JoVE Logo
著者
お問い合わせ

サインイン

このコンテンツを視聴するには、JoVE 購読が必要です。 サインイン又は無料トライアルを申し込む。

この記事について

  • 要約
  • 要約
  • 概要
  • プロトコル
  • 結果
  • ディスカッション
  • 開示事項
  • 謝辞
  • 資料
  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

CRISPR/sgRNA ライブラリは、蛋白質コーディングの遺伝子を尋問に適用されています。ただし、CTCF 境界の遺伝子発現制御の機能を明らかにするための sgRNA ライブラリの可能性は未踏のままになります。ここでは、 HOX遺伝子座の CTCF 境界の働きを解明するHOX遺伝子特定 sgRNA ライブラリをについて説明します。

要約

CCCTC 結合因子 (CTCF)-仲介された安定した位相ドメインを関連付ける (TADs) 近隣 TADs のある DNA 要素の制約の相互作用で重要な役割を果たします。CTCF は、胚や体のパターン形成、造血、白血病を制御するHOX遺伝子発現の時空の調節に重要な役割を果たしています。しかし、それはHOX遺伝子の関連付けられている CTCF 境界クロマチン構造およびHOXの遺伝子発現を調節する方法かどうか、主として未知に残る。現在のプロトコルで少し形成とHOX遺伝子のクロマチンの CTCF 関連付けられた境界を中断することの効果を検討するHOXA/B/C/D座すべて CTCF 結合部位をターゲット特定 sgRNA プールされたライブラリが生成されました。式です。CRISPR Cas9 を介して遺伝学的スクリーニング、 HOXA7/HOXA9遺伝子 (CBS7/9) の間にある CTCF 結合部位は、 HOX遺伝子の異所性の維持のために重要であることと同様、発癌性クロマチン ドメインの重要な調節因子として同定されています。MLL 再配置の急性骨髄性白血病 (AML) の発現パターン。したがって、スクリーニングのアプローチこの sgRNA ライブラリの特定遺伝子座における媒介 CTCF ゲノム構成に新しい洞察力を提供し、また両方のコーディング、注釈付きの遺伝的規制要素の機能特性の基礎を提供し、ポスト人間ゲノム プロジェクト時代の正常な生物学的プロセスの間に、非翻訳。

概要

最近のゲノムの相互作用の研究では、細胞の種類と種の間で保存されているトポロジとして関連付けるドメイン (TADs) を人間の核ゲノム フォームに安定を明らかにしました。ゲノムの組織を別ドメインは容易、規制要素 (例えば、エンハンサーやプロモーター) 間の相互作用を制限します。CCCTC 結合因子 (CTCF) 少しの境界に、近隣 TADs1である DNA 要素の制約の相互作用に重要な役割を果たしています。ただし、ゲノム広い CTCF のデータ バインディングは、CTCF とほとんど同じ DNA サイトを異なる種類の細胞でやり取りが多くの場合として機能する他の示唆ではなく 1 つのセル型で特定のサイトでのクロマチン障壁を明らかにしたその CTCF 関数クロマチンの境界2の形成の他の活動。かどうか境界要素 (CTCF 結合部位) に直結する、CTCF の生物学的機能と、これらのリンクが発生する方法は不明のまま。したがって、我々 はゲノムの特定の CTCF 結合サイトは直接 TADs の形成を調節して制御プロモーター/エンハンサー相互作用ドメイン内または隣接ドメイン間と仮定します。人間とマウスのゲノム プロジェクト以降のエピジェネティクス解析の完了は、ゲノムの分子および遺伝の新しい署名を発見されています。しかし、遺伝子細胞の機能とその分子機構、特定の署名/変更の役割はまだ完全に理解するのにあります。

証拠の複数のラインをサポート CTCF を介した TADs はクロマチン機能ドメイン3,4,5を表します。CTCF とほとんど同じ DNA サイトを異なる種類の細胞でやり取り、ゲノム広い CTCF チップ seq データが判明 CTCF しばしば他の2ではなく 1 つのセル型でクロマチン バリアとして機能しています。CTCF はゲノム組織4,6,7を仲介することにより開発時に重要な役割を果たしています。CTCF 境界の中断障害エンハンサー/プロモーターの相互作用および遺伝子発現、発達的閉塞に 。TADs を CTCF に関与が示唆された構造のコンポーネントだけでなく、適切なエンハンサー アクションと遺伝子転写5,8,9に必要な規制の単位が。

