NlsGPS1 蛍光共鳴エネルギーを使用して可視化、細胞ジベレリン レベル移動 (FRET) バイオ センサー

要約

ジベレリン認識センサー 1 (GPS1) は最初蛍光共鳴エネルギー移動に基づくバイオ センサー ジベレリン植物生長ホルモン高時空間解像度の携帯電話のレベルを測定するため。このプロトコルは視覚化し、シロイヌナズナの胚軸と根の遺伝的コード化 nlsGPS1 バイオ センサーを用いた細胞ジベレリン レベルを定量化する手法について報告します。

要約

植物ホルモンのジベレリン (GA) 植物の種子の発芽、細胞伸長と発達的変化に重要な役割を果たしている小型の可動式シグナル伝達分子であります。ジベレリン認識センサー 1 (GPS1) は、最初の蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET)-バイオ センサーの開発生体内で細胞のジョージア州レベルの監視を可能にします。核局在 GPS1 (nlsGPS1) の蛍光放出比を測定することにより様々 な組織における内因と外因に指定された GA 勾配の時空間マッピングは、細胞規模で可能です。このプロトコルは、3 例の実験における nlsGPS1 放出比をイメージする方法を説明します: 定常状態前に、と後ジベレリン A₄ (GA₄) 治療と治療の経過。我々 は、フィジーと商業の三次元 (3 D) 顕微鏡可視化と解析ソフトウェアを使用して nlsGPS1 排出量比を分析し、制限とジベレリン レベルを定量化する nlsGPS1 を使用しての可能性がある落とし穴を説明するメソッドもあります。

概要

植物ホルモンは植物の成長と開発の基本的な役割を果たします。これらの小型の可動式シグナリング分子は通常生合成、代謝、短距離と長距離輸送^1,2,3,4など、いくつかのレベルで調整されます。長年にわたりホルモン シグナル伝達経路と下流の転写反応の理解を削っています。ただし、ホルモン分布の監督規制の入力を持つホルモン シグナル伝達経路の多様な細胞応答をリンクする細胞スケールでホルモン レベルの時空間的定量化が必要です。植物ホルモンを検出することができますフレット ベースのバイオ センサーは、細胞規模でホルモンのレベルを定量化する科学者の能力を進めることができます。Fret バイオ センサーは、特定リガンドの結合または生物学的刺激に応答する感覚のドメインにリンクされているフレット ペア (ドナーとアクセプタの蛍光タンパク質) で構成されます。小分子バイオ センサーのリガンドは、距離・方向をフレットのペアの 2 つの蛍光蛋白質間の変化の結果感覚ドメインの構造変化をトリガーします。FRET バイオ センサーのレシオ メトリック解析は、エキサイティングなドナーとドナー^5,6受容体の蛍光放出比を測定によって行われます。リガンドはこの排出量比⁷の変化として検出します。

我々 は最近植物ホルモン ジョージア州ガス、種子の発芽、細胞伸長および開花段階に植物から発達の移行を促進することができますホルモンのクラスの fret バイオ センサーを開発しました。NlsGPS1 バイオ センサー核はローカライズし、多様な植物組織における ga に時空間の洞察を提供します。シロイヌナズナ細胞 GA 可溶性受容体、ジベレリンを区別しないドワーフ (GID) にバインドし、複雑な della GA²をシグナル伝達の負の制御因子としての劣化を誘発します。NlsGPS1 の GA 感覚ドメイン ・ デッラ ・蛋白質 (AtGAI) の 74 アミノ酸切り捨てにリンクされているシロイヌナズナGA 受容体 (AtGID1C) で構成され、フレットのペアから成る強化ドナー蛍光タンパク質としてセルリアンの二量体化亜種とアフロディーテ (コドン多様ヴィーナス) 受容体蛍光タンパク質⁸として。NlsGPS1 バイオ センサーは生理活性の GA₄高親和性センサー (K_d = 24 GA₄nM) 多様な組織型をマップし、GA グラデーションを定量化で利用できます。生体内でのシロイヌナズナジョージア州レベルの誤解を避けるためには、また nlsGPS1 の応答していないバリアントを開発しました (nlsGPS1 NR) ネガティブ コントロールとして使用します。NlsGPS1 NR タンパク質は、ジョージア州の結合を妨げる GA 結合ポケットの変異と GID 受容体タンパク質^7,9との相互作用を妨げる・ デッラ ・蛋白質の変異を運ぶ。放射比パターンまたは nlsGPS1 と nlsGPS1 NR の線で観測された変化は工芸品 GA 結合イベントに直接関連しない考えられます。GA₄ nlsGPS1 バインドが、急速に元に戻せる状態ではありません、したがって、細胞 nlsGPS1 排出量比はリアルタイムではなく、与えられた核の GA の最高最近集中を表すと解釈すべきことを注意してもです。定常状態レベル。結果として、落下のジョージア州レベルの解析は nlsGPS1 とできません。

