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要約

ここより反タウ抗体の作用のメカニズムを特徴付けるため治験ツールの作成目的とミクログリアによるタウ摂取量を定量的に評価する細胞に基づく試金を記述します。

要約

アルツハイマー病 (AD) は、進行性神経変性条件集計タウおよびアミロイド蛋白質を最終的に認知機能の低下につながる神経の機能障害を引き起こす脳の蓄積します。ニューロンの過リン酸化タウ凝集体は、広告に関連付けられている病理の主要な原因と考えられています。これらの集計はコンパートメントを細胞外に放出されると仮定されどこ彼らはタウ凝集を引き起こすさらに隣接する健康な神経細胞によってとら。この「プリオンのような"拡散は、バインドと細胞外タウ凝集体広告マウスの前臨床モデルで示すように、「中和」ことが出来る抗体によって中断すること。抗体が病態を減らす提案されたメカニズムの 1 つは、抗体吸収およびミクログリアでタウの病理学的集計フォームのクリアランスです。ここでは、ミクログリアでタウの取り込みを評価する定量的細胞アッセイについて述べる。この試金はマウスのミクログリア細胞株 BV 2 を使用して、高い特異性、変動の少ない、中程度のスループットが可能します。この試金によって生成されたデータは、反タウ抗体エフェクターの機能のより良い評価に貢献できます。

概要

アルツハイマー病 (AD) は、病理学的集計への構造変化と自己集合アミロイド β ペプチドとタウ蛋白を特徴とする進行性の神経変性状態です。オリゴマーと原線維変化1,2として異常リン酸化タウが蓄積される一方、通常水溶性アミロイド β ペプチドはオリゴマーや繊維のアミロイド β に変換されます。これらのタンパク質の凝集体は、記憶喪失とその後進行性認知機能の低下につながる神経細胞死を引き起こします。非生産的 neuroinflammation 誤って折りたたまれたタンパク質をオフに削減するなど、他の要因が悪化して、病を加速します。現在、広告に対しての介入戦略は、症候性の救済を提供するが、疾患修飾治療や予防はありません。

証拠が増えている AD の病理学の過リン酸化タウ凝集体の重要な役割です。非病理学の状態、微小管に結合し、神経細胞の細胞骨格にそのアセンブリを促進するネイティブ折り畳まれていないタンパク質です。タウでは、過リン酸化になると、骨格から切り離されて、ほとんど広告3に関連付けられている病理を引き起こすと考えられているニューロンのタウ集計へのクラスターします。タウ開始細胞内で、最初の蓄積を集約が、病気が進むにつれて元にとることができるの隣接またはシナプス接続している健康的なニューロンによる細胞外スペースに影響を受けたニューロンから放出されると見なされます、」プリオンのような方法」。内面、一度タウ集計はさらにタウ凝集を介してテンプレート構造変化4を誘導します。

この仮説によればタウ シードを中断することができる治療は遅く、tau の神経変性疾患のコースを逆に。これを支持する遺伝子の変異によりタウオパチーに影響を受け、受動的反タウ抗体を注入したマウス表示減らされたタウ病理と認知機能の改善5,6,7,8 ,9。しかし、抗体が病態を減らすメカニズムはまだとらえどころのないままです。

提案されたメカニズムは、抗体吸収およびミクログリア、脳の免疫細胞によってタウの病理学的集計フォームのクリアランスがあります。最近の出版物は、ミクログリアが効率的に内面化し、病理学的タウ種が低下して、表面の Fc 受容体を含む機構を介してFc 依存反タウ抗体によりこの機能を拡張を提案します。ミクログリアと受容体を介した貪食10,11。これらのデータは、抗体医薬の可能性のある重要なエフェクターとしてミクログリアを識別します。

我々 はミクログリアによるタウ摂取量を定量的に評価するセルベースのアッセイをここに記述します。この試金によって生成されたデータは、従って潜在的な AD の治療薬としての開発のさらなるステップに反タウ抗体を進めるための便利なツールを表す反タウ抗体の作用のメカニズムの解明を助けることができます。

