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要約

このプロトコル両方視覚脳幹脊髄標本を通信し、包括的なステップバイ ステップの方法で脳幹横スライスの準備を明確にします。それは、再現性を高め、脳幹の呼吸の地域から神経の出力を記録するための実行可能な長期的なリズミカル-アクティブのスライスを得ることの可能性を高めるために設計されました。

要約

哺乳類の呼吸のリズムは、髄質の複雑な preBötzinger を呼ばれる (pBC)、吸息筋のリズミカルな収縮を駆動信号を生成する領域の神経ネットワークから生成されます。リズミカルな神経活動は pBC で生成され、呼吸筋は、en のブロック神経録音横スライスの録音など、様々 なアプローチを使用して学ぶことができるドライブに他の神経細胞のプールに行った。ただし、以前に公開されたメソッドがない広範囲プロセスを説明脳幹 - 脊髄解離将来研究のための透明性と再現性のある方法で。ここでは、再現性をもって発生し、吸気ドライブを送信するための必要かつ十分な神経回路を含むリズミカル アクティブ脳幹スライスをカットするために使用法の包括的な概要を提案します。この作品は pBC、舌下神経 (XII pMN) 核ニューロンからニューロンの出力を記録するための現実的かつリズミカルにアクティブなスライスを確実に得られる可能性を高めるために前の脳幹 - 脊髄電気生理学のプロトコル上に構築し、舌下神経運動ニューロン (XII MN)。作品発表は、XII 根を含むスライスを全体のラットの子犬から、解剖の詳細なステップバイ ステップのイラストを提供することによって以前の公開メソッドを拡張します。

概要

脳幹の呼吸のニューラル ネットワークは、リズミカルなニューラル ネットワークの一般的な特徴を理解するための肥沃なドメインを提供します。特に、関心は新生児齧歯動物呼吸と呼吸のリズムを開発する方法を理解することの開発中です。これは生体全体の動物脈、体外で en のブロック神経録音を含むマルチレベルのアプローチを使用して行われ、体外、呼吸リズム ジェネレーターを含む録音をスライスします。体外 en のブロックおよびスライスの録音での還元は、呼吸器 rhythmogenesis および齧歯動物の開発の脳幹 - 脊髄領域における神経回路の背後にあるメカニズムを問い合わせるときに使用する有利な方法です。発展途上の呼吸器系には、約 40 のセルタイプ、中央呼吸1,2のそれらを含むパターンを発射することによって特徴づけられるが含まれています。中央呼吸ネットワークには腹吻側の延髄1,3にあるリズミカルに活発に神経細胞のグループが含まれます。哺乳類の呼吸 rhythmogenesis が生成されます、autorhythmic からの介在ネットワーク複雑な preBötzinger と呼ばれる (pBC) されているローカライズ実験を介して新生児の哺乳類のスライスと en の両方のブロックの準備脳幹・脊髄の3,4,5,6,7,8 をコードします。この地域は、心臓の洞房結節 (SA) と同様の機能を提供していて、ドライブ呼吸の吸気タイミング システムを生成します。PBC から吸気のリズムは (舌下神経の運動核を含む) 脳幹と脊髄のモーター プール (横隔膜の運動ニューロンでダイアフラムを駆動する) など9の他の地域に運ばれます。

律動は脳幹脊髄 en bloc 準備またはさまざまな C3 C5 神経根、XII 神経根を含む細胞集団からスライスを使用して得られる可能性があります (XII MN) 舌下神経運動核、舌下神経核ニューロン (XII pMN) と10,3,1211,pBC。データ コレクションのこれらのメソッドは、研究所の握りを成功されているが、多くのプロトコル フィールドに入る新たな研究者の完全に再現性のある方法で表示されません。現実的かつリズミカルにアクティブな en ブロックやスライスの準備を取得すると、郭清とスライス切断プロトコルのすべてのステップを通じて、細部への急性の注意が必要です。まだ以前のプロトコルは、広く様々 なレコーディング手順や電気生理学に記述可能なティッシュの準備を得ることの最も重要な部分の詳細を欠いている: 脳幹 - 脊髄の解剖とスライスの手順を実行します。