HOX遺伝子は萌芽期の開発の間に重要な役割を果たす、彼らが時間的、空間的制限されてその発現パターン。HOXA軌跡 hESCs と IMR90 セル1の CTCF 関連付けられた境界要素で前部と後部の遺伝子を分離する 2 つの安定した TADs を形成します。最近のレポートは示したHoxBlinc、 HoxB軌跡関連付けられている lncRNA が CTCF の形成を仲介する TADs およびHOXB軌跡のプロモーター/エンハンサー相互作用を監督します。これは ESC のコミットメントと分化の10の間に前部HOXB遺伝子の活性化に します。さらに、 HOXAの軌跡を含む特定の遺伝子座、CTCF の変質は少しドメイン変更系統特異的遺伝子発現プロファイルを介したし、疾患状態11,12の開発に関連付けられていた。証拠は、遺伝子転写の調整と機能ドメインにゲノムを組織することによって細胞のアイデンティティを決定する CTCF の主な機能をサポートします。

HOX遺伝子は, 造血巣の中に萌芽期の開発に於いての役割にもかかわらず造血幹・前駆細胞 (HS/PC) の機能を調節します。これは、増殖・分化10,13,14,15の間のバランスを制御することによって行われます。HOX遺伝子の発現が仕様と HS の最高の表現で、造血細胞の分化の中で堅く調整される pc HOX遺伝子発現は徐々 にその最も低いレベルの成熟に伴う減少/造血細胞16を区別で発生しています。HOX遺伝子の調節不全は、HS/pc 白血病変換17,18につながる dysregulating の自己複製と分化プロパティによる白血病変換の支配的なメカニズムです。ただし、確立と関連規制の網と同様、 HOX遺伝子の発癌性発現パターンと通常を維持のメカニズムは不明のまま。

CRISPR Cas9 sgRNA ライブラリ スクリーニングは、lncRNA20 miRNA21種なども、非コーディングの遺伝子と蛋白質のコーディングの遺伝子19を尋問する広く使用されています。ただし、新しいゲノム標的を識別する CRISPR Cas9 sgRNA ライブラリを使用するためのコストは、高スループット ゲノム sgRNA ライブラリ スクリーニングに応用する頻繁ので高、まま。スクリーニング システム私たちの sgRNA は特定ゲノム遺伝子に焦点を当てたし、 HOXA9などのマーカー遺伝子の発現によるとワンステップ RT-PCR をターゲット sgRNAs を評価します。さらに、サイトをターゲット sgRNA を識別するためにサンガー シーケンス確認、sgRNA はゲノムと塩基変異に統合されたことを検出できます。軌跡固有 CRISPR Cas9 の遺伝学的スクリーニングを通じて CBS7/9 クロマチン境界は発癌性クロマチン ドメインを確立し、急性骨髄性白血病の病因における異所性のHOX遺伝子の発現パターンを維持するための重要な調節因子として同定されています。12. メソッドは、将来のエピジェネティック療法の潜在的な治療上のターゲットとして CTCF 萌芽期の開発、造血、白血病がまた CTCF 境界の境界だけでなく特定の機能を識別するために広く適用できます。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

プロトコル

1. CTCF sgRNALibrary オンライン ツールを使用して設計

  1. 遺伝的摂動プラットフォーム (GPP) デザイナー ツール (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design) を使用して人間のHOX遺伝子の CTCF 結合部位をターゲット sgRNA をデザインします。
  2. 303 ランダム ターゲット遺伝子、60 のポジティブ コントロール、500 の非人間ターゲット コントロール 207 CTCF 要素または lncRNA (図 1表 1) 遺伝子をターゲット対象と sgRNAs から成る 1,070 の sgRNAs の合計を合成します。各ターゲット DNA 要素は 5-10 の異なる sgRNAs の対象となります。