プロトコル

1. BV 2 細胞文化

注: ハンドル BV 2 細胞バイオ セーフティ レベル 2 の包含の下。BV 2 セルラインを生成、エンベロープ遺伝子組換えマウス白血病ウイルスエンベ レトロ ウイルス (マウスの細胞だけに感染可能な)12このようなウイルスは、体外の変換能力と生体内で発癌性潜在性のために知られています。

  1. 高グルコース ダルベッコ BV 2 細胞改変イーグル培地 (DMEM) 4 x 104 で細胞を播くことによって 10% 牛胎児血清 (FBS)、100 U/mL ペニシリン、100 μ g/mL ストレプトマイシン、2 mM L-グルタミン (呼ばれる培養培地から) を添加しました。細胞/mL。
  2. 37 ° C で 5% CO2の加湿雰囲気の中で文化を維持します。
    注: セル成長緩くアタッチされ、懸濁液。

2. pH 感受性蛍光色素でラベル組換えタウ集計

注: Apetriらで説明するよう、タウ凝集体を調製しました。13反応バッファーに追加された Thioflavin T (ThT) がないことの違い。集約された 1.5 mL 遠心チューブに採取。50 μ M ThT ソリューションの 12 μ L でプールのサンプルの 118 μ L を混合することによって最終的な蛍光信号を確認しました。集計は、20,000 x g 4 ° C で 1 時間で凝集反応混合物を遠心分離により分離しました。上澄みは、単量体すべてのタウ凝集体に変換されたことを確認するため秒 MALS によって分析されました。ペレット (タウ凝集体) が凍結し、-80 ° C で冷凍庫に保存されているスナップ

  1. PH 8.5 1 Mg/ml の濃度で 0.1 M 炭酸水素ナトリウム緩衝 (NaHCO3) でタウ凝集体を再懸濁します (~ 20 μ M)。
    注: タウ凝集体の濃度に基づいて初期モノマー濃度 280 タウ単量体の吸収により評価した nm 0.31 mLmg-1cm-1の消散係数を使用しています。
  2. 氷の上を維持しながらプローブ超音波発生装置を使用して過熱を避けるために再懸濁凝集体を超音波照射します。
    1. (電源 250 W の超音波発生装置) の 65% の振幅を使用します。
    2. 3 の 8 パルスを実行 s 15 の過熱を避けるためにパルス間 s。
  3. 製造元の指示に従ってジメチルスルホキシド (DMSO) で pH 感受性色素 (今後参照する pH 染料として) の 8.9 mM 原液を準備します。
    注: は常に新鮮なソリューションを準備し、準備が当日のみ使用します。
  4. 0.2 mM の最終的な色素の濃度に 10 モル色素タンパク質のモルあたりを追加します。
  5. 上下に軽くピペッティングで混ぜます。
  6. 部屋の温度、光から保護で 45-60 分間反応混合物を孵化させなさい。
  7. 一方で、製造元の指示に従って列を脱塩デキストラン架橋ゲルを組み立てます。
  8. 25 ml の 0.1 M NaHCO3バッファー pH 8.5 含む 3 %dmso のコラムを平衡させ。流れを破棄します。
  9. 2.5 mL の容量の列に反応をラベリング タウ骨材の製品を追加します。サンプルが 2.5 mL 未満の場合は、2.5 mL の容量を達成するまでバッファーを追加します。
  10. サンプル パックのジェルを完全に入力、流れを破棄しましょう。
  11. 0.1 M NaHCO3バッファー pH 8.5 含む 3 %dmso の 3.5 mL で溶出し、溶出液 2 mL チューブに 4 画と同等を収集します。
  12. ビシンコニン酸 (BCA) アッセイによって 4 分画の濃度を決定します。
  13. -20 ° C のフリーザーに分類された蛋白質を格納します。