ここで細胞モデル植物シロイヌナズナ、共焦点イメージング ベースのアプローチを使用して、高解像度の nlsGPS1 バイオ センサーを利用するための詳しいプロトコルを提供します。プロトコルでは、イメージングの植物の根と胚軸で定常状態と時間コースの両方について説明します。NlsGPS1 センサーはマップ、GA 分布を定量化し、植物の間でだけでなく、多様な組織型で利用される可能性があります。

プロトコル

1. 準備

1. ½ 培地、培寒天培地の pH 5.7 ないのスクロース (1 L) を準備します。
   1. 超純水水 950 mL の培地、培 (MS) 基礎培地の 2.2 g を溶解します。5 m 島 5.7 に pH を調整します。
   2. 純水で 1 L の最終巻にソリューションを構成します。500 mL のペットボトルを 2 つ、各含んでいる 1% 植物寒天に分割します。121 ° C、20 分でのオートクレーブ。
2. ¼ MS 液体 pH 5.7 ないのスクロース (1 L) を準備します。
   1. 超純水水 950 mL で MS の 1.1 g を溶解します。5 m 島 5.7 に pH を調整します。純水で 1 L の最終巻にソリューションを構成します。500 mL のペットボトルを 2 つに分割します。121 ° C、20 分でのオートクレーブ。
3. GA₄を準備します。
   1. GA₄ 100 mM GA₄在庫の最終濃度エタノール 70% を溶解します。
   2. 実用的なソリューションを準備、希釈する GA₄株式の 0.1-1 ¼ MS 液体 pH 5.7 μ M。

2. 植物の成長

1. シロイヌナズナの種子を滅菌します。
   1. 化学のフードを使用して動作します。2 mL 遠心チューブに分注種 (約 200 種)。耐塩素用インクとマーカーを使用し、滅菌容器 (封印できる大型ボックス) 内オープン蓋管を配置します。
   2. 50 mL の超純水の殺菌容器内ナトリウム次亜塩素酸溶液 50 mL を含む 250 mL ビーカーを置きます。
   3. ビーカーに塩酸 (HCl) 3 mL を追加します。すぐに容器を密封し、6-16 h の塩素ガスによる殺菌を許可します。
   4. 容器を開封後種子ラックにすべてのマイクロ遠心チューブ用の蓋を閉じます。メッキの時まで乾燥滅菌種子を格納できます。
2. ½ MS 寒天培地角皿に約 20 の滅菌シロイヌナズナの種をまきます。多孔性のサージカル テープでプレートをシールし、アルミ箔でそれらをラップします。成層の 1-3 日のための 4 ° C でそれらを孵化させなさい。
3. ルート イメージング プレートを垂直に成長室に次の成長条件が 3 日間転送: 長日条件 (LD、闇の光/8 h の 16 h);120 µmol⋅m^-2の^-1光強度。(光周期) の間に 22 の ° C の (暗いサイクル) の間に 18 ° C 温度 65% 相対湿度 (RH)。
4. 暗所で育てた胚軸: 発芽を同期する 1-4 h の光パルスの成長室にプレートを転送します。アルミ箔と板をラップし、3 日間の垂直に成長室に配置します。