2. sgRNA ライブラリのクローニング

  1. CRISPR レンチ ウイルス バックボーン ベクトル (lentiCRISPRv2) に合成オリゴヌクレオチドを複製します。
    1. LentiCRISPRv2 ベクター 2 h の 37 ° C で BsmBI 制限の酵素と消化します。
    2. 大きいバンドの存在を探すため (約 12,873 bp) BsmBI 消化後ゲルのゲルの抽出キットを浄化し、。
      注:2 kb 小さいフィラー部分も、消化後ゲル上に存在がこれは無視されます。
    3. 合成オリゴヌクレオチドを縛るし、150 LentiCRISPR ベクトルを消化の ng 1 μ 10 μ M oligos、10 x T4 リガーゼ バッファー 2 μ、1 μ L T4 リガーゼの LentiCRISPR DNA を消化し、一晩で, 16 ° C で。
  2. レンチ ウイルスの CRISPR/sgRNA ライブラリを増幅用エレクトロ有能なセルに変換します。
    1. 1.8 で本体を準備 25 μ F、200 Ω kV。あらかじめ回復 37 ° C の水浴の SOC のメディアを暖かくし、あらかじめ暖かい 37 ° C で LB アンピシリン抗生物質プレート
    2. 10 分間氷の上有能なセルを解凍します。
    3. 氷の上のエレクトロポレーション キュヴェット 1.5 mL マイクロ遠心チューブと 1 mm を準備します。
    4. 1.5 mL のマイクロ遠心チューブに有能なセルの 25 μ L に 10 ng/μ L ライブラリ プラスミッド DNA の 1 μ L を混合し、数回手動で管の底をフリックで優しく混ぜます。
    5. キュヴェットは十分に寒いです、一度、DNA/有能な細胞の混合物を転送します。カウンターを 2 回たたくし、ティッシュ ペーパーでキュヴェットの外から水滴を拭いてください。キュヴェットをエレクトロポレーション モジュールで、パルスを押します。
    6. すぐに 37 ° C に予め温めておいた SOC のメディアの 975 μ L を追加します。上下にピペッティングして 15 mL チューブへの転送のミックス。
    7. 回転し、37 ° C 1 時間インキュベートします。
    8. 900 μ L の SOC のメディアに 100 μ L 細胞を希釈し、LB アンピシリン抗生物質寒天プレートに 100 μ L を配置します。37 ° C で一晩インキュベートします。
  3. 製造元のプロトコルの詳細としてマキシ prep 列を使用して結合されたコロニーからプラスミド DNA を抽出します。
    1. LB 寒天培地プレートからすべてのコロニーをこすりとスターター文化 LB アンピシリン抗生物質培地 2 mL を接種して活発な動揺 (~ 200 x g) 37 ° C で一晩インキュベートします。
    2. LB アンピシリン培地 100 mL にスターター文化レバレッジを希釈し、活発な動揺 (~ 200 x g) で 12-16 h の 37 ° C で孵化させなさい。
    3. 4 ° C で 15 分間 6,000 × gで遠心分離することで細菌の細胞ペレットを収穫します。
    4. 再懸濁液バッファーの 10 mL の細菌のペレットを中断します。
    5. 10 mL の溶解バッファーで中断されたペレットを溶解し、精力的に反転 4-6 回。ライセートの室温で 5 分間インキュベートします。
    6. チルドの中和バッファーの 10 mL で溶解液を中和します。ミックスを軽く反転管 4-6 回と氷の上に 20 分間インキュベートします。
    7. 4 ° C で 30 分間 13,500 x gでスピンダウンします。上清を新しいチューブにプラスミド DNA を含むを速やかに転送します。
    8. 2.3.7, 手順を繰り返し、上清を新しいチューブにプラスミド DNA を含むを速やかに転送します。
    9. 10 mL の平衡バッファーを適用することによってコラムを平衡させ、重力流による空の列ができます。
    10. 列に上清を追加し、重力流によって樹脂を入力できるようにします。
    11. 2 x 30 mL 洗浄液を洗い流します。
    12. 15 mL の溶出バッファーで DNA を溶出します。
    13. 10.5 ml 溶離された DNA を室温イソプロパノールの DNA を沈殿させます。ミックスのスピン 4 ° C で 30 分間 15,000 × gですぐにダウンし、優しく、上清をデカントが。
    14. 15,000 × g 10 分間遠心分離機 DNA ペレット 70% エタノール 5 mL で DNA ペレットを洗浄し、クリアの上澄みを廃棄します。
    15. 2.5.14 倍の手順を繰り返します。
    16. 15,000 × g , 10 分間で DNA の餌を遠心し、優しく DNA の餌を乱すことがなく、上清をデカントします。
    17. 5-10 分のペレットを風乾、バッファー (TE バッファー、pH 8.0) の必要量の DNA を溶解します。