3 蛍光活性化セル (FACS) を並べ替え読み出しと取り込みアッセイ

  1. 日 1-セルの種子
    1. 培養中、追加 1 リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x を削除することによってフラスコ洗浄 BV 2 セルです。
      注: ボリュームを洗浄使用セル フラスコのサイズに基づいて異なります。たとえば、T175 フラスコ 10 mL の 1x PBS で洗浄します。
    2. フラスコから PBS を削除し、細胞がフラスコ (約 5 分) から切り離すまでの 37 ° C、5% CO2でトリプシン エチレンジアミン四酸 (EDTA) 0.05% と孵化によって細胞をデタッチします。
      注: トリプシン-EDTA 0.05% のボリュームは、使用セル フラスコのサイズによって異なります。たとえば、T175 フラスコ トリプシン-EDTA 0.05 %2 mL を使用します。
    3. 上下に 3 回 5 回からピペッティングによる培地を培養細胞を再懸濁します。
      注: 培養培地の量は、使用セル フラスコのサイズおよびこうしてフラスコ内のセルの合計数に基づいて異なります。たとえば、T175 フラスコ培養中の 8 mL を使用します。
    4. セルをカウントし、最終濃度 200 μ g/mL のヘパリンを含む培養液中で 1 x 10 の5セル/mL の細胞懸濁液を作成します。
    5. 細胞懸濁液 (2.5 x 10 の4セル) 96-well ティッシュ文化の底が平らなプレートのウェルあたりの 250 μ L をプレートします。
    6. 37 ° C、5% CO2で一晩プレートを孵化させなさい。
  2. 1 日目-準備 Immunocomplexes
    1. PH 色素 ― 氷の上を解凍します。
    2. 1 つの pH の 500 nM ソリューションの条件 65 μ 無血清培地 (SFM) (高グルコース 100 U/mL ペニシリン、100 μ g/mL ストレプトマイシンと 200 μ g/mL のヘパリンの DMEM) で色素タウ凝集体を準備します。
    3. 65 μ l で抗体希釈液の濃度、SFM のダブル、最後の 1 つを準備します。PH 色素タウ凝集体と 96 ウェル u 底板で抗体を混ぜます。条件ごとの最終巻は 130 μ l、pH 色素タウ凝集濃度は 250 nM。希釈プレートを封印し、37 ° C で一晩インキュベート
  3. 2-Immunocomplexes 取り込み日目
    1. BV 2 細胞から培養培地を削除します。100 μ L 室温 1x PBS で一度セルを洗浄します。
    2. Immunocomplexes の 125 μ L をマルチ チャンネル ピペットを使用してセルに転送します。37 ° C、5% CO2で 2 時間 immunocomplexes で細胞を孵化させなさい。
    3. 細胞から培養液を削除し、それを破棄します。100 μ L 室温 1x PBS で一度セルを洗浄します。
    4. 1x PBS を削除し、50 μ L トリプシン-EDTA 37 ° C で 20 分 0.25% と 5% のセルを扱う CO2.
    5. 養殖中の 200 μ L を追加し、セルをデタッチするのには、上下にピペッティングでよく再懸濁します。96 ウェルの U 下にセルを転送プレート。4 ° C で 5 分間 400 × gで遠心分離プレート
    6. 氷の上の皿を置く、150 μ L 氷冷 1x PBS で細胞ペレットを再によって回中小洗浄細胞を培養を削除します。4 ° C で 5 分間 400 × gで遠心分離プレート
    7. 氷の上のセルを入れ、追加 1 × PBS と再して細胞 150 μ L 冷たい FACS バッファー (1 x PBS、0.5% ウシ血清アルブミン (BSA)、2 ミリメートルの EDTA) ペレット洗浄を削除します。4 ° C で 5 分間 400 × gで遠心分離プレート
    8. 氷の上のセルを置く追加 FACS バッファーを削除し、200 μ L 冷たい FACS バッファー内の細胞を再懸濁します。
    9. FACS の生きているセル ゲートの 2 × 104イベントを取得してすぐにサンプルを分析 (手順 4.1 を参照してください)。

4. FACS 解析

注: はゲートの戦略の図 1を参照してください。

  1. 前方散乱領域を使用して対側散布領域 (SSC-A) 密度プロット、前方散乱レベルが低い (すなわち破片や死んだ細胞) のイベントを除外することによって生きているセルのゲート (FSC A)。
  2. 生きている細胞集団内で使用 FSC の前方散乱高さ (FSC H) 細胞ダブレットと集計を除外するとします。これは一重項門です。
  3. 一重項ゲートのイベントを使用して、pH 染料の 1 つのパラメーターのヒストグラムを生成します。
  4. 平均蛍光強度を決定します。として否定的な細胞を除外することによって pH 色素タウ陽性細胞の割合を用いて BV 2 唯一のコントロールを決定します。