3. サンプル準備

1. 定常測定 (図 1 a)
   1. きれいな顕微鏡スライド (さあ今からモック ソリューションとしてと呼ばれる) ¼ MS 液 50 μ L を追加します。軽くスライドする板から nlsGPS1 を表現する苗を転送します。
   2. きれいな観察を取るし、カバーガラスのそれぞれの角に真空用グリースの滴をスポットします。優しく、coverslip の苗を置き、慎重に空気の泡を削除する余分なモックのソリューションを追加します。
2. GA₄治療: 化学実験 (図 1 b).
   1. GA₄治療の前に長方形を描きます (ピペット先端部に添付) 真空グリースでいっぱい 20 mL 注射器を使用 (長さ: 3.5 cm の高さ: 2.5 cm) きれいなガラス スライド (図 1 b) の真空用グリースの均一層で。可能にする真空用グリースの微妙な境界線、ピペット先端部は直径 1 mm の開口部を持ってにカットする必要があります。
   2. スライド ガラスにモック溶液 50 μ L を追加します。きれいな鉗子 nlsGPS1 苗を選ぶし、モックのソリューション上に静かに置いてください。損傷を防ぐため、生検鉗子で苗を把握せず、子葉の下側をサポートすることで苗を転送します。
   3. きれいな観察を取るし、カバーガラスのそれぞれの角に真空用グリースの滴をスポットします。鉗子を使用して、真空グリース四角形の中心に、coverslip を配置します。今、coverslip、真空グリース長方形の長い辺に対応する 2 つの側面にシールされます。
   4. 慎重に貯水池を埋めるためし、内部 seedling(s) を乱すことがなくタンク内空気の泡を削除する余分なモックのソリューションを追加します。
   5. 共焦点顕微鏡を用いた GA₄処理の前に、画像を取得します。このプロトコルのセクション 4 で説明した指示に従います。
   6. GA₄治療のためには、共焦点の段階から顕微鏡スライドを削除します。20 分のタイマーを設定します。
   7. タイマーを起動した後、¼ MS 液 1 μ M GA₄を含む緩衝液を交換します。Coverslip の左側から GA₄ソリューション (約 50 μ L) を追加し、右側から前 (モック) ソリューションを削除します。約 10 分 (図 1 b) を乗せたモックのソリューションを完全に置換するソリューションを交換で維持します。
   8. 顕微鏡ステージ上にスライド ガラスを配置します。GA 後イメージを取得する前に、別の 10 分を待ちます。
3. 興味の組織の時間経過の設定します。
   注:例えば、興味の組織では胚軸や根があります。我々 は日常的に商業灌流システムを使用して nlsGPS1 バイオ イメージングの時間コースを実行 (図 1表の資料を参照してください) または RootChip^7,10,11。
   1. 粘着性があるスライドの灌流チャネルの中心にモック溶液 200 μ L を追加 (材料の表を参照してください)。優しく nlsGPS1 苗を選ぶし、粘着性があるスライドでモックのソリューションの上に置きます。
   2. 鉗子を使用して、優しくガラス基板を配置、粘着性があるスライドの周囲に粘着性の材料との強い絆を形成、coverslip の外側のエッジを軽く押します鉗子の裏面を使用して。
   3. 2 肘ルアーロックを使用して (0.8 mm 内径 [ID]) を使用してコネクタと、番号 (0.8 mm)、シリコーン チューブは、20 mL の注射器と回収流出液出口コンテナーは粘着性があるスライド接続します。シリコン チューブに注射器を接続する (0.8 mm の ID) を持つルアー ロック コネクタを使用します。
   4. 含む十分な溶液商工会議所、商工会議所に気泡がないように手動で模擬液注射器を優しく押します。置き、プログラム可能なシリンジ ポンプにシリンジを保持します。
   5. シリンジ (すなわち.、径と体積) 流量ポンプのマニュアルによると、特定のポンプのパラメーターを設定します。
      注:このプロトコルでは 1-3 mL/h の流量が使用され、これは実験の要求に応じて変更できます。時間のコースを開始するには、ポンプを始動します。
   6. GA₄処理時間コース (図 1) に、ポンプを置くことで、血流を停止および GA₄と補われる新しい 1 つ含む ¼ MS 液体で、注射器を変更します。次のセクションで示すように、共焦点レーザー顕微鏡を続行します。

