ヒト大動脈血管周囲脂肪前駆細胞の分化能力

要約

このプロトコルの目的は、複数の細胞系統に分化する人間の血管周囲脂肪組織由来幹細胞の能力をテストすることです。分化は、脂肪細胞、骨細胞、軟骨に区別するために知られている人間の骨髄由来間葉系幹細胞と比較しました。

要約

脂肪組織が豊富な万能幹細胞 (MSC) に分化骨、脂肪細胞、軟骨細胞の血統。前駆細胞の脂肪細胞分化は、肥満に対する脂肪組織拡大と機能不全を運転する主要なメカニズムです。血管周囲脂肪組織 (PVAT) に変化を理解、代謝性疾患の臨床的に関連性の高いです。しかし、以前の研究は主にマウスや他の動物の実行をされているモデル。このプロトコルは、冠動脈バイパス手術を受けている患者から収集した人間の呼吸器 PVAT サンプルを使用します。上行大動脈からの脂肪組織は収集され、間質血管の端数の植用します。我々 は以前脂質含有に分化する能力を持つ人間 PVAT 脂肪前駆細胞の存在を確認した脂肪細胞。本研究では、おそらく万能幹細胞を含む間質血管分数からの細胞の微分の潜在性我々 さらに分析。ひと骨髄 MSC の脂肪、骨、軟骨細胞系統に分化する PVAT 由来細胞を比較しました。次の分化の 14 日は、特定の汚れ (オイル赤い O) 脂肪細胞における脂質の蓄積を検出を利用した骨形成系細胞 (アリザリン赤) やグリコサミノグリカンとコラーゲン軟骨幹細胞 (マッソンの Trichrome) の石灰鉱床。骨髄 MSC は効率的にすべての 3 つの系統に分化、PVAT 由来細胞が脂肪細胞と軟骨細胞の潜在的なしかし、骨の強い潜在性を欠けていた。

概要

脂肪組織が豊富な万能幹細胞 (MSC) に分化骨、脂肪細胞と軟骨細胞系統¹。この組織は、成熟脂肪細胞の肥大と脂肪細胞に常駐の MSC の de novo 分化を通じて展開します。血管周囲脂肪組織 (PVAT) は血管を囲むし、血管機能^2,3を調節します。PVAT 肥満膨張は、心血管系の病態を悪化させます。人間の皮下脂肪のデポから MSC の多能性の可能性はよく勉強^4,5をされている、どんな研究が仔あり、ために可能性が高い人間 PVAT 由来神経前駆細胞の分化能力を評価調達の侵襲。したがって、この作業の目的は、外植体し、心血管疾患を持つ患者から人間の大動脈 PVAT から前駆細胞を伝播し、彼らに骨を区別する傾向、軟骨細胞、脂肪細胞系統をテストする方法を提供します。PVAT のわれわれの情報源は、肥満患者の冠動脈バイパス術後大動脈のバイパスの吻合部からです。離 PVAT は酵素によって解離と間質の血管の一部が分離され、in vitro で初めて人間 PVAT 由来神経前駆細胞の分化能力をテストする私たちを有効に伝達されます。

プライマリの培養ひと PVAT 間質血管分数を使用すると、脂肪細胞、骨、または軟骨系統の方向へ分化する幹細胞/前駆細胞を誘導するために設計された 3 つのアッセイをテストしました。私たちの以前の研究は、その率はテストしていませんが CD73 +、CD105 +、および脂肪細胞⁶に区別できる頑健 PDGFRa + (CD140a) 細胞の人口を識別されます。PVAT は直接血管の緊張や炎症の⁷を調整します。この細胞集団の微分の潜在性をテストするための理論的根拠は、専門 PVAT 血管機能に及ぼすと PVAT 拡張肥満のメカニズムを理解し始めるためです。この方法は脂肪組織の派生前駆細胞の機能の私達の理解を高めるおよび識別し、類似点と異なる組織由来の前駆細胞の違いを比較することが出来ます。我々 は確立され、検証されたアプローチを分離し、異なる系統へ MSC の差別化のために構築し、人間 PVAT 由来神経前駆細胞の生存率を最大化するための手順を最適化します。これらのテクニックは、幹・前駆細胞の研究と脂肪組織開発の分野で広範なアプリケーションを持っています。