5 顕微鏡読み出しで Immunocomplexes の取り込み

  1. 日 1-セルの種子
    1. 3.1.1、3.1.2、3.1.3 の手順で説明するように、BV 2 セルを準備します。
    2. セルをカウントし、最終濃度 104セル/mL の培地を培養でそれらを再懸濁します。
    3. 細胞懸濁液の 150 μ L をプレート (1.5 x 103) ポリ-D-リジンの井戸あたり底が明確な平坦な黒 96 ウェル プレートをコーティングします。
    4. 48 h の CO2を 37 ° C、5% でプレートを孵化させなさい。
  2. 3 日目-準備 Immunocomplexes
    注: 顕微鏡の結果を改善するために抗体の孵化前にラベル付けされたタウ凝集体の穏やかな超音波処理を行った。
    1. PH 色素 ― 氷の上を解凍し、氷の上を維持しながらプローブ超音波発生装置を用いた超音波照射します。15% (250 W の超音波発生装置電源) の振幅を使用します。2 s とパルス間待機 20 s 30 パルスを実行します。
    2. SFM で pH 色素タウ凝集の 500 nM ソリューションの条件につき 65 μ l を準備します。
    3. 濃度 2 倍、最後の 1 つに SFM の 65 μ l で抗体を希釈します。PH 色素タウ凝集体と 96 ウェル u 底板で抗体を混ぜます。条件ごとの最終巻は 130 μ l、pH 色素タウ凝集濃度は 250 nM。希釈プレートを封印し、37 ° C で一晩インキュベート
    4. 細胞板からメディアを削除し、200 μ g/mL のヘパリンを添加した培養中の 150 μ L に置き換えます。37 ° C、5% CO2で一晩プレートを孵化させなさい。
  3. 日 4-Immunocomplexes の取り込み
    1. BV 2 細胞から培養培地を削除します。Immunocomplexes の 125 μ L をマルチ チャンネル ピペットを使用してセルに転送します。
    2. 5% CO2と 37 ° C で 1 時間 45 分の immunocomplexes で細胞を孵化させなさい。
      細胞核 DNA 特定染付とプローブを選択的に低 pH 細胞コンパートメントを汚れを酸性細胞小器官を染色します。セル 5% CO2と 37 ° C で 15 分間、インキュベートします。
      注: は、SFM の染料を薄めます。
    3. 生細胞イメージングを使用してスクリーニング共焦点システム高コンテンツを実行します。温度を 37 ° C、5% CO2に設定します。高品質の画像、63 X 水浸対物レンズを使用し、0.5 μ m の平面 (Z スタックごと 20) イメージ フィールドごとの取得します。

結果

集約された組換えタウは、pH 感受性緑色色素で標識した共有。この色素は、酸性オルガネラ、細胞内定量化でき、その内面に蛍光を大幅に増加します。ラベル付けされたタウ凝集反タウ モノクローナル抗体を添加されました。特に、我々 は CBTAU 28.1 のキメラ バージョン (マウス IgG1 の Fc 領域) を使用しました。このひと抗体はタウの N ターミナル挿入領域にバインド、体外生成タウ線維13をバインドできません。この分析では、また、CBTAU-28.1-dmCBTAU 28.1 の親和性の改良版をテストしました。親と高親和性変異株における CBTAU-28.1 の fab 断片が書式設定、および制御するマウス IgG1 アイソタイプ コントロールとして使用されました。

BV 2 セルは前もって形成された immunocomplexes の培養またはタウ抗体に依存しないタウの吸収をブロックするヘパリン存在下で 2 時間だけを合計します。インキュベーション後、細胞は細胞膜にバインドされたタウを削除するトリプシンし、フローサイトメトリーによるタウ吸収分析を行った。13最近述べたように、用量依存的で BV 2 細胞内のタウの CBTAU 28.1 昇格亜種取り込みを観察しました。Fc CBTAU 28.1 Fab フラグメントは基底タウ吸収 (図 2) を増加しなかったので仲介の取り込みだった。また、親和性の高い dmCBTAU 28.1 抗体は、野生型抗体 (図 2) よりも高い程度に BV 2 セルにタウ取り込みを介する。

