,4、5数で記述され、ラットでの使用を示すビデオ チュートリアルが公開された⁶をされています。ただし、マウスの測定は追加の技術的な課題を提示します。ここでは、我々 はマウスに経皮 GFR モニターを使用する最初の詳細な実用的なガイドを提供します。

様々 な齧歯動物モデルにおける腎機能を評価するため経皮 GFR のモニターの使用を支持する調査を開始する理由の理由があります。FITC sinistrin クリアランスの測定を経皮腎腎血清クレアチニンと血中尿素窒素 (BUN)^{7などの従来のパラメーターと比較してより高感度で正確な測定を提供するために示されています。 8}。評価の改善アルゴリズムを実装すると、フリーデマン ・および同僚の金本位、GFR 測定³持続注入法に匹敵する精度をシステムに到達が示した。最近の研究は、動物の血で干渉することがなく急性腎障害 (AKI) の誘導後機能回復と同様、腎機能の初期の変化を勉強する経皮 GFR モニターを使用して逐次解析が使えるを示されています。ボリュームまたは血行動態、アッセイをシーケンシャルに必要でないために血液サンプリング^9,10。高精度、繰り返し同じ動物の感受性の GFR を測定する能力は、このテクニックをさまざまな異なった研究分野の魅力的になります。経皮吸収型 GFR モニターは、基礎やトランスレーショナル研究のための大学にだけでなく、新規化合物の毒性を評価するために製薬会社で使用されています。

プロトコル

英国と米国で地域ガイドラインに沿ったすべての動物実験を行った。リバプール大学で行われた実験は英国動物 (科学的なプロシージャ) の行為 1986 の下で付与されたライセンスの下で行ったし、リバプール大学倫理委員会で承認されました。ヴァンダービルト大学医療センターで行われたすべての動物実験は、ヴァンダービルト機関動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。

1. FITC sinistrin を準備します。

1. リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で FITC sinistrin を 40 mg/mL を準備します。
   注: 因数格納できる-20 ° C で品質のない顕著な減少と数ヶ月ただし複数の凍結融解は避けてください。FITC sinistrin が敏感な光 - 光から保護チューブを保持します。
2. FITC sinistrin 各マウスの必要量を計算します。
   1. 測定の各日に各マウスの重量を量る。
   2. 推奨投与量は 0.15 mg FITC sinistrin グラムの体重ごとです。

2. マウス作製

1. GFR 測定を受けながらマウスを別のケージを準備します。吸水紙タオルや食品のいくつかのペレットを提供します。

3. マウス (GFR 測定の前に 1-2 日) から毛を除去します。

1. 3% イソフルランとマウスを麻酔し、マウスが眠っているとマウスの呼吸率に応じて、1.5-2% イソフルレン麻酔を維持します。熱パッドの上になりやすいマウスを置きます。
2. マウスの後ろの 1 つの側面から毛皮のほとんどを削除するのに、毛皮の方向に逆行して、電気シェーバーを使用します。肋骨の首まで後ろ足の上部から剃る。
3. 綿棒 (図 1 a) を使用して剃毛エリアに脱毛クリームの薄い層を適用します。できるだけ肌に近いクリームが適用されるようにする毛皮の方向に対して綿棒を移動します。
4. 1-3 分後クリームを削除するには、綿棒と温水で洗浄します。スキンを表示する非常に赤とイライラ、測定後、測定を実行しないでくださいと皮膚の損傷を避けるために 72 時間以内の脱毛を繰り返してはいけない。

4. 経皮 GFR モニターを準備します。

1. 利用可能なパッチの 2 つのサイズのいずれかを使用します。最初は 2.5 × 3 cm²サイズを直接マウスで測定に使用できます。他のパッチは 6 x 3 cm²サイズのネズミやより大きな動物で使用するためのものです、マウス用小さいサイズにカットすることができます。
2. パッチの 1 つの側面裏面をはがし、明確なウィンドウのまさに上の Led を位置決め、接着面の GFR デバイスを固執します。
3. バッテリーのサイズに合わせて、スティック バッテリーにパッチの 1 つの側面に余分な接着剤パッチをカットします。