プロトコル

本研究では人間のティッシュの使用は評価し、制度レビュー ボードのメイン州医療センターで、承認、全員が実験の前に適切な訓練を受けた。

1. 準備

1. 解離のバッファーを作る 50 mg を再構成することによって無料の動物コラゲナーゼ/当期ブレンド私溶液 nanopure H₂o ・準備 1 mg/mL 作業溶液 1 mL と高グルコース再構成コラゲナーゼに w/v 1 %bsa を含む DMEM の 49 mL を追加することによって/当期のソリューションです。-20 ° C から暖かいお風呂前の水を使用して、使用する 37 ° C で 5 mL 作業因数を格納します。
2. HBSS、49 ml (最終濃度は 200 単位/ml ペニシリン、200 単位/ml ストレプトマイシンと 0.5 μ G/ml fungizone) 100 x 抗生物質/抗真菌溶液 1 mL を追加して抗生物質溶液を行い、氷の上を格納します。
3. 牛皮 nanopure H₂o ・ オートクレーブ 20 分のためのソリューション 100 ml から 200 mg ゼラチンを溶解することによりゼラチン溶液 (0.2 %w/v) を準備し、4 ° C で保存
4. PVAT 成長媒体の 500 mL を準備: グルタミン、ピルビン酸ナトリウム 10 %fbs と 100 μ g/mL 抗菌剤 (材料の表を参照) を添加した重炭酸ナトリウムと高グルコース DMEM/f12 キー。
5. 50 mL の脂肪分化誘導メディアの準備: 40.8 mL 高グルコース DMEM、7.5 mL PVAT 成長媒体、抗生物質/抗真菌ソリューション (最終濃度が 100 単位/ml ペニシリン、100 単位/ml ストレプトマイシン 0.25 μ G/ml fungizone) x 100 の 500 μ L を添加しました。0.5 mM IBMX (0.1 M NaOH で 500 mM の在庫)、1 μ M デキサメタゾン (エタノールでストック 1 mM)、5 μ M ロシグリタゾン (DMSO で 5 mM 在庫)、33 μ M ビオチン (DMSO の株式 66 mM)、100 nM インスリン (0.1% の酢酸で 200 μ M ストック)、20 μ M パントテン酸 (100 mM 入荷 H₂O)。
6. 脂肪細胞系統の誘導メディア コントロールの 50 mL を準備: 40.8 mL 高グルコース 7.5 mL PVAT 成長媒体とペン-連鎖球菌 (100 x の在庫) を 500 μ l 添加 DMEM。
7. 50 mL 脂肪維持媒体の準備: 41.5 mL 高グルコース DMEM 添加成長メディア手順 1.3、500 μ L ペン連鎖球菌から PVAT 7.5 mL (100 x の在庫)、デキサメタゾン 1 μ M (1 mM 入荷 EtOH)、33 μ M ビオチン (DMSO で 66 mM 在庫)、100 nM インスリン (200 μ M 株式 0.1 %acエティック酸) と 20 μ M パントテン酸 (100 mM 入荷 H₂O)。
8. 骨と軟骨の系統の成長媒体の 500 mL を準備: 10% を添加した高グルコース アルファ MEM FBS、1 x グルタミンのサプリメント (材料の表を参照) とペン-連鎖球菌 (100 x の在庫) の 5 mL。
9. 骨系統の誘導メディアの 50 mL を準備: 10 nM デキサメタゾン 10 mM β-グリセロリン酸と補われる骨髄 MSC 成長媒体の 50 mL。
10. 軟骨細胞系統の誘導メディアの 50 mL を準備: 骨髄 MSC 成長培地 100 nM デキサメタゾン、50 μ g/mL ナトリウム アスコルビン酸-2-リン酸、および 10 ng/mL TGFβ1 50 mL。骨と軟骨の条件の基底の骨髄 MSC 成長媒体は非誘導メディアとして機能します。