タウの抗体を介した取り込みと endolysosomal コンパートメントでタウ凝集体の局在が確認された共焦点顕微鏡 (図 3)、酸性の細胞内コンパートメントは、低 pH 細胞小器官の選択性のプローブを使用して染色されました。緑 pH 色素の細胞内の点は、タウ CBTAU 28.1 で培養された細胞内凝集体がみをラベル付けします。さらに、細胞内のタウ凝集体はしばしば低 pH 区画選択の赤色の色素は酸性の細胞内小器官でタウ凝集体の存在を示唆と結果。CBTAU 28.1 Fab フラグメントは、Fc 受容体を介した内部化メカニズム (図 3) をもう一度示すタウ取り込みを増加しなかった。

figure-results-1387
図 1: タウ BV 2 細胞によって内面を検出するため流フローサイトメトリー解析で使用される戦略をゲーティングします。BV 2 唯一のコントロール (A ~ C)、アイソタイプ コントロール (D F)、dmCBTAU 28.1 からサンプル データ (G-私) が表示されます。BV 2 セル人口は、破片や死んだ細胞 (a、D、G) を除く FSC A 対 SSC の密度プロットのゲートだった。BV 2 細胞が細胞ダブレットと集計 (B, E, H) を除外する FSC A 対 FSC H 密度プロット上さらにゲートだったし。単一のセル ゲートは pH 色素 (これらの代表的な結果に FITC) 単一のパラメーターのヒストグラムを生成に使用された (C、F、私) と幾何学的平均蛍光強度を決定します。また、BV 2 コントロールだけを使用して決定される否定的な細胞を除く pH 色素タウ陽性細胞の割合を求めた.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

figure-results-2133
図 2: CBTAU 28.1 仲介 BV 2 ミクログリア細胞にタウ凝集の取り込みします。集約された組換えタウだった共有緑の蛍光性 pH 感受性色素で標識し、培養ひと抗タウ抗体の親和性改良形式、dmCBTAU-28.1 CBTAU-28.1 のマウス キメラ バージョンと対応する Fab フラグメントの、マウス IgG1 アイソタイプ コントロール抗体またはない抗体 (タウ凝集体だけで)。BV 2 細胞と抗体に依存しないタウの吸収をブロックするヘパリン存在下における 2 時間の Immunocomplexes その後培養。Immunocomplexes の吸収はフローサイトメトリー評価され、細胞 (B) (A) 蛍光または肯定的なタウ (tau +) の割合の幾何平均 (GM) として表されます。誤差範囲 (A) では、2 つの独立した実験の標準偏差を示す、単一の実験 (B) 番組中。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

figure-results-2851
図 3: タウ集計 BV 2 細胞によって内面化および細胞の酸性細胞器官に局在する。前もって形成されたタウ抗体 immunocomplexes BV 2 細胞と抗体に依存しない吸収をブロックするヘパリン存在下で 2 時間培養。インキュベーション後、DNA 特定青い染料と低 pH 区画選択赤い色素で酸性の細胞内コンパートメントに核が染色された.住セルイメージ投射 28.1 CBTAU と dmCBTAU-28.1 アイソタイプ コントロールではなく、培養細胞内 (緑) ラベル タウ凝集体の細胞内の涙点を明らかにしました。さらに、細胞内のタウ凝集体赤で, 多くの場合色素 (黄色) 酸性の細胞内コンパートメントにタウ凝集体の存在を示唆します。CBTAU 28.1 Fab フラグメントは、内面化、Fc 受容体媒介のメカニズムを示すタウ取り込みを増加しなかった。画像は、63 X 水浸対物レンズをつけた 20 面 (0.5 μ m の平面) の Z-スタックの最大輝度投影相関を表します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

ディスカッション

居住者の脳の免疫細胞、ミクログリアは、最近タウオパチー10,11の抗体治療アプローチで重要なプレーヤーとして識別されています。ライソゾーム神経取り込み9、抑制または線維形成13,14の不安定化と intraneuronal 線維を介してのクリアランスのブロックと共に、ミクログリアによって抗体を介したタウ クリアランス経路15タウオパチー5,6,7,8,9マウス モデルにおいて抗タウ抗体の有効性に貢献するかもしれないすべて。