5. 経皮 GFR モニターに接続します。

1. 3.1 の手順で説明されているようにイソフルランとマウスを anaesthetize し、なりやすい熱パッドの上にマウスを置きます。経皮吸収型 GFR モニターの配置および FITC-sinistrin; の注入のみでマウスを麻酔します。FITC 減衰の測定のため麻酔から回復することができます。
2. 70% エタノールで剃毛済みの肌をクリーンアップします。マウスの下の低刺激性の絹テープを約 12 cm の場所 (図 1 b; テープの幅は、1.5-2 cm に還元すべき、それがマウスの幅が広すぎるではない)。
3. テープの位置だけで約 2 cm、マウスの右側に、残りの部分は左側。簡単装着と除去、測定後のテープの右側の 1 つの端を折る。手順 5.3 と 5.6 の左から右指示動物の右側にあるデバイスの配置、必要な場合に、動物の左側のデバイス配置のためスワップことができます。
4. デバイスにバッテリを接続、バッテリーを剥がし、安全にデバイスの上にそれを置きます。デバイスを使用する準備が、データ集録開始ときに青い光の発光ダイオード (Led) が点滅を開始します。
5. デバイスからバックアップを取り外し、剃毛の肌へ。Led は、肋骨-ウィンドウの公開する必要はありませんそれは余りに近く背骨や手足 (図 1) にデバイスを移動します。
6. 白のテープ デバイスを保護します。右側にあるセキュリティで保護されたデバイス、マウス周辺デバイス (図 1E) 左側のラップのすべての端ラップでしっかりと最初 (図 1)。理想的には、テープの左側だけカバーするデバイスとマウスの腹部の下右側の端します。
7. マウスの体のまわりと一緒にそれを押すことによってテープを貼ります。テープはしっかりと、しかしないしっかりと添付する必要があります。それが緩すぎる場合はデバイスが移動あまり動きの人工物を引き起こす。しかし、それが呼吸や動きを制限または皮膚にあまりにも多くの圧力を置くのでタイトなしないでください。
8. 安定した背景を取られる読むように FITC sinistrin 注入前に 3 分間、デバイスをそのまま残します。今回は、暖かい熱パッドやグローブと尻尾でいっぱい (このルートの場合) の尾静脈注射を準備する暖かい水。

6. FITC sinistrin 注入

1. FITC sinistrin (これは最も近い 10 μ L に丸められますことができます) の注入に必要な計算量とインスリンの注射器を準備します。
2. 尾静脈またはレトロ軌道注入で FITC sinistrin を管理します。FITC sinistrin クリアランス曲線上の複数のピークを避けるために 1 つがスムーズに迅速なボーラスで投与すべき。FITC sinistrin の管理で複数の試みをしなければならないより部分的な線量のみを管理することをお勧めします。

7、GFR の測定

1. 測定期間の長さ、イソフルラン麻酔から回復するための独自のケージにマウスを配置します。
2. 1.5 h のケージ内マウスを観察し、デバイスを削除します。高速で効率的、かつ一般的にマウスによってよく容認意識のマウスからデバイスの削除は、新しいユーザーがこのステップのマウスを anaesthetize することを好みます。
   1. 1 つのオプションとして、イソフルランとマウスを anaesthetize します。
   2. その他のオプションとして、デバイスを削除しながら、金属のバーを把握するマウスをできるように、ケージの上にワイヤー ラックにマウスを配置します。
3. 1 つのクイック、滑らかな動きで腹の下から白い漆喰テープをやってのけるし、皮膚からデバイスと黒漆喰の除去。バッテリーはまだデバイスから切断こと注意してください。
4. マウスをその家のケージに戻ります。

8. 読み取りとデータの評価

1. 慎重にデバイスからバッテリを取り外します
2. USB ケーブルをデバイスに接続し、コンピューターにケーブルを接続
3. 読み取りソフトウェア (Sensor_ctrl_app.exe) を開く
4. 順番では、「接続」、「読み取り」、「再名前」をクリックし、プログラムを終了して、「保存」
5. 処理し、評価解析ソフトウェアのデータをそれぞれのマニュアルに記載されています。