脳幹 - 脊髄電気生理学録音リズミカルにアクティブと実行可能なアンのブロックやスライスの準備を効率よく取得すべての手順が正しく、慎重に、かつ迅速に実行することが必要です (通常、全体の手順関連ここですることができます約 30 分で実行されます)。ない記載されている以前も脳幹 - 脊髄電気生理学プロトコルの重要なポイントは、神経根と、vibratome のスライスのプロシージャの郭清を含まれます。このプロトコルは段階的に最初は視覚的に新たな研究の分野での専門家脳幹 - 脊髄の解剖を伝えます。このプロトコルはまた徹底的に手術手技、ランドマーク、およびスライスとen のブロックの各実験に必要な正確な回路が含まれて準備を標準化することで未来の研究者を支援するために他の手順をについて説明します。ここで説明されている手順は、ラットおよびマウスの新生仔に使用できます。

プロトコル

次のプロトコルは、受け入れし、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ロマリンダ大学によって承認されています。動物の倫理的な処置のための NIH のガイドラインは、研究室で実行されるすべての動物実験に続いています。すべての倫理的な標準は、このプロトコルを実行する個人によって支持されました。

1. ソリューション

  1. 人工脳脊髄液 (アプライド) を準備します。
    1. 新鮮なアプライド 1 L 単位以下を使用して実験の前に夜の準備レシピ: 7.250 g 塩化ナトリウム (直線 124 mM)、0.224 g KCl (3 mM) 2.100 g NaHCO3 (25 mM)、0.069 g NaH2PO4 • H2O (0.5 mM)、0.247 g MgSO4 • 7 H2O (1.0 mM) と 5.410 g D-グルコース (30 mM) 0.221 g CaCl2 • 2 H2O (1.5 mM)。最後の CaCl2 • 2 H2O は常に追加します。
    2. コンポーネントを 1 L の脱イオン水に溶解します。20-30 分間かき混ぜます。
    3. アプライドの pH を測定し、調整 7.40 ± 0.02 に少量を使用して (通常 < 0.5 mL) 希釈 NaOH、KOH、または HCl の。
      注:準備アプライドは、細菌の増殖実験中にティッシュの実行可能性に影響を与える前に 3 日間 (4 ° C、pH 7.40 ± 0.02) 冷蔵庫に格納できます。実験することができます最後に 36 h までので真菌や細菌の実験室での汚染を減らすために 0.2 μ m フィルターを使用します。効率は、アプライド レシピが記載されている可能性があります同じプロトコルに従う 4 L バッチまで縮小され、このボリュームの実験は、3 日間続きます。

2. 解離と Vibratome リグの準備

  1. ブレードを設定します。
    1. 切削、vibratome 組織に新鮮な両刃かみそりの刃を使用します。100% エタノールでブレードを洗浄し、vibratome クランプ切削または半分にブレードを合わせると取り付けに刃を挿入する前に脱イオン水ですすいでください。
    2. たびに新しいティッシュの準備は、スライスの vibratome にマウントされている、またはスライスしながらパラフィン スラブに切って刃を変更します。パラフィン残留物を新生児の神経組織をきれいにカットするはほぼ不可能になります。
  2. パラフィン ワックスのスラブを設定します。
    1. 任意のスタイルを埋め込むパラフィン ワックスを使用します。耐熱ガラス製ビーカーでメディアを埋め込みの 10 g を置き、液体パラフィン ワックス ビーズを溶かす低熱を使用します。
    2. 黒鉛粉末の約 0.5 g、流動パラフィンにソリューションを徹底的にし、均一に混ぜます。
    3. パラフィンの基板として小さなプラスチック板を使用します。プラスチック製の小型 (0.5 ~ 1 cm の厚さと約 2 × 2 cm2ワイド) 部分をカット (ポリカーボネートやアルミには使用することができますも)。これはパラフィンがプラスチックに準拠することにより、プラスチックにスクラッチ溝に機械工のファイルを使用します。
      注:また、パラフィン グラファイト混合物がプラスチックに準拠していることを確認するのにシートに斜めの穴を配置するのに温水 18 G の注射針を使用します。
    4. 繰り返し溶融パラフィン グラファイト混合物にアプリケータを浸漬プラスチック ブロックにスラリーを滴下、建物にパラフィン グラファイト プラスチック上にパラフィン グラファイト混合物を滴下するのに綿の先端アプリケータの裏面を使用します。プラスチックの上に厚さ約 1.5 cm。
    5. ブロック時にパラフィン グラファイト ミックスの十分に厚い層を堆積し、一度冷却し、脳幹脊髄に合わせて形状、脇のブロックを設定します。