我々 は良い反タウ抗体の作用のメカニズムを特徴付けるため治験ツールの作成目的とミクログリアによるタウ摂取量を定量的に評価するセルベースのアッセイを紹介します。

このアッセイは、ファンクらから適応11BV 2 細胞は、不死化マウスのミクログリア細胞を使用します。彼らは多くを備えて完全には主要な小グリア細胞に比較できません中、a β とタウ線維11,16,17 を貪食確実の能力を含むプライマリ ミクログリアの特性、、18,19。また、彼らは、再現可能な動作の in vitroアッセイ開発と最小限の実験的変動を必要とする量的研究にきわめて適してさせ示した。この横に、不死化細胞株はスループット アッセイを許可して、プライマリ ミクログリアの使用と比較して動物の犠牲のための必要性を排除します。

我々 はこの試金で使用されるタウ凝集体は、13、および類似の形態対ヘリカル フィラメント (PHFs) 広告の脳から分離されたショーの説明を最近、再現性の高い体外集計の手順を使用して得られました。患者。プラスチックやガラスの表面にタウ凝集付着によって引き起こされた可能性があります、予期しない結果を観察しなかった我々 は、間安定してよく特徴付けられるタウ凝集体の使用はこの測定の再現性に重要な役割を果たした。

アッセイの再現性に著しく貢献したもう一つの側面は、細胞密度だった。プロトコルに記載されているウェルあたりの細胞数は、説明の条件に最適な細胞密度を表します。

どのようなファンクらとは異なる11記述されている、我々 は細胞内定量化することができます酸性オルガネラで内面に蛍光が増大、pH 敏感な染料にタウの凝集体をラベル付けされます。これは、表面のトリプシンの消化力と共にバインド immunocomplexes やタウ、フローサイトメトリーを用いて蛍光信号を保証は、タウの吸収ではなく、細胞表面へのバインドの結果。また、表面の消化を必要とせず顕微鏡実験で内面化されたタウ凝集体の検出バインド、なる immunocomplexes/タウ凝集 pH 敏感な染料容易の使用には、セルは再メッキと回復が必要です。

我々 はまたさらに我々 の分析は、以前説明した11をされているものと比較しての顕微鏡読み出しを最適化、顕微鏡実験ではない私たちを許可する酸性オルガネラの選択性の高い色素を使用して確認するのみ抗体タウの取り込みも endolysosomal コンパートメントでタウ凝集体の局在化。

我々 が開発したアッセイは、正と負のサンプル間の分離を許可する良い実験ウィンドウで結果を最適な特異性。興味深いことに、アッセイ直接検出されない従って反タウ抗体エフェクターの機能を研究するための強力なツールを表す抗体の親和性の違い。

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

彼の貴重な技術支援のアルベルト ・ Carpinteiro soares さんに感謝したいと思います。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
BV-2 cellsICLC Interlab Cell Line CollectionATL03001
Phosphate Buffered Saline (PBS) (1x)Gibco10010-015
Trypsin-EDTA 0.05%Gibco25300-054
DMEM 4.5 g/dL glucoseGibco41966-029
Fetal Bovine SerumGibco10091-148
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Gibco15140122
L-Glutamine 200 mMLonza17-605E
EasYFlaskNunc156499 / 159910
pHrodo Green STP esterLife TechnologiesP35369 
Sodium Bicarbonate pH 8.5 100 mM
DMSOSigmaD2650-100ml
PD10 columnsGE Healthcare17-0851-01
BCA Protein Assay KitThermo Fisher Scientific23225
Greiner CELLSTAR multiwell culture platesGreiner665180
Falcon 96-Well Assay PlatesFalcon353910
HeparinSigma H3393-50KU
Trypsin-EDTA 0.25%SigmaT4049-100ml
BSASigmaA7030-100G
EDTA 0.5 M, pH8
FACS Canto IIBD
Hoechst 33342 Solution (20 mM)Thermo Fisher Scientific62249
LysoTracker Deep RedThermo Fisher ScientificL12492
Opera PhenixPerkin HelmerHH14000000

参考文献

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