3. 高価 sgRNA ライブラリ レンチ ウイルスを生成

  1. セルの準備: 文化 HEK293T 細胞でダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 10% (巻/巻) ウシ胎児血清 (FBS)、T-25 フラスコで 1% (巻/巻) ペニシリン-ストレプトマイシン (PS) 抗生物質。37 ° C、5% CO2インキュベーターに入れます。
  2. レンチ ウイルスのパッケージ: 共同 transfect HEK293T 細胞精製ライブラリからのベクトル ステップ 2、パッケージ プラスミド (psPAX2) の 15 μ g ・ 10 μ g ウイルスを収穫前に 48 h の封筒プラスミド (pMD2.G) の 20 μ g。
  3. ウイルス コレクション: 後 48 h、料率ウイルス上清と 0.45 μ m 低蛋白結合 PVDF 膜培養上清中のウイルスをフィルターします。
  4. ウイルス濃度: 50 コンセントレーターを使用してレンチ ウイルス上清を集中し、5 の手順でウイルス MOI をテストします。
  5. ウイルス ストレージ: 因数集中的ウイルス、-80 ° C の冷凍庫に保管します。

4. 最適化ピューロマイシン濃度

  1. 白血病細胞培養: 10% (巻/巻) ウシ胎児血清 (FBS) と T-125 のフラスコの中のペニシリン-ストレプトマイシン (PS) 抗生物質 x 1 添加 RPMI 1640 年に文化 MOLM13 AML 細胞。37 ° C、5% CO2インキュベーターに入れます。
    注:セルは通常 70% の confluency 以上の分割比 4:1 または 1:6 に到達する細胞をできないようにすることですべての 4-5 d を渡されます。
  2. MOLM13 細胞密度 (10 の4セル × 2.0) ウェルあたり 2 mL の容量で 104セル/mL、x 1.0 12 ウェル プレートを設定します。
  3. 経時的分析: 治療 MOLM13 細胞濃度 (0.1 μ g/mL、0.2 μ G/ml、0.5 μ G/ml、1.0 μ g/mL、2.0 μ g/mL) の増加で 7 日間の産
    1. 0 日目にピューロマイシンなし MOLM13 セルを設定し、セットアップ コントロールとしてピューロマイシンなし 3 複製井戸 0 日目から 7 日目。
    2. 3 複製井戸を含む各実験条件と別に、0.1 μ g/mL、0.2 μ g/mL、0.5 μ G/ml、1.0 μ g/mL、2.0 μ g/mL、MOLM13 細胞を扱います。
    3. 生細胞率をカウントし、すべての条件を含まれている 7 日目を 0 日から生存曲線を作る。
  4. 生存曲線: トリパン ブルーとカウントの存続可能性毎日各ピューロマイシン濃度の生存曲線を取得すると細胞を染色します。
  5. 最低限ピューロマイシン濃度の最適化: 5-7 日間のすべての MOLM13 でセルに殺されるトリパン ブルー染色を最小限ピューロマイシン濃度を決定します。

5. MOLM13 白血病細胞におけるレンチ ウイルス ライブラリの滴定

  1. 急性骨髄性白血病細胞の準備: 伝達媒体 MOLM13 AML 細胞を収集 (RPMI 1640 年 10 %fbs、1 %ps と 8.0 μ g/mL コーティング媒体) 1.5 x 10 の密度で6セル/mL です。
  2. 各ウェルに 10 の6セル × 1.5 12 ウェル プレートに MOLM13 セルを配置します。
  3. 解凍、レンチ ウイルス:-80 ° C のフリーザーから集中のレンチ ウイルスを削除し、氷の上にそれを解凍します。
  4. 0、1、2.5、5 を含む別の井戸で集中レンチ ウイルスの異なる用量でミックス MOLM13 セル 7.5 と 10 μ L (総 6 グループ)。
  5. すぐに 33 ° C で 2 時間 1,000 x gでこれらの混合物を遠心分離し、12 ウェル プレートを 37 ° C および 5% CO2で 4 h のためのインキュベーターに転送します。
  6. 4 h 後室温で 5 分間 400 x gで感染した細胞をスピンします。
  7. 優しく細胞ペレットを乱すことがなく、上清を吸引再新鮮なメディア (RPMI 1640、10 %fbs と 1 %ps) で導入された細胞を中断、T-25 フラスコに転送し、, ピューロマイシンなし 48 h の 37 ° C で。
  8. 48 時間後 2 フラスコ (2 グループ) にこれらの細胞を分割: 1 μ G/ml ピューロマイシンで 5 日間、治療実験グループと 5 日間ピューロマイシンなし制御グループ。
  9. すべての非導入制御の細胞が死んでいるまで 5 日間ステップ 4 に従って 1 μ G/ml ピューロマイシン ピューロマイシンを選択を実行します。新鮮なメディア 2 日ごとの交換です。
  10. ライブ ピューロマイシン ピューロマイシンなし細胞数と細胞数を割ることによって伝達の最適化された慣性モーメント値を測定します。