3. 解剖と分離、Neuraxis の

  1. 初期の郭清を行い、anesthetization。
    注:    本研究で使用される動物の胚日 18 (E18) から、マウスやラットに至る E18 生後生後 10-20 サイズの範囲が 5/6。実験的なデザインによって、ラットやマウスのひずみや治療、性別を使用する可能性があります。イソフルラン (25 mL チャンバーで 0.25 mL) をされるので麻酔とヒューム フードの下で予備的な郭清を実行します。
    1. 子犬の重量を量るし、2 インチ2ピース ガーゼ × 2 に配置されますイソフルランの 0.25 mL を含む麻酔室に配置。動物 (ない逃避反射とつま先ピンチによって確認される) 麻酔の手術面に達すると後、ピン シャーレに動物はパラフィンまたはシリコーンのエラストマーを充填しました。
      注:Cryoanesthesia13,14, イソフルレン気化15を介して、新生児の齧歯動物を麻酔も可能性がありますまたは注入16バランス酸素。
    2. 動物の腹側を置くし、メスの刃、10 または 11 の数や手術ハサミで、正中切開から目の後ろにちょうど半ば腰椎領域に脊柱の。皮膚を反映し、頭頂・後頭縫合のレベルで動物を decerebrate (図 1を参照) および横隔膜の下の動物を transecting 皮膚を削除します。メスやはさみ、肩関節でカットして腕を削除します。
    3. 皮膚を削除すると、シリコーン elastomerin さらに郭清と脳幹 - 脊髄の準備の下で灌流チェンバに動物を転送します。
    4. 冷蔵 (4 ° c、pH 7.40 ± 0.02) アプライド貯水池 (側ポート ボトル 500 mL) を継続的にバブル アプライド 95% O2と 5% CO2 (「カーボゲン ・"とも呼ばれます) の混合物に酸素を送り込むと。解剖時に商工会議所、脳幹脊髄分離を通して新鮮な酸素アプライドの提供を定期的にフラッシュするのにチルド アプライドを使用します。
      注:残りの動脈および静脈の赤い血液細胞を見ることができるし、十分に酸素、これらが真っ赤。
    5. 継続的に酸素アプライド (ボーラス ボリュームまたは経由でゆっくりドリップ バルブ、約 0.5 - 1.0 mL/min を使用する) と組織を灌流または断続的にチューブを介して重力流灌流し、活栓を使用します。これは組織を含酸素化合物し、明確な外科的フィールドを維持します。
    6. 真空吸引ろ過システムによって必要に応じて、余分な水分を削除します。
    7. 解剖顕微鏡を用いた解離を実行します。細かな倍率の調整と郭清の各ステップにおける関心領域の最適な可視化を許可する連続ズーム モデルが好ましい。
      注:マイクロサージャリー ツールをお勧め歯組織鉗子、鈍い鉗子、鉗子 #5、斜め組織鉗子の範囲を含んでいるマイクロ解剖はさみ (春はさみ) ・定期的の昆虫微小解剖ピンの範囲。
    8. 矢状縫合線に沿って頭蓋骨の中間線セクションを介して脳を公開し、反射フラップ ダウン ミクロ解剖ピンとピン 27 G を使用して解剖室のシリコーンで覆われた下に尾の端に脊柱を固定針。
      注:解剖の残りの部分では、解剖顕微鏡組織とランドマーク脳幹の頭蓋の根と脊髄根のリズミカルな架空出力の最大尤度を確保するための明確なビューを提供する必要があります。解剖中春はさみまたはアイリスはさみや微細鉗子を使用してこれらの手順を実行します。
  2. 速やかに動物の分離のトランクを曝気解剖室に転送します。商工会議所の正面を向いて吻側端 (脳) を組織の背側を配置します。肩と脊髄の最も尾側にティッシュを固定します。
    1. 次の皮質と脳幹の頭蓋骨を基になる損傷を避けるため頭頂縫合頭蓋骨を介して正中切開を行います。
      注:新生児の骨は完全に石灰化ではない、非常に脆いです。/骨ですが、ある程度柔軟な周囲の結合と筋組織よりも厳しいです。
    2. 矢状縫合で開始して横にスカルの後頭部の縫合を切り取る中春やアイリスのはさみを使用します。これが反映され頭蓋骨の吻側部を固定し、組織にいくつかの安定性を提供する固定スカルの「フラップ」が作成されます (図 2を参照)。
    3. 大脳皮質の残りの部分をカット、頭蓋フラップを反映した後 (図 2B) 小脳 (虫) は比較的そのままの尾の部分を残しています。
  3. 背側椎弓切除術を行います。