2. プロトコル 1: 文化人間 PVAT 細胞間質血管の一部から

注:冠動脈バイパス移植手術を受ける麻酔下の患者の上行大動脈に人工血管吻合部から PVAT が切除されます。大動脈 PVAT は、15 mL 円錐含む 10 mL の氷冷高グルコース DMEM F12 でされ、切除の 2 時間以内に検査室に手術室から転送です。大動脈 PVAT はバイパス プロシージャの間に破棄された組織をメイン メディカル センターの内部審査委員会ヒト以外の科目研究としてと判断されています。

1. このプロトコルは、人間 PVAT (約 0.5 cm³x 1 x 3) の ~ 500 mg 作品です。25 mL 抗生物質溶液 50 mL の円錐管に DMEM から新鮮な人間 PVAT を転送します。ロッキング 4 ° C で 20 分間インキュベートします。PVAT 抗生物質溶液の中、雪解け 37 ° C で解離バッファーの因数
2. 5 mL 解離バッファーに 100 x 抗生物質/抗真菌溶液 50 μ L を追加し、0.22 μ m シリンジ フィルターを使用して滅菌します。24 ウェル プレートの 1 にゼラチン溶液の 1 mL を追加します。層流フードは、滅菌ピンセットとはさみを使用して滅菌シャーレに抗生物質溶液から PVAT を転送します。組織に予め温めておいた解離バッファーの 1 つの mL を追加し、スラリー (作品は 〜 2 × 2 mm²を超える) に全体の組織を細かくミンチ滅菌鉗子と解剖はさみを使用しています。
3. 4 mL 解離バッファーに 1 mL スラリーを転送し、1 時間 200 rpm でシェーカーを軌道に予め温めておいた 37 ° C でその側にチューブを孵化させなさい。後 1 時間目に見える組織の部分は存在できず、ソリューションは、曇り細胞懸濁液として表示されます。
4. 50 mL コニカル チューブ上に設定 70 μ m 携帯こし器を通ってソリューションをフィルターします。可能な限り多くの細胞をキャプチャする追加 10 mL 抗生物質溶液でストレーナーをすすいでください。ストレーナーを押さないようにしてください。
5. スイング バケツ遠心分離機で 300 x gで 12 分間細胞をペレットします。
   注:遠心分離の後チューブは、脂肪細胞、中間期、ペレットの脂肪の最上位のレイヤーに分離されます。ペレットは、血管内皮細胞、免疫細胞、血液細胞、前駆細胞が含まれている間質血管の一部です。
6. HBSS と 300 × gで 5 分間遠心分離機の 10 mL にペレットを再懸濁します。HBSS の 2 洗浄の合計のためには、この手順を繰り返します。最終的な洗浄の後、赤血球を溶解しません。いくつかの商業的に使用可能なバッファーとインキュベーション時間繰り返された試みは、前駆細胞の付着および生存率で大幅な節約につながっています。
7. 24 ウェル プレートからゼラチンを吸い出しなさい。非連結のゼラチンを削除する HBSS でよく 1 x は水洗い。
8. 成長媒体のゼラチン コーティング上にシード 1 mL でそのまま赤血球と間質ペレットを再懸濁しますも。25 ng/mL の培地での最終的な集中にヒト FGF2 (0.01% BSA w/v を添加した PBS で再停止される) を追加します。5% CO₂と 37 ° C で 24 時間インキュベートします。
9. 次の日に削除成長の媒体および洗浄井戸 HBSS 赤い血液細胞と死んだ細胞を削除すると 5 倍の。25 ng/mL FGF2 と補われる新鮮な成長媒体の 1 mL を追加します。
10. メディア 25 ng/mL で補うようにしてすべての 48 時間を変更して新鮮な FGF2 たびに。
11. 電池が通常達する 100% 合流植; 後 7-10 日一節細胞、:
    1. 成長のメディアと洗浄の単層 2 を吸引中、1 mL HBSS x。井戸からすべて HBSS を吸引し、細胞解離液を数滴を追加します。
    2. タップ プレートを数回旋回、5% CO₂セルを解除する 5-7 分の 37 ° C で孵化させなさい。戸セルに新鮮な培地の 〜 1 mL を追加し、24 ウェル プレート、各含んでいる 500 μ L の成長媒体、25 の 2 の井戸を 500 μ L を配布 ng FGF2。
12. 前の手順で示されているように、ひと PVAT 由来細胞を拡大していきます。各通路を 1:2 分割以上にする必要があります。細胞は、分化アッセイを割り当てる前に 5 ~ 7 回継代が。