6. プール CRISPR Cas9 KO ライブラリの伝達

  1. レンチ ウイルスの伝達: 1.5 倍の中プール sgRNA レンチ ウイルスの 0.3 MOI 106 MOLM13 細胞に感染 (RPMI 1640 年 10 %fbs、1 %ps、8 μ g/mL コーティング媒体) 6 ウェル プレートでコントロールとしてレンチ ウイルス感染細胞を使用し、。
  2. すぐに spinfect への 33 ° C で 2 時間 1,000 x gで 6 ウェル プレート細胞を遠心分離し、プレートを 37 ° C、5% CO2で 4 h のためのインキュベーターに転送します。
  3. 室温で 5 分間 400 x gで感染した細胞をスピンします。
  4. 優しく細胞ペレットを乱すことがなく上清を吸引し新鮮なメディア (RPMI 1640、10 %fbs と 1 %ps) で導入された細胞を再停止 T-25 フラスコに転送し、ピューロマイシンなし 48 h の 37 ° C で孵化させなさい。
  5. 48 時間後の 5 日間 1 μ G/ml ピューロマイシンとセルを扱います。2 日後、新規メディアの交換し、最適な細胞密度で維持します。
  6. 希釈方法を制限することに 96 ウェル プレートで単一のクローンをシードし、37 ° C および 5% の CO2のこれらの単一クローンを孵化させなさい。3-4 週間の彼らを文化します。
  7. 単一のセルは人口に育つ後、さらに養殖ピューロマイシンを選択 24 ウェル プレートにセルの半分を転送次のステップでこれらのクローンを確認してください。セルの残りの部分を保ちます。

7. ワンステップ Rt-qpcr プール CRISPR Cas9 KO ライブラリーのスクリーニング

  1. SgRNA 統合されたクローン一歩逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応 (ワンステップ Rt-qpcr) とマーカー遺伝子HOXA9の発現を評価することによってスクリーニングの有効性を決定します。
    注:HOXA9は高い白血病22,23MOLM13 AML 細胞で表されます。
  2. カウント、sgRNA は、MOLM13 セルおよび転送 1 × 104細胞/ウェルの 96 ウェル PCR プレートに統合されています。
  3. 1,000 x gで 5 分でチューブを遠心分離機し徹底的に削除し、細胞ペレットを乱すことがなく、ピペットで上澄みを廃棄します。
  4. 125 μ L の PBS バッファーで細胞を洗浄し、1,000 x gで 5 分でチューブを遠心分離します。120 μ L のピペットを使用して上清を削除し、約 5 μ L の PBS 各井戸を保持します。
  5. 48 μ L のセル換散バッファー、プロテイナーゼ K 溶液 (10 mg/mL) の 1 μ L、DNase 溶液 (1 mg/mL) 1 μ L を含むセル換散のマスターの組合せの 50 μ L を各ウェルに追加します。その後、細胞ペレットを再停止する 5 回上下ピペットで移しなさい。
  6. 37 ° C で 5 分間続いて、室温で 10 分間のミックスをインキュベートし、5 分、75 ° C。
  7. -80 ° C のフリーザーの細胞ライセートを格納します。
  8. ワンステップ RT qPCR 反応の準備: ワン・ステップ反作用の組合せおよび 4 ° C の他の反応コンポーネントを解凍後、スピンダウンについて簡単にチューブの下部にソリューションを収集し、光のない氷の場所します。ミックスし、軽くスピンします。
  9. マーカー遺伝子の前方プライマーの 1 μ L を含む RT qPCR 反応ミックスと PCR 井戸に細胞ライセートの 1 μ L を追加 (300 nM) と逆プライマー (300 nM)、逆転写酵素 (10 U/μ L)、0.125 μ とワンステップの反作用の組合せ (2 x) の 5 μ L。
  10. 光学的透明フィルム、優しく渦と井戸をシールし、反応成分をミックスします。
  11. リアルタイム PCR 機器に 96 ウェル PCR プレートを配置します。
  12. 続いてポリメラーゼの不活性化と DNA の変性 95 ° C で 1 分の 50 ° C で 10 分間逆のトランスクリプション反作用を実行します。
  13. PCR の反作用の 40 のサイクルと RT-PCR を実行: 15 変性 95 ° C、焼鈍/エクス テンション、プレート蛍光 20 のための読書で 60 ° C とし、2-5 秒/ステップで 0.5 の ° C 単位で 65-95 ° C で融解曲線解析で s。
  14. 誘導、ダウンレギュ レート、 HOXA9遺伝子の発現レベルに従った変更グループはありませんちなみにコントロールには別にセットアップします。ハウスキーピング遺伝子制御としてβ-アクチン遺伝子を使用します。