    1. 周囲の頭蓋骨と脊柱マイクロばねはさみとピンセットを使用して筋肉を削除します。腹側椎弓切除、脊髄への損傷のチャンスを最小化中に、組織を固定する後この固定されます、胸郭をそのまま残して、肋骨の背側に沿って組織を削除します。
    2. 中春はさみまたは精細なアイリスはさみを使用して椎体のラミナの横方向のプロセス スニップ離れて慎重に。橋と延髄を覆う任意組織を切り取る。小脳虫部、小脳、橋、および脊髄の初めは、はっきりと見える (図 2C) をなります。
  4. 腹側椎弓切除術を行います。
    1. 組織の背側を断るし、胸郭と脊椎の最も尾側にピンします。組織の吻側の側頭骨フラップ (図 3A) を釘付けに。
    2. 肋骨、胸骨と同じハサミ、鉗子を使用してすべての腹部臓器などの腹側の半分を削除します。肋骨や脊髄 (図 3B) 公開する胸部に接続されている距離の軟部組織を解剖します。
    3. 舌、食道、気管、喉頭、その他軟部組織と頭蓋骨と脊柱のベースを覆う (図 3Cに見られる) との筋肉を削除します。
    4. ハードのパレットを覆う組織を解剖します。(図 3C) に V 字のインデントと頭蓋骨の骨の長方形板を配置することによって、硬口蓋を識別します。口蓋正中線に沿ってカット、慎重に上方に持ち上げて、取り外します (図 4A) カット横行を実行します。
    5. 図 4Bに示すように約胸椎 7 (T7) に最初の頚椎から脳幹や脊髄の腹側表面を公開するラミナを外して腹側椎弓切除術を開始します。
    6. この段階で腹根が表示されます。限り脊髄で、根の起源からカットをラミナに近いと確認するように注意小さなミクロ解剖や春のはさみを使用して、根の伸張を避けます。
    7. ラミナに脊柱の両側に沿って 5-10 の mm の領域切り取り。脊髄や脊椎には余りに近くにカットできません。この手順は、頚椎脊髄を公開するの削除をできます。終期を切断しないでください。
    8. 脊柱 (約 T7) に沿って (両側) 根約 20-25 mm を切り取る。この手順を通して脊髄に切断を避けるため、図 4Cに見られるように椎体の端を操作します。
    9. 慎重にそれぞれの脊椎の吻側端を持ち上げて骨の下に密接に snipping によって C1、C2、および C3 を削除します。カットはされて、もはや、細根骨に近い。フックまたは屈曲鉗子カット (図 4C) しながら各頸椎のしっかりしたグリップを実現を支援するために使用します。
    10. 脊髄の希望の長さが分離し、脊柱から解剖、脊髄 (図 5Aと図 5B) を削除する横のカットにします。
  5. 硬膜を削除します。
    注:    前述3,7をされており、en のブロック in vitro における記録のため摘出脳幹脊髄を使用ことができます。脳幹 - 脊髄脊柱から削除と硬膜は頭蓋および背骨カットから録音を実行する吸引電極の最適なアクセス rootles を提供するために取除かれなければなりません。また、硬膜の除去の場合、きれいに脳幹をスライスし、in vitro における記録のリズミカルにアクティブな薄いスライスを取得することが可能になります。
    1. 慎重に、分離脳幹 - 脊髄組織の背側を硬膜、頭蓋周囲へのアクセスを許可するようにピンは rootles (図 5B)。ピンは、XII 細根を脳幹の外側縁を適用しなければなりません。
    2. 脳幹の背側表面の硬膜を硬膜背側縁部に微細鉗子 (#5)、硬膜を持ち上げることによって削除して春の晴れたハサミで脳幹の長さにわたって外側、内側からカットします。脳幹自体に切断を避けるために注意してください。注意深く脳幹表面から血管を持ち上げ、ときに脳幹の断面 vibratome ブレードの障害を避けるためにカットします。
    3. 脳神経根が硬膜を通過し、硬膜を持ち上げると簡単に離れて裂かれるよう慎重に脳幹の内側と外側の側面から硬膜を解剖します。優しく回り小さいばねはさみで切断することによってオフにプルされている根の可能性を最小限に抑えます。
    4. 腹面が上を向くし、頭蓋の細根がはっきり見えるように脳幹脊髄を反転します。優しく野、吻側から尾側に切断の上に直接硬膜を持ち上げることによって、脳幹の背側から硬膜を解剖します。エリア後野灌この地域 microcapillaries の数が多いため若干ピンクが表示されます。
    5. 細い昆虫ピンを使用して、任意の残りの硬膜をいじめる、頭蓋と頚根近くに残りの血管を削除します。