3. プロトコル 2: 培養ひと骨髄 MSC コロニー

注:MSC の説明⁸として隔離され、として早期成立で株を凍結保存ひと骨髄液 N₂中 〜 100,000 セル/mL でメディア (70% FBS 20% 基底 DMEM と 10 %dmso) で固定します。

1. 急速に MSC 成長媒体の 3 mL を含む 6 ウェル培養プレートの 1 つの井戸を 37 ° C の水浴とプレートでリキッド N₂から骨髄 MSC のバイアルを解凍し、37 ° C および 5% CO₂で一晩インキュベートします。
2. 次の日、MSC 培地を吸引し、洗浄セル 3 HBSS の 2 mL で x。100% 合流、成長媒体を吸引し、洗浄セル 3 HBSS の 2 mL で x。500 μ L/ウェルの細胞剥離液を追加し、37 ° C、5% CO₂分のすべてのセルを確認するプレートが外れている場合はタップで孵化させなさい 2 mL MSC 成長媒体を含む 6 ウェル プレートの 2 の井戸に内容を均等に分散します。
3. ひと骨髄と並行して約 5-7 通路またはテストするための十分な量を達成するまで PVAT 由来 MSC を展開します。

4. プロトコル 3: プレートし、脂肪細胞、骨、および軟骨細胞系統を誘発します。

1. 骨髄とよく 12 ウェル プレートと適切なあたり PVAT 由来細胞の適切なナンバーは、実験条件ごとにレプリケートします。脂肪細胞や骨の条件、~ 200、000-225,000 細胞/ウェルは、条件に必要な軟骨、150,000-175,000 細胞/ウェルが必要があります。
   注:N の最小値を実行制御用 3 複製井戸を = し、実行する独立した 2 の合計各実験の系列のための条件を誘発 (N = 6 レプリケート合計)。
2. 人間 PVAT 前駆細胞集団個別 15 mL コニカル バイアルに 5 分プール人口の 37 ° C、5% CO₂で細胞剥離液と培養を用いたひと骨髄 MSC 人口から細胞の関連付けを解除します。ダウン 500 x g細胞のペレットを 7 分間でバイアルを回転します。1 mL の PBS に再懸濁します、診断を使用して、セル数を推定します。
3. 4.1 の手順で示されているように、12 ウェルの料理の細胞をプレートします。誘導と非誘導脂肪細胞、骨、および条件の別々 の皿を提供誘導条件の文化の継続を中断することがなく以前の時点で非誘発条件を修正できます。
4. 誘発条件の各ウェルに脂肪細胞と骨誘導メディアの 1.5 mL を追加します。非誘導条件の各ウェルに脂肪細胞や骨の非誘導メディアの 1.5 mL を追加します。脂肪細胞と 37 ° C、5% CO₂で骨の誘導と非誘導の細胞集団による培養を開始します。
5. スピン ・人間 PVAT 前駆細胞とひと骨髄 MSCs 500 x gで 7 分のための残りのボリューム ダウン。
6. 残りの骨髄と 100,000 セル/10 μ L (10⁶セル/mL) の密度を達成するために PVAT 由来細胞ペレットを再懸濁しますに必要なボリュームを決定します。軟骨細胞系統の誘導の MSC 成長媒体の計算された容積でペレットを再懸濁します。優しく上下に均一な分布を確保するため、ピペットを使用してセルのボリュームに移動します。
7. 濃縮細胞液の 10 μ L の液滴のピペット、100,000 細胞存在しておりを形成する各井戸の中心に。蒸発を防ぐために隣接する井戸で 1 mL 滅菌 H₂O を配置します。ように存在しており、CO₂を 5% と 37 ° C で 2 時間存在しており文化をインキュベート集計します。
8. 2 時間後、慎重に追加軟骨分化メディア 10 ng/mL でスパイク誘発条件井戸の各に人間 TGFβ1。慎重に非誘発条件下の井戸に 1.5 mL の非誘導培 (骨髄 MSC 成長媒体) を追加します。誘導と非誘導条件の別 12 ウェル プレートを使用する非誘発条件は以前の時点で固定することができます。