8. 統合 sgRNAs ジェノタイピングとサンガー シーケンスを通して肯定的なクローンの検証

  1. サンガー HOXA9減少発現クローンを確認 50 100 ng MOLM13 ゲノム DNA の 5 μ L ポリメラーゼ反応バッファー (10 x)、1 μ L 前方プライマー (10 μ M) で PCR を行いシーケンス (AATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCG) と逆の 1 μ Lプライマー (10 μ M) (TCTACTATTCTTTCCCCTGCACTGTTGTGGGCGATGTGCGCTCTG)、1 μ L dNTP (10 mM)、1 ユニット ポリメラーゼ (5 U/µL)。30 の初期変性 94 ° c で PCR の反作用を実行 s、およびより変性 94 ° c 20 s、20 56 ° C で熱処理 s、20 68 ° C で拡張子 s (合計 30 サイクル)、68 ° C 10 分で最後の拡張、4 ° C で押しと
  2. 抽出し、PCR 精製キットで PCR の製品 (サイズ 285 bp) を浄化します。
  3. 2 μ L T4 結紮バッファー (10 倍) 50 ng T ベクター DNA を持つ T ベクターに精製 PCR 産物を縛る (50 ng/μ L)、25 ng 精製 PCR DNA (285 bp)、1 μ L T4 リガーゼ (3 単位/μ L)、および場所、結紮は一晩、16 ° C の定温器にミックスします。
  4. DH5α 有能なセルに結紮ミックスを転送、LB アンピシリン抗生物質寒天プレートに成長し、37 ° C で一晩インキュベート
  5. LB プレートから単一のクローンをピックアップし、遺伝子型とサンガーによる検証を行うシーケンス。

9 sgRNAs ヌクレアーゼ消化法による誘導塩基変異の検出

  1. SgRNA の統合された単一のクローンはヌクレアーゼ試験分析による塩基料金を検出します。
  2. 50-100 ng 塩基変異 (テスト) と野生型 (WT、参照) DNA PCR のテンプレートとして PCR 産物を別途準備 5 μ L ポリメラーゼ反応バッファー (10 倍)、1 μ L dNTP (10 mM)、1 ユニット ポリメラーゼ (5 U/μ L)、1 μ L 前方プライマー (10 μ M) (5'-GAGATGGCGGCGCGGAAG-3') と 1 μL 逆プライマー (10 μ M) (5'-AAATATAGGGCGGCTGTTCACT-3')。PCR の反作用は 98 ° C、30 秒で初期変性し、変性 20 98 ° C で行われた 20 56 ° C で熱処理 s s、30 秒 (合計 30 サイクル)、72 ° C での拡張子と最終的な 10 分のための 72 ° c、4 ° C で押し
  3. 200 とヘテロ二本鎖の混合グループを設定「参照」(20 ng/μ L) および 200 の ng 0.2 mL PCR チューブに「テスト」(20 ng/μ L) PCR 産物の唯一の 400 homoduplex 混合グループ ng「参照」コントロールとして PCR 産物の ng。
  4. 別に 800 mL の水でいっぱいとアニールし、ヘテロ二本鎖または homoduplexes を形成するために室温を徐々 にクールダウンし、1 L ビーカーに 5 分 95 ° C でヘテロ二本鎖と homoduplex の混合物を孵化させなさい。
  5. 焼なましヘテロ二本鎖と homoduplex の混合物、1 μ L 塩基変異検出ヌクレアーゼ (2.5 U/μ L) と 2 μ L ヌクレアーゼ反応バッファー (10 x) 42 ° C, 60 分の個別にダイジェスト 400 ng。
  6. Agarose のゲルの電気泳動と消化液のサンプルを分析し、ヘテロ二本鎖の混合物の DNA の小さな断片 (70-250 bp) と homoduplex DNA に切られるべき (320 bp) カットしてはいけません。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

結果

CRISPR Cas9 技術機能ゲノム研究のための強力な研究ツールです。編集技術従来の遺伝子の交換は急速に、ゲノム全体と個々 の遺伝子に焦点を当てたアプリケーションの高いユーティリティです。ここでは、最初個別に複製された軌跡固有 CRISPR 配列 Cas9 sgRNA ライブラリに含まれる sgRNAs 303 ランダム ターゲット遺伝子、60 のポジティブ コントロール、500 の非人間ターゲ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