結果

ここでは経皮 GFR モニターを使用した代表的な結果を提案する.経皮モニターは、さまざまなマウス系統とアキと CKD²のモデルで使用されています。

図 2は、同時の対側腎の虚血再灌流障害 (IRI) の前後に男性の BALB/c マウスで代表の FITC sinistrin クリアランス曲線を示します。FITC sinistrin が健康なマウス (図 2 a) の循環から急速にオフになってが、クリアランスは大幅に遅延中のアキ (図 2 b, C) を持つマウス。マウスと非常に厳しいアキ、糸球体濾過 (図 2) の完全な欠如を示す FITC sinistrin 蛍光 90 分測定期間中の変更はするないです。

経皮吸収型 GFR 測定低侵襲し、複数の時点で同じマウスの腎臓機能の変化を監視する使用ことができます。図 3は、GFR シーケンシャル経皮 FITC sinistrin クリアランス測定基準によって決定の変更と IRI (同時対側腎で一方的な虚血) を誘導した後、1、2、4 の日を示しています。表示されるデータを含む FITC sinistrin クリアランス半減期 (図 3 a)、シュライバーら¹で定義されている測定の FITC sinistrin のクリアランス ハーフライフから GFR (図 3 b) が計算されます。

図 4、慢性腎臓病 (CKD) は説明¹¹として、遅延の対側腎が続く長期の一方的な IRI を実行することによって男性の BALB/c マウスで誘導されました。GFR は、初期の IRI 後 26 日目に経皮 FITC sinistrin クリアランスによって評価されました。FITC sinistrin 半減期 (図 4 a) の増加とそのため GFR (図 4 b) の低下は、これらのマウスの腎機能障害を示します。これらのデータは、CKD を持つマウスにおける腎機能の変化を測定する経皮 GFR 測定を使用ことができることを示しています。

図 5 aは、FITC sinistrin 半減期と密接に相関尿細管傷害の半定量組織学的評価と GFR のフル範囲の測定および無傷マウス IRI による安芸の重大度レベルが異なるマウスの以上を示しています。対照的に、血清クレアチニンと血中尿素窒素 (BUN) 示した正 FITC sinistrin クリアランス (図 5 bC)、弱い相関を示す GFR 測定の経皮が腎のより信頼性の高い測定を提供することが、損傷 (尿細管傷害スコア) 次のいずれかの血清のクレアチニンより IRI によるアキまたはパン。

図 1: 経皮 GFR モニターをアタッチします。脱毛 (A)、(B)、マウスの下にテープの配置の写真をここをクリックしてマウスの皮膚 (C) とマウスとデバイスしてください (D E) のまわりでテープをラップすることによって、デバイスのセキュリティ保護上のデバイスの配置この図の拡大版を表示します。

図 2: 同時対側腎の虚血再灌流障害 (IRI) の前後に男性の BALB/c マウスで例の FITC sinistrin クリアランス曲線。クリアランス曲線基準 (A) と 1 日後に IRI 手術 (B) を示す同じのマウスではこのマウスの腎機能を障害します。重傷を負ったマウスから曲線 (C) クリアランス IRI 手術後 1 日です。腎機能障害を示す測定期間中の FITC sinistrin のクリアランスはありませんでした。黒データ ポイントは生データを表します、青い線を表す 3 コンパートメント フィット、緑の線は、95% 信頼区間を表します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3: 男性 BALB/c マウス年齢 8-10 週間同時対側腎摘除術、片側性虚血を施行した (n = 5).GFR は手術後、ベースライン時、日に 1、2、および 4 を評価し、sham コントロール マウスと比較して (n = 5)。(A) の FITC sinistrin 半減期だったと共に使用マウスの体重 (B) の GFR を計算します。データ ポイントを表す個々 の動物と誤差は、平均と標準誤差を表します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 4: 男性 BALB/c マウス年齢 8-10 週 8 日目で遅延対側腎で一方的な虚血を施行した (n = 5).GFR 日 26 日によって評価され、年齢をマッチさせた健康対照マウスと比較した (n = 5)。(A) の FITC sinistrin 半減期だったと共に使用マウスの体重 (B) の GFR を計算します。データ ポイントは、個々 の動物を表し、誤差は、平均と標準偏差を表します。管状の損傷、過ヨウ素酸シッフ染色腎臓のセクションのスコアは 0 50 盲目オブザーバー (戦場と化して) によって壊死とキャストの形成の程度に基づいてだった。このメソッドは、Wang および同僚は¹²から適応されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 5: 腎機能/障害の 3 つのメジャーの相関 (管状の損傷の組織学的評価 (n = 39)、血清クレアチニン値 (n = 30) および血の尿素窒素 (BUN) (n = 30)) FITC sinistrin クリアランス (半減期) と。男性 balb/c マウスを施行した片側腎茎クランプ (25-45 分) または偽手術、アキの別の重要度を誘導するために対側腎摘出同時の様々 な期間および腎機能のパラメーターと病理組織学が 4 日目で評価しました後 IRI。尿細管傷害スコア (A; FITC sinistrin クリアランスと強い正の相関を示したR² = 0.88)、血清クレアチニン (B) と (C) のパンの両方示した正の FITC sinistrin クリアランス弱い相関 (R² = 0.64 と 0.52、それぞれ)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