4. スライス プロトコル

  1. 硬膜を除去した後に、プラスチックのブロック (以下「切断ブロック」という) のパラフィン プラットフォームの中心に脳幹を配置します。図 5Cに示すように 1 cm 以上の長さにトリミングされて罰金の昆虫ピンを用いた遠位脊髄を介して脳幹の尾側を固定します。
  2. ブレードは、脳幹部の吻側の顔に垂直をカット、vibratome ブロック ホルダーに固定された脳幹とパラフィン カバー切断ブロックの位置を合わせます。
  3. 最も吻側端に凹凸、余分な組織を除去する最初のスライスを確認します。この最初のカットは、200-300 μ m 通常しかし慎重に避ける IX、X、および XII の頭蓋の根の除去をすることができます。この手順は、通常の顔面神経核 (VII) と舌咽根尾程度を明らかにする、その顔がパー平面 vibratome ブレードに脳幹を配置することが可能になります。パー平坦性を確保しもではない組織を削除する小さなカットする必要に応じて微調整を行います。
    注:舌咽 (IX) の根は、各連続のスライスをカット 1 つとこれらは吻尾リズム生成に必要な脳幹神経回路までのランドマークを提供する脳幹の外側の端に表示されます。脳幹の腹側では、舌下神経根 (XII) も表示するか示す IX 根切断面に少し尾。最終的なランドマークは、脳幹の背側の顔に obex (脊髄の中心管になることを第 4 脳室が狭くなる人間の脳でポイント) になります。参照のこれらの 3 つのポイント表示、正しい切断面が設立 (参照してください図 6A) とリズミカルにアクティブなスライスを確実に取得されます。
  4. IX 細根が脳幹部の切断面の表面の近くまで吻側尾側切断を続行します。
  5. ランドマークと正しい方向は、図 6を参照してください。断裂のアングル、カット スライスに非常にわずかな「くさび」図形を作成し、ランドマークに記載ができるまでに約 100-200 μ m のスライスをカット、vibratome クランプでパラフィン スラブを調整する (図 6A) がはっきりと見る。
    注:このわずかなウェッジをカット スライスでキャプチャされた XII 運動ニューロンの数が増加、記録中に律動を得られる可能性を最大化します。(舌咽神経束、舌下神経束、閂から根から吻側根) を説明したランドマークを使用してスライスが再現性をもって pBC (図 6B) の大部分が含まれていることを確認します。
  6. PBC をキャプチャするこれらの吻側の神経解剖学的マーカーから脳幹の 300-500 μ m のスライスをカットし、伝送回路を関連付けられています。
    注:「理想的な」スライス内リズム生成/転送座以上吸引電極を使用して表面のレコーディングに頼ることがなく吸気活動を確実に取得する舌下神経の細根バンドルの最も吻側の細根が含まれます、脳幹。