ディスカッション

蛋白質コーディングの遺伝子は、遺伝子と sgRNA 濃縮24,25,26 を通じて特定の細胞機能を調節するネットワークを識別するための機能的スクリーニング システム sgRNA ライブラリを適用されている関連、27,28。いくつかの非コーディングの地域関連 sgRNA ライブラリは、また?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

開示事項

我々 は本レポートに関する利害の対立があります。

謝辞

著者はまた原稿を編集のニコラス セザーリを感謝します。仕事は、国立衛生研究所 (s. h.、R01DK110108、R01CA204044) からの助成金によって支えられました。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Lipofectamine 3000 reagentThermo Fisher ScientificL3000-008
Proteinase KThermo Fisher Scientific25530049
PuromycinThermo Fisher ScientificA1113802
Stbl3 cells Life Technologies C737303
HEK293TATCCCRL-3216
MOLM-13DSMZACC 554
lentiCRISPRv2Addgene52961
pMD2.GAddgene12259
psPAX2Addgene12260
pGEM®-T Easy Vector Systems PromegaA137A
T4 ligase New England Biolabs M0202S
QIAquick Gel Extract kitQIAGEN28706
QIAuick PCR purification kitQIAGEN28106
SingleShot™ SYBR® Green One-Step KitBio-Rad Laboratories1725095
QIAGEN Plasmid Maxi KitQIAGEN12163
Dulbecco’s Modified Eagle Medium Thermo Fisher Scientific 11965084
RPMI 1640 Thermo Fisher Scientific11875093
Fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher Scientific10-082-147
Penicillin/streptomycin/L-glutamine Life Technologies 10378016
Lenti-X Concentrator Clontech631232
Trypan Blue SolutionThermo Fisher Scientific15250061
PolybreneSanta Cruz Biotechnologysc-134220
Phosphate Buffered Saline (PBS) Genessee Scientific 25-507
TAE buffer Thermo Fisher Scientific FERB49
Surveyor® Mutation Detection KitsIntegrated DNA Technologies706020
Biorad Universal Hood II Gel Doc SystemBio-Rad170-8126
Centrifuge 5424 REppendorf5404000138
Digital Dry Baths/Block HeatersThermo Fisher Scientific88870002
TSX Series Ultra-Low FreezersThermo Fisher ScientificTSX40086V
Forma™ Steri-Cult™ CO2 IncubatorsThermo Fisher Scientific3308
Herasafe™ KS, Class II Biological Safety CabinetThermo Fisher Scientific51022484
Sorvall™ Legend™ XT/XF Centrifuge SeriesThermo Fisher Scientific75004506
Fisherbrand™ Isotemp™ Water BathsThermo Fisher ScientificFSGPD02
Thermo Scientific™ Locator™ Plus Rack and Box SystemsThermo Fisher Scientific13-762-353
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection SystemBio-Rad1855195
MiniAmp™ Thermal CyclerApplied Biosystems technologyA37834
Thermo Scientific™ Owl™ EC300XL2 Compact Power SupplyThermo Fisher Scientific7217581
Thermo Scientific™ Owl™ EasyCast™ B1 Mini Gel Electrophoresis SystemsThermo Fisher Scientific09-528-178
VWR® Tube Rotator and RotisseriesVWR International10136-084
VWR® Incubating Mini ShakerVWR International12620-942
Analytical Balance MS104TS/00METTLER TOLEDO30133522
DS-11 FX and DS-11 FX+ SpectrophotometerDeNovix Inc.DS-11 FX