ディスカッション

この原稿とそれに伴うトレーニング ビデオはマウスで GFR モニターの経皮吸収型の使用のための実用的なガイドラインを提供します。手順で最も重要な手順は、動物の背中と腹部のまわりでテープを安全に包装上のデバイスの正しい添付ファイルです。ベスト ポジションは若干左または正中線の右胸部の上です。デバイスのパッチと、肌にしっかりと固定する必要がありますが、彼らはなりません呼吸、運動を制限するか、デバイスの下の肌血液循環に影響を与える非常にタイト不良/不正確な測定するおそれがあります。さらに、彼らは麻酔から回復した後に意識下マウスにおける発生監視するので少し動き工芸品で経皮吸収測定での動きの結果から最も低い干渉体の一部デバイスの配置を修正します。この理由から、デバイスが配置されていないことが重要ですに近すぎる上下肢、マウスが自由に彼らの肩を移動できるようにします。

脱毛の GFR を増加させる経皮的測定の直前にその脱毛を示す予備的なデータと FITC sinistrin のクリアランスの測定に影響を与える GFR 測定の前に 1 〜 2 日、マウスを depilate することが重要だ、FITC sinistrin の明白な半減期。このメカニズムは不明です。したがって、実験と複数の時間ポイントを信頼性の高い測定を取得するために、GFR 測定を続行する前にこのプロセスから回復する肌を許可するように、事前にマウスを depilate することをお勧めします。脱毛クリームは、皮膚に化学的損傷を避けるために、事前申請の 72 時間以内の皮膚の同じ領域に適用されませんする必要があります。多くの場合、毛の再成長を要して数日または週までとので脱毛クリーム 72 時間以内の再適用容易に回避します。

血清の 50% とに、クレアチニンがマウス¹³、管状セクションによって排泄される、マウスが脱水¹⁴腎尿細管からの尿素の増加の再吸収があるため、血清クレアチニンと BUN は、腎機能の悪いマーカーです。しかし、その利便性のためこれらの試金はマウスのアキと慢性腎臓病の臨床研究における腎機能の主な措置として使用する続けます。ただし、マウス正常または正常腎機能¹³近くのクレアチニン排泄量を尿細管分泌の主要な貢献と一致して、血清クレアチニン FITC sinistrin クリアランスとはほとんど相関関係で示した高クリアランス率 (低FITC-sinistrin 半減期)、そのクレアチニンは軽度の腎障害をマウスの腎機能に依存しない測定を示します。対照的に、お団子は、軽度の腎機能障害を持つマウスで FITC sinistrin クリアランスとよく相関、貧しい人々 より重度の腎障害 (半減期 FITC sinistrin 高) をマウスでお団子と FITC sinistrin クリアランス相関があります。重篤な腎障害を病気の動物で脱水に伴う尿素再吸収の効果によって原因はこれです。