4. 顕微鏡

注:我々 は、共焦点レーザー顕微鏡を実行します。

1. レーザーを搭載した共焦点顕微鏡を使用して FRET イメージングを実行する画像を取得します。
   注:NlsGPS1、シアンの蛍光蛋白質 (CFP) および黄色い蛍光蛋白質 (YFP) の亜種が作成されます。このプロトコルでは商業顕微鏡 (テーブルの材料1 と 2 の顕微鏡として記載されているを参照してください) は、10 倍や 20 倍乾燥 0.70 高調波複合 PLAN APO 目標で使用されます。
2. 顕微鏡 1、使用 448 nm および 514 nm の波長レーザー CFP と YFP をそれぞれ刺激します。逐次スキャンを取得します。CFP の励起後 CFP (ドナー排出) 460-500 nm と YFP (フレット排出) 525-560 nm を検出する検出器 (HyD SMD など) を設定します。2 番目のシーケンスを使用して、YFP の励起後の YFP (YFP 排出) 525-560 nm を検出する検出器を設定します。
   注:この YFP の蛍光は、商業の 3次元顕微鏡可視化と解析ソフトウェアを使用してサーフェスを生成する式コントロールとしてだけでなく、核をセグメント化に使用されます。
3. 顕微鏡 2、使用 440 nm および 514 nm 波長レーザー ライン CFP と YFP をそれぞれ刺激します。2 つのトラックを取得します。トラック 1、YFP (フレット排出) の CFP の励起後 CFP (ドナー排出) 464-500 nm と 526-562 nm を検出する検出器 (例えば.、ChS) を設定します。トラック 2、YFP の励起後の YFP (YFP 排出) 526-562 nm を検出する検出器をセットします。
   注:この YFP の蛍光は、3次元可視化・解析ソフトウェアでサーフェスを生成する式コントロールとしてだけでなく、核をセグメント化に使用されます。
4. 512 x 512 ピクセルの形式と 12 ビットの解像度を使用して画像を取得します。
5. 利得はないピクセルを飽和しながら良好な信号を許可する経験的に決定される値を調整する必要があります。CFP とフレットの放出実験を間、ゲインを変更しないでください。1 風通しの良い単位 (AU) にピンホールを設定します。共焦点顕微鏡のステージに IBIDI の粘着性があるスライドを置き、前述示されているイメージングを続行します。
6. 顕微鏡 1 ソフトウェアの中ライブ スキャンをアクティブ利用上/下で光るイメージ画面の左上に位置する露出不足と関心領域の彩度を決定します。顕微鏡 2 ソフトウェアで利用する範囲のインジケーターイメージ画面の下側に位置する露出不足と関心領域の彩度を決定します。ための定量的画像解析は、ピクセルの彩度がない必要があります。
7. 1 μ m のステップ サイズの z スタックを設定します。ステップ サイズを増加 z 解像度の削減または取得またはイメージを作成することができます位置/サンプルの数を増やすに増加速度の増加します。自動時間のコースを設定した時間間隔で画像を取得する z スタック (集録モード] タブから xyzt モード) と一緒に時間を設定します。

5 フィジーを用いた画像解析

注:ImageJ (フィジー) を使用して画像データを処理し、シロイヌナズナnlsGPS1 排出量比率の 2 次元 (2 D) 画像を生成することが可能です。画像の例については、図 2 a 2 C、 2 e 2 G、および3 aを参照してください。ImageJ は、検索機能を使用してこのプロトコルの各コマンドを見つけることが可能です。コンピューターのキーボードのスペースバーと Lを押します。新しいウィンドウが開きます。検索フィールドに必要なコマンドを入力します。