5. 記録手順

  1. 記録室にスライスを配置、アプライド (0.5 - 1.0 mL/min) を継続的に灌流および XII 根や pBC や XII Pmn XII 運動ニューロンから記録人口活動する吸引または細胞外の電極を使用します。詳細な記録手順は、脳幹脊髄電気生理学の前の出版物を参照してくださいし、クランプ10,11をパッチします。

結果

ここで紹介した方法では、再現性をもって、確実に多くの時間のため架空のモーター出力の記録は、実行可能な堅牢なスライスを削減する脳幹のリズミカルにアクティブのスライスを得ることに興味がある研究者をことができます。生成し、吸気リズムを送信するための最低限必要な神経回路要素のすべては、このメソッドを使用して薄いスライスでキャプチャでき?...

ディスカッション

En bloc にここに示すプロトコルの適応またはスライス ワークフローが研究所に有利、どちらか en のブロック脳幹 - 脊髄を利用および/または薄いしたい研究スライス電気生理学の録音のための準備。郭清とスライス方法提示、17,18,19以前他の報告方法を組み合わせる、堅牢かつ実行可能な組織とは、範囲に広く適応可能の?...

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

S.B.P は、Loma リンダ大学夏学部研究員の受信者であります。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
NaClFisher ScientificS271-500
KClSigma AldrichP5405-1KG
NaHCO3Fisher ScientificBP328-1
NaH2PO4 •H2OSigma AldrchS9638-25G
CaCl2•2H2OSigma AldrichC7902-500G
MgSO4•7H2OSigma AldrichM7774-500G
D-GlucoseSigma AldrichG8270-1KG
Cold-Light source Halogen lamp 150 WAmScopeH2L50-AY
Dissection MicroscopeLeicaM-60
Vibratome 1000 PlusVibratomeW3 69-0353
Magnetic BaseKaneticMB-B-DG6C
Isoflurane, USPPatterson VeterinaryNDC 14043-704-06
Sword Classic Double Edge BladesWilkinson97573
HistoclearSigma-AldrichH2779
Dumont #5 Fine ForcepsFine Science Tools11254-20
Dumont #5/45 ForcepFine Science Tools11251-35
Scalpel Blades #10Fine Science Tools10010-00
Scalpel Handel #3Fine Science Tools10003-12
Spring Scissors Straight Fine Science Tools15024-10
Narrow Pattern Forcep Serrated/straightFine Science Tools11002-12
Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissors; StraightRobozRS-5650
Vannas Scissors 3" CurvedRobozRS-5621
Insect pins, 0Fine Science Tools/884060426000-35 
Insect pins, 0, SSFine Science Tools26001-35
Insect pins, 00Fine Science Tools26000-30
Insect pins, 00, SSFine Science Tools26001-30
Insect pins, 000Fine Science Tools26000-25
Insect pins, 000, SSFine Science Tools26001-25
Minutien pins, 0.10 mmFine Science Tools26002-10
Minutien pins, 0.15 mmFine Science Tools26002-15
Minutien pins, 0.2 mmFine Science Tools26002-20
Fisher Tissue prep Parafin fisherT56-5
Graphite fisher G67-500
Delrin Plastic Grainger3HMT2
18 Gauge Hypodermic NeedleBD305195

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