他のすべての塊のクリアランスや GFR 測定のため一定の注入技術と比較して、経皮吸収型 GFR 測定の主な利点は、慎重にタイミングの血液や尿のコレクションは不要です。合計低血圧ボリュームおよびラットと比較して尿量があれば特にマウスに挑戦できます。さらに、マウスは、古典ボーラス クリアランス実験¹⁵に必要な複数の採血ではなくデバイスと注射の添付ファイルについてのみ処理する必要があります。さらに、麻酔持続時間が短い、そのため時間をかけて個々 のマウスで繰り返し測定を行うことが可能です。周波数の測定を主に実行することができますは繰り返しなされる麻酔のセッションにマウス、静脈注射とローカル制度上の規則のための研究者の適性の健康状態に依存します。健康、無傷のマウスで、マウスの最小限またはない不利な効果を持つ毎日の経皮 GFR 測定を実行できます。しかし、負傷したマウス アキや CKD に苦しんでいる健康なマウスと同様に、繰り返しなされる麻酔セッションを容認する可能性が高い、従って測定の頻度を減らす必要があります。

ボーラス クリアランス マウスの GFR を測定方法と比較して、経皮吸収型 GFR 測定の主な制限は、絶対トレーサー濃度としてではなく、時間をかけて相対蛍光強度の変化としては、排泄速度は測定のみです。このため、細胞外容積¹⁶で正規化した GFR の非常に近い見積もりである排泄運動の単一の指数関数的減衰の速度定数を測定することだけです。ML/分で GFR を表現するため動物の細胞外容積が¹を実行 FITC sinistrin の血漿中濃度の同時測定があった先行研究で確立された変換係数を使用して見積もりをでしょう。ただし、この換算係数がない正しく推定細胞外液の液量も同様にすべてのマウスでよく液量は、さまざまな年齢を含む無関係な要因の影響を受けます、以来セックス、水分補給の状態 (これは手術によって影響を受ける可能性があります介入と同様腎障害)、¹⁷の重量と。しかし、ボーラス投与マウスにおける GFR の評価方法とは異なり経皮 GFR 測定はより少ないオペレーター依存の可変性投薬エラー、または採血のタイミングでエラーは影響を受けませんが、対象です。

経皮の GFR 測定技術のもう一つの制限は、基準信号シフトがスキンケア フルオロ デバイス添付ファイルおよびトレーサー注入に必要な麻酔の漂白のため測定の過程で発生します。この制限は、フリーデマン ・および同僚によって³補正アルゴリズムを実装することで修正されました。このアルゴリズムの実装は、GFR の評価の持続注入法に匹敵する経皮吸収技術の精度の向上につながった。

よく寄せられる質問は、経皮 FITC sinistrin クリアランス異なるマウス系統において皮膚の色素沈着に影響を与えるかどうかです。青色励起と緑色発光暗い顔料を吸収するので皮膚の色素沈着 FITC sinistrin 信号強度は減少 FITC sinistrin 測定からの信号。しかし、FITC sinistrin の排泄率は全体の独立した信号強度。さらに、測定信号が低いバック グラウンド信号は有色マウスで下も。バック グラウンド信号スキンケア フルオロの自家蛍光特性と励起光の反射の混合物である, ので、我々 は背景-最大信号の比率が同等、またはさらに改善、色素性の動物である発見しました。また、運動成果物に周囲の皮膚の露出によって引き起こされる光を反射、反射の光が色素沈着した皮膚も吸収されるので、有色マウスに縮小されます。

結論としては、提案したテクニックはすべての肌タイプのマウスを自由に移動を意識し、GFR の正確な測定ができます。テクニックは採血の独立、それ使用できます繰り返し同じ動物に CKD モデルの長期観察のためだけでなく、安芸の誘導後に発生した GFR の急速な変化の測定。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Transdermal GFR monitor (comes with 1 device, 2 batteries and 1 charger)	MediBeacon GmbH	TDM-MH001	Reading software: MPD Lab; Analysis software: MPD Studio
Additional Batteries	MediBeacon GmBH	PWR-BT0001
Attachment patches	MediBeacon GmbH	small: PTC-SM001; large: PTC-LG001
FITC-sinistrin	MediBeacon GmbH	FTC-FS001
Hypoallergenic silk tape	e.g. Durapore (1538-2), or Kendall (7138C), or Leukosilk (01032-00)
Anaesthesia chamber, isoflurane, oxygen
Heat pad
Electric shaver
Depilatory (hair removal) cream	e.g. Veet or Nair
Cotton buds
Cotton swabs
Timer
Scales
70% ethanol wipes