1. フィジー (画像 J) にファイル (.lif または .lsm ファイル) をドラッグしてハイパー スタックとして画像を開きます。
2. メイン メニューから、画像を選択 >スタック> Z プロジェクトと選択合計スライス最大投影のように明るいピクセルだけではなく、すべてのピクセルをキャプチャします。
3. メイン メニューからプロセスを選択 >減算背景とセット ローリング ボール半径 50 ピクセル。その他のオプションの選択を解除し、すべての 3 つの画像を処理します。この手順では、「ローリング ボール」アルゴリズムを使用して背景を削除します。
   注: 50 ピクセル、経験的に前景として核を含むように決め。
4. メイン メニューから、画像を選択 >色>チャンネルの分割。3 つの新しいウィンドウが開きます: C1 合計(CFP チャンネル);C2 合計(フレット チャネル)、およびC3 合計(YFP チャンネル)。
5. C3 合計ウィンドウを選択し、メイン メニューからプロセスを選択 >フィルター >ぼかし (ガウス)し画像ノイズを低減する 1 のガウスぼかしを適用します。
6. メイン メニューから、画像を選択 >調整>明るさ/コントラスト自動選択。
7. メイン メニューからプロセスを選択 >コントラストを強調、およびセット飽和= 0.35。
8. メイン メニューからイメージを選択 >タイプ> 8 ビットと 8 ビット イメージにスタックを変換します。
9. メイン メニューから選択イメージ>調整>自動ローカルしきい値。自動ローカルしきい値で、次のパラメーターを選択: Phansalkar メソッド、半径 = 15、パラメーター 1 = 0、パラメーター 2 = 0、および白のスタック。このステップでは、YFP スタックはバイナリ マスクを作るに使用されます。
10. C2 合計ウィンドウを選択し、メイン メニューからプロセスを選択 >フィルター >ぼかし (ガウス) 1 のガウスぼかしを適用します。
11. C1 合計ウィンドウを選択し、メイン メニューからプロセスを選択 >フィルター >ぼかし (ガウス) 1 のガウスぼかしを適用します。
12. メイン メニューから、2 つのチャンネルから排出比スタックを作成するプロセスを選択 >イメージ電卓。イメージ 1、として選択してC2 合計が表示され、新しいウィンドウ演算子として分割を選択し、2 のイメージとしてC1 合計を選択します。
13. 新しいウィンドウを作成して32 ビット フォーマットを選択することを確認します。新しいウィンドウは、名前付きC2 合計結果が表示されます。
14. メイン メニューから、画像を選択 >ルックアップ テーブル> LUT 16_colors。
15. メイン メニューからプロセスを選択 >イメージ電卓。イメージ 1、として選択してC2 合計結果が表示され、新しいウィンドウで、演算子として乗算を選択し、画像 2 としてC3 合計を選択します。この手順で YFP バイナリ マスク、YFP 制御チャンネルにあるピクセルのみを表示する YFP/CFP スタックで乗算されます。
16. メイン メニューからプロセスを選択 >数学>分割し、値を 255 に設定します。新しいウィンドウが開いたら、はいスタック内のすべての画像を分析するを選択します。新しいイメージは、名前付きの結果の結果の C2-合計が表示されます。
17. メイン メニューから選択イメージ>調整>明るさ/コントラスト、自動選択。
18. メイン メニューからプロセスを選択 > 選択してコントラストを強調、飽和型 = 0.35。
19. メイン メニューから、画像を選択 >調整> GA 分布をキャプチャする明るさ/コントラスト、および最小値と最大値を設定します。オプションのステップ: メイン メニューから分析を選択 >ツール>校正バーとバーを LUT 校正、.tiff ファイルとして結果の結果の C2 の合計を保存。
20. 排出量の値を取得する比率は、メイン メニューから、分析を選択 >設定測定し平均グレー値を選択、標準偏差。
21. ツールバーから四角形を選択、利益 (率 ROI) の領域を描画します。メイン メニューから分析を選択 >メジャー。新しいウィンドウ選択した投資収益率からの平均値が報告されます。
22. コピーし表計算ソフト (Excel、OriginPro) に得られた値を貼り付けるし、実験前に、と後 GA₄治療のためヒストグラムまたは実験時間コースの線グラフを作る。

6. 画像解析 3次元可視化と解析ソフトウェアを使用して

注:選択したソフトウェアを使用する利点 (材料の表を参照)、セグメント オブジェクト (例えば、核)、共焦点の z スタックから 3次元画像を作成します。イメージの例として、図 2 b 2 D、 2 階 2 H、 3 bを参照してください。