5. プロトコル 4: 文化脂肪、骨、軟骨細胞系統を 14 日間

1. 37 ° C、5% CO₂、さわやかなメディアごとに 2 日間で 4 日間のすべての 3 つの系統の誘導と非誘導条件の文化.4 日目、アッセイの残りの保守メディアに誘導メディアから誘導脂肪細胞系統条件を変更します。
2. 12 h. ホルマリン処分の 10% ホルマリンでのすべての非誘導条件を修正し、洗浄は、すべて固定井戸ホルマリンのすべてのトレースを削除する PBS で 2 倍。PBS で処理までの 4 ° C でプレートを格納します。
3. 更新メディアごとに 2 日間、14 日間の合計のための誘導条件の文化.10 ng/mL の最終的な集中更新するたびに軟骨細胞誘導メディアで新鮮な TGFβ1 を追加します。培養脂肪細胞系統で脂肪細胞維持媒体と骨系統誘導メディア、2 日おきの更新を続けます。14 日で 10% ホルマリンの汚損のための 12 時間すべて誘導条件を修正します。
4. こすりまたは誘導軟骨状態で存在しており、注ぎ埋め込みカセット。ステータス退避をますます集中しているアルコール 70%、80%、95%、2 回と 2 回絶対アルコールで始まる 5 分風呂シリーズで存在しており。脱アルコール剤にカセットを配置し、最後にパラフィン切片の染色にカセットを埋め込みます。

6. プロトコル 5: 染色油と脂肪分化状態赤 O

1. オイル赤 O 原液を準備するには、100% イソプロパノール 100 ml オイル赤 O の 350 mg を溶解します。0.2 μ m フィルターを介して攪拌棒と真空 2 h のミックスします。原液は、室温で暗闇の中で 1 年間保存できます。
2. オイル赤 O 3 つの部分 (例えば 60 mL 原液 40 mL 式行先方向₂0 の) 2 つの部分式行先方向₂0 に原液を混合することによって作業ソリューションを準備します。使用液でオイル赤 O の最終濃度は 2.1 mg/mL です。
3. 井戸からすべての流体を削除します。完全に井戸の辺からすべての水を削除するを確かめて、60% イソプロパノールとも 2 x を洗浄します。60% イソプロパノールを吸引し、すぐに底をカバーする井戸の壁に触れることがなくオイル赤い O 作業ソリューションを追加します。井戸が乾燥しないように、この手順を迅速に行うことが重要です。
4. オイル赤 O を追加すると、穏やかな揺動を室温で 10 分間インキュベートします。
5. オイル赤 O のすべてを削除し、すぐに蒸留 H₂o. 洗浄蒸留 H₂O の非連結オイル赤い o. を削除するのには 10 m を追加10 分後オイル赤 O の吸引し、洗浄の手順 3 x。
6. 洗濯が完了する、PBS を追加し、セルをイメージします。染色細胞を PBS で 4 ° C で保存します。

7. プロトコル 6: 染色アリザリン赤骨条件

1. 各ウェルからすべての流体を削除します。各ウェル (12 ウェル プレートのウェルあたり 1.5 mL) を 2% アリザリン赤染色液の適切なボリュームを追加し、ソリューションは完全に井戸の底をカバーするまでプレートを左右を軽く傾けます。
2. 室温で 15 分間インキュベートします。井戸からアリザリン赤を削除します。優しく蒸留 H₂O、ないカルシウムの結晶を取り除くため注意を取ってでも各 4 回を洗い流してください。乾燥することができます。