1. ソフトウェアを開き、ファイル (.lif または .lsm ファイル) をインポートします。
2. サーフェス ウィザードを使用してコントロール YFP 放出チャネルに基づいて核をセグメント化します。セグメント化されたオブジェクトは、「表面」と呼ばれます。この分割ステップは、核外ボクセルから背景を除去しながら 1 つのオブジェクトとして核でのすべてのボクセル解析を許可します。
3. サーフェス ウィザードで 3 μ m と既定値にしきい値を背景差分 (ローカル コントラスト) を設定します。CFP 放出 (ドナー励起ドナー排出 [DxDm])、YFP 放出 (受容体受容体励起蛍光 [AxAm]) チャネルを使用して作成したサーフェスに基づいてフレット放出 (ドナー励起アクセプター発光 [DxAm]) チャンネルをマスクします。
4. XT 意味強度比拡張機能を使用すると、ドナー励起アクセプター発光ドナー励起ドナー蛍光 (DxAm/DxDm) 2 つのチャネルで個別のサーフェスの平均輝度値の間で割った値の比率を計算します。
   注:この拡張機能はオンライン ダウンロード中です。
5. NlsGPS1 排出量の比率と個々 のサーフェスの色、統計と色分け、カラー ホイールのアイコンとして表されますを選択します。統計の種類としては、強度比を意味するを選択します。
6. 統計情報] アイコンの下にある表から個々 の値の比をエクスポートします。
7. コピーし値をスプレッドシートに貼り付けるし、GA₄治療実験前に、と後のヒストグラムまたはコースの実験時間のグラフを作る。

7. 統計解析

注:NlsGPS1 排出量比の beeswarm、ボックス プロットの3 D を図を参照してください。

1. ソフトウェアを開き、Y 列として核表面の放射率を貼り付けます。
2. 目的の列を選択し、統計を選択 >統計データ>正常テストサンプルが正規分布するかどうかを知っています。正規性検定を実行し、新しいウィンドウが開き、結果を報告します。
3. サンプルが正規分布の場合は、 tを使用して-統計的なテストとしてテストします。統計を選択 >仮説検定>行の 2 標本 t 検定とtの実行-テストします。
4. サンプルが正規分布していない場合選択統計>統計仮説検定> サンプル間の差異が大きな違いではないかどうかを知る2 つの標本分散のテストをします。
5. 差異は、大きな違いはありません、検定としてマン-ホイットニーの U 検定テストを使用します。統計を選択 >ノンパラ メトリック テスト>マン-ホイットニーのテストし、テストを実行します。
6. 分散が大幅に異なる場合、検定としてクラスカル ・ ウォリス ANOVA テストを使用します。統計を選択 >ノンパラ メトリック テスト>クラスカル ・ ウォリス分散分析をテストし、テストを実行します。

結果

NlsGPS1 を使用すると、ルート ヒントや暗所で育てた胚軸 (図 2) などの蛍光イメージングに従う組織の細胞の GA₄レベルを測定することが可能です。シロイヌナズナの根の nlsGPS1 排出量比グラデーションは分裂および部門ゾーンで低 GA レベルと後半の伸びゾーン (図 2 aおよび2 b) GA 高値を表しています。対照的に、放出比グラデーション内生 GA グラデーションが (図 2および2 D) アーチファクトではないことを示唆している nlsGPS1 NR 根で観察されなかった。NlsGPS1 排出量比グラデーションも暗所で育てた胚軸、子葉と根尖部のフックで低レベルと高レベル (図 2 eおよび2 f) 胚の急激に伸長の基底部に形成されました。対照的に、放出比グラデーション (図 2と2 H) nlsGPS1 NR 胚軸で観察されなかった。シロイヌナズナ根と暗所で育てた胚細胞内生 GA の蓄積は細胞の伸長速度と相関。

さらに、外指定された GA₄蓄積優先的にシロイヌナズナ根 (図 3)、分裂帯と比較して伸長帯で内因性と外因性 GA を勉強するその nlsGPS1 を使用することができますを示すパターニング。

時間コース実験、nlsGPS1 の苗が粘着性があるスライド室に置かれ、¼ MS 液で灌流中に GA₄ 30 分間を 0.1 μ m 処理が続きます。ビデオは、分裂帯 (ビデオ 1) に比べて根伸長域の外因性 GA₄の高速蓄積を示しています。

図 1: 共焦点イメージングのための試料調製します。これらのパネル表示サンプル準備定常実験、(B) (A) 前に、と後外因性 GA₄治療、および治療時間コース実験 (C) を使用するための概略図粘着性があるスライド (C)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2:シロイヌナズナの根と胚軸の暗所で育てたジョージア州グラデーションします。ImageJ のソフトウェアを使用して nlsGPS1 (A) と (C) nlsGPS1 NR 根の二次元画像を分析し、nlsGPS1 (B) と (D) nlsGPS1 NR の三次元三次元商業を用いて分析を行いました画像解析ソフト。両方の分析は、シロイヌナズナの根の勾配の内因性の GA₄を示した。ImageJ のソフトウェアを使用して (E) nlsGPS1 (G) nlsGPS1 NR 暗所で育てた胚軸の 2次元画像を分析し、(F) nlsGPS1 (H) nlsGPS1 NR の三次元イメージを行った、市販の三次元画像解析ソフトウェア。両方の分析は、内因性の GA₄暗所で育てた胚軸勾配を示した。LUT バー nlsGPS1 排出量比の偽色が表示されます。YFP 画像は式コントロールとして報告されます。2 段階位置を使用して胚画像に買収されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3: 根の外因性 GA グラデーションします。最初 2 つのパネルを (A) 二次元と前に nlsGPS1 ルートと外因性 GA₄ (1 μ M) の治療後 20 分 (B) 三次元画像。YFP 画像は式コントロールとして報告されます。最後の 2 つのパネルの表示 (C)、平均と標準偏差と伸長帯 (白枠と定義されている地域) の核の nlsGPS1 排出量比率の (D) beeswarm、ボックス プロット。GA₄治療後 nlsGPS1 排出量比率は有意に高い伸長帯 (マン-ホイットニーの U 検定 * * * P-値 < 0.0001)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

ビデオ 1: 粘着性があるスライドを使用して、nlsGPS1 ルートの灌流実験。このビデオは、nlsGPS1 ¼ MS 液で灌流、30 分の 0.1 μ M GA₄で治療における三次元画像を示しています。イメージング時間コースで以下の間隔で 3 時間 10 分毎に買収された: モック ソリューションの 30 分 ( tをフレーム = 1、 t = 2 t = 3)、GA₄治療の 30 分 (フレームt = 4、 t = 5、 t = 6)、モックの 2 h ので箇所 (フレームのt = t 7 = 18) ソリューション。買収前にサンプルあったモック 2 h.このビデオを表示するのにはここをクリックしてくださいソリューションで灌流。(右クリックしてダウンロード)

ディスカッション

フレット ベースがバイオ センサー nlsGPS1 は、報告し、ジョージア州多細胞植物ホルモン勾配を測定する定量法を提供します。Fret バイオ センサーは質量と転写記者やシグナル伝達タンパク質分解法^{12、によって間接測定による直接検出を改良された時空間分解能でダイナミクスを定量化できます。 13}。多様な組織型で高解像度の細胞イメージングは、多細胞における GA 蓄積機能と規制に関する生物学とスパークの新しい仮説 GA に有意義な洞察力をもたらすことができます。たとえば、特定 GA 生合成、異化、およびトランスポートの変異だけでなく時空誘導摂動中に nlsGPS1 バイオ センサーの変化を監視できない可能性があります特に GA グラデーションの確立方法でテストするのには非常に有益ルート アドレスのルートは GA グラデーション レスポンスを細胞します。センサーは、種子の発芽、細胞伸長および開花の GA を介した制御機構の保全をテストする他のモデルと作物の種で使用できます。