8. プロトコル 7: 染色とマッソンの軟骨状態ヒアリン

1. 蒸留水に Deparaffinize とハイドレートのセクション 30 分の 60 ° C の乾燥炉内のスライドを焼きます。
   1. 水分補給、脱アルコール剤、アルコール濃度を次のように降順で 5 分孵化後 3 5 分孵化にスライドを配置: 100% (無水エタノール) で 2 つ、95% アルコールで 2 つ、2 つで 80%、70% で 2 つ、最終的に 2 つに蒸留Bouin の定着剤は準備 H₂H₂O に残ります o. スライドします。
2. Bouin の定着剤 (発見) プラスチック製電子レンジ coplin jar の場所 40 mL。55 ° C に温度をもたらす高マイクロ波します。温水溶液中 20 分間; にスライドを配置します。カウンターに放置が覆われています。水道の流水で 10 分間、またはすべての黄色の色が消えるまで洗ってください。
3. 10 分の水道の流水で 10 分洗浄ダンピングを拒否のヘマトキシリンのセクションを染色します。
4. 10 分洗浄水道水の 3 × 10 分の Beibrich の緋酸フクシン溶液中のセクションを染色します。10 分間リンタングステン/リンモリブデン酸水溶液で媒染スライド。洗い流さないでください。
5. 10 分リンス水道水で 2 つの簡単なディップのアニリン ブルー溶液で直接スライドを配置します。
6. ステップ 5.4 と合成樹脂マウントで示されているように、3 に 5 分洗浄 1 分 Dehydrate の 95% エタノールで 1 分の場所の水道水に 1% 酢酸溶液にスライドを配置します。

結果

人間 PVAT 血管間質画分の分離

図 1 aは、上行大動脈を覆う PVAT が得られた解剖学的領域の概略を示しています。我々 は以前からこれらのサンプルあった派生⁶冠動脈バイパス術を受ける患者の集団を説明します。図 1 bは、手術後得られた人間 PVAT ?...

ディスカッション

別拠点から脂肪前駆細胞は、表現型と分化の潜在的な⁹が大きく異なります。3 つの異なる系統を同時誘導で単一の患者のドナーから PVAT 由来の前駆細胞を培養、脂肪細胞、骨、および軟骨、この小説の多能性容量の制御された調査可能します。前駆細胞の人口。人間 PVAT 由来の前駆細胞の分化能力をテストし、PVAT 病態と血管トーヌスの調節にその機能を理解する、このレ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal-free collagenase/dispase blend I	Millipore-Sigma	SCR139	50mg
Alcian Blue	NewComerSupply	1003A	1% Aqueous solution pH 2.5
Alizarin Red	Amresco	9436-25G
alpha-MEM	ThermoFisher	12561056
Aniline Blue	NewComerSupply	10073C
Antibiotic/antimycotic	ThermoFisher	15240062
Beibrich's scarlet acid fuchsin	Millipore-Sigma	A3908-25G
b-glycerophosphate	Millipore-Sigma	G9422-10G
Biebrich Scarlet	EKI	2248-25G
Biotin	Millipore-Sigma	B4501-100MG
Bouin's fixative	NewComerSupply	1020A
Bovine serum albumin	Calbiochem	12659	stored at 4 °C
Cell detachment solution	Accutase	AT104
Bell strainer (70 mm)	Corning	352350
Dexamethasone	Millipore-Sigma	D4902-100MG
DMEM	Corning	10-013-CV	4.5 g/L glucose, L-glut and pyruvate
DMEM/F12 medium	ThermoFisher	10565-042	high glucose, glutamax, sodium bicarbinate
DMSO	Millipore-Sigma	D2650
Fetal bovine serum	Atlanta Biologicals	S11550
FGF2	Peprotech	100-18B
Formalin	NewComerSupply	1090
Gelatin, bovine skin	Millipore-Sigma	G9391-500G
Glutamax	ThermoFisher	35050061	glutamine supplement
HBSS	Lonza	10-547F
IBMX	Millipore-Sigma	I5879-250MG
Insulin solution	Millipore-Sigma	I9278-5ML
Oil red O	Millipore-Sigma	O0625-100G
Pantothenic acid	Millipore-Sigma	P5155-100G
Penicillin-streptomycin solution	ThermoFisher	15240062	100ml
Permount	Fisher	SP15-500
Phosphotungstic/phosphomoybdic acid solution	Millipore-Sigma	P4006-100G/221856-100G
Primocin	Invivogen	ant-pm-1	Antimicrobial reagent for culture media.
Rosiglitazone	Millipore-Sigma	R2408-10MG
TGFb1	Peprotech	100-21
Weigert's hematoxylin	EKI	4880-100G