NlsGPS1 バイオ センサーの fret イメージングで重要な手順は、1) ピクセル、定量的解析中に飽和してはいない、「検出器ゲイン」など 2) 撮像パラメーター必要がありますドナー排出 (DxDm) 一定とアクセプター発光 (DxAm) 買収、3) nlsGPS1 NR の制御線は工芸品と 4 を除外する使用する必要があります) のサンプルを用意する必要があるドリフトと焦点変動問題を最小限に。また、サンプルの育つ環境条件は GA レベル光期間および光強度^{14,15,16 などの環境条件に敏感であるために制御することが重要、17}。このタイプの分析の重要な制限は、高い信号対雑音比がレシオ イメージングに固有のノイズの増加に伴いイメージングに必要なことです。したがって、nlsGPS1 イメージングは組織とシアンと黄色蛍光タンパク質を用いたレシオ メトリック蛍光顕微鏡に従順ではない臓器に便利されません-たとえば、深部組織の蛍光タンパク質が検出された悪い。その一方で、レシオ メトリック読み出し頻繁より優先されます intensiometric 情報読み出し装置、内部統制は、バイオ式、安定性、明るさ、または特定のセル、組織における信号検出能の変化に起因する工芸品を排除する役に立つので、または条件。たとえば、バイオ イメージングをフレットし、画像解析は、様々 な組織^{5,6,18,19,20,}における配位子の様々 な研究に使用されています。イメージング実験と画像解析をここで報告は、光シート顕微鏡など深いルート組織型で新しい洞察力をもたらすことが可能など、新しい撮像方法に合うように変更できます。

第 1 世代の nlsGPS1 バイオ センサーは、外因性 GA 治療に続くジョージア州の細胞内の増加にも報告できる GA 勾配の高解像度のマップを提供高親和性センサーです。NlsGPS1 の現在の限定の 1 つは、センサー急速に戻すことはできませんし、したがって、定常状態のジョージア州レベルではなく、可能性があります興味のソリューションで最大最近 GA 濃度を報告です。センサーの正確な離職率はまた低可逆性と組み合わせていない知られていると、この起こっている可能性が内因性の GA 光線の検出を排除するいくつかの組織型で数時間に数分以内。その nlsGPS1 はジョージア州₄に高い親和性を注意してください重要です (K_d = 24 nM) ジョージア州の他の形態と比較して (GA₃ K_d= 240 nM、GA₁K_d = 110 nM) その他の活性ガス^{をイメージングするとき7}. 高い親和性を維持しながらの可逆性を増加するまたはさまざまな前駆物質、生理活性物質、またはガスの分解生成物の異なる特異性を展示する GA バイオ センサーの未来の世代を設計することができます。 

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
nlsGPS1 Col0 Arabidopsis seeds	NASC	N2107734
nlsGPS-NR Col0 Arabidopsis seeds	NASC	N2107735
Gibberellin A4 (GA4)	Sigma	G7276	dissolve in EtH 70% , and keep at -20 °C
sodium hypochlorite solution (Bleach)	Fisher S/5040	HSRA 064
Hydrogen cloride HCl	Sigma	31434
Micropore tape	3M	1530-1
ibidi sticky-slide	Ibidi	81128	Luer 0.1 for root imaging
ibidi sticky-slide	Ibidi	80168	Luer 0.2 for hypocotyl imaging
glass coverslip for sticky slides	Ibidi	10812
Elbow Luer Connectors	Ibidi	10802
silicone tubing	Ibidi	108401
Luer Lock Connector	Ibidi	10826
programmable syringe pump	World Precision Instruments	AL-1000
Vacuum grease	Sigma	18405
Murashige and Skoog Basal Salts	Duchefa	M0221
Agar plant, 1 kg	Melford	P1001
Microscope slide ground edges, 76 mm x 26 mm, 1.0 mm to 1.2 mm thick	Fisher Scientific	12383118
Cover slip No.1 1/2 glass 22 mm x 22 mm	Fisher Scientific	12363138
Luer-slip Syringe 20 mL	Fisher Scientific	10785126
3M Micropor Surgical Paper Tape	Fisher Scientific	12787597
Potassium Hydroxide, 500 g	Sigma Aldrich	221473-500G-D
Absolute Ethanol	Fisher Scientific	10428671
Forceps Watchmaker 5 StSteel	Scientific Laboratory Supplies	INS4340
Scissors, 125 mm, stainless steel	Fisher Scientific	12338099
Fitting reducer 0.5 to 1.6	Ibidi	10829
Leica SP8			Confocal laser microscope 1
Zeiss LSM 780			Confocal laser microscope 2
Imaris	Bitplane		3D visualization and Analysis software
Fiji			image analysis software
OriginPro	Origin Lab		Statistical Analysis Software