参考文献

  1. Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
  2. Cuddapah, S., et al. Global analysis of the insulator binding protein CTCF in chromatin barrier regions reveals demarcation of active and repressive domains. Genome research. 19 (1), 24-32 (2009).
  3. Phillips, J. E., Corces, V. G. CTCF: master weaver of the genome. Cell. 137 (7), 1194-1211 (2009).
  4. Tang, Z., et al. CTCF-Mediated Human 3D Genome Architecture Reveals Chromatin Topology for Transcription. Cell. 163 (7), 1611-1627 (2015).
  5. Lupianez, D. G., et al. Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions. Cell. 161 (5), 1012-1025 (2015).
  6. Dowen, J. M., et al. Control of cell identity genes occurs in insulated neighborhoods in mammalian chromosomes. Cell. 159 (2), 374-387 (2014).
  7. Phillips-Cremins, J. E., et al. Architectural protein subclasses shape 3D organization of genomes during lineage commitment. Cell. 153 (6), 1281-1295 (2013).
  8. Narendra, V., Bulajic, M., Dekker, J., Mazzoni, E. O., Reinberg, D. CTCF-mediated topological boundaries during development foster appropriate gene regulation. Genes & Development. 30 (24), 2657-2662 (2016).
  9. Narendra, V., et al. CTCF establishes discrete functional chromatin domains at the Hox clusters during differentiation. Science. 347 (6225), 1017-1021 (2015).
  10. Deng, C., et al. HoxBlinc RNA Recruits Set1/MLL Complexes to Activate Hox Gene Expression Patterns and Mesoderm Lineage Development. Cell Reports. 14 (1), 103-114 (2016).
  11. Patel, B., et al. Aberrant TAL1 activation is mediated by an interchromosomal interaction in human T-cell acute lymphoblastic leukemia. Leukemia. 28 (2), 349-361 (2014).
  12. Luo, H., et al. CTCF boundary remodels chromatin domain and drives aberrant HOX gene transcription in acute myeloid leukemia. Blood. 132 (8), 837-848 (2018).
  13. Dou, D. R., et al. Medial HOXA genes demarcate haematopoietic stem cell fate during human development. Nature Cell Biology. 18 (6), 595-606 (2016).
  14. Lawrence, H. J., et al. Loss of expression of the Hoxa-9 homeobox gene impairs the proliferation and repopulating ability of hematopoietic stem cells. Blood. 106 (12), 3988-3994 (2005).
  15. Deng, C., et al. USF1 and hSET1A mediated epigenetic modifications regulate lineage differentiation and HoxB4 transcription. PLOS Genetics. 9 (6), e1003524(2013).
  16. Rawat, V. P., Humphries, R. K., Buske, C. Beyond Hox: the role of ParaHox genes in normal and malignant hematopoiesis. Blood. 120 (3), 519-527 (2012).
  17. Alharbi, R. A., Pettengell, R., Pandha, H. S., Morgan, R. The role of HOX genes in normal hematopoiesis and acute leukemia. Leukemia. 27 (5), 1000-1008 (2013).
  18. Rice, K. L., Licht, J. D. HOX deregulation in acute myeloid leukemia. Journal of Clinical Investigation. 117 (4), 865-868 (2007).
  19. Bassett, A. R., Kong, L., Liu, J. L. A genome-wide CRISPR library for high-throughput genetic screening in Drosophila cells. Journal of Genetics and Genomics. 42 (6), 301-309 (2015).
  20. Zhu, S., et al. Genome-scale deletion screening of human long non-coding RNAs using a paired-guide RNA CRISPR-Cas9 library. Nature Biotechnology. 34 (12), 1279-1286 (2016).
  21. Kurata, J. S., Lin, R. J. MicroRNA-focused CRISPR-Cas9 library screen reveals fitness-associated miRNAs. RNA. 24 (7), 966-981 (2018).
  22. Collins, C. T., Hess, J. L. Role of HOXA9 in leukemia: dysregulation, cofactors and essential targets. Oncogene. 35 (9), 1090-1098 (2016).
  23. Kroon, E., Thorsteinsdottir, U., Mayotte, N., Nakamura, T., Sauvageau, G. NUP98-HOXA9 expression in hemopoietic stem cells induces chronic and acute myeloid leukemias in mice. The EMBO Journal. 20 (3), 350-361 (2001).
  24. Koike-Yusa, H., Li, Y., Tan, E. P., Velasco-Herrera Mdel, C., Yusa, K. Genome-wide recessive genetic screening in mammalian cells with a lentiviral CRISPR-guide RNA library. Nature Biotechnology. 32 (3), 267-273 (2014).
  25. Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
  26. Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
  27. Zhou, J., et al. Dual sgRNAs facilitate CRISPR/Cas9-mediated mouse genome targeting. The FEBS Journal. 281 (7), 1717-1725 (2014).
  28. Sanjana, N. E., et al. High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome. Science. 353 (6307), 1545-1549 (2016).
  29. Rajagopal, N., et al. High-throughput mapping of regulatory DNA. Nature Biotechnology. 34 (2), 167-174 (2016).
  30. Korkmaz, G., et al. Functional genetic screens for enhancer elements in the human genome using CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 192-198 (2016).
  31. Rezaei, N., et al. FMS-Like Tyrosine Kinase 3 (FLT3) and Nucleophosmin 1 (NPM1) in Iranian Adult Acute Myeloid Leukemia Patients with Normal Karyotypes: Mutation Status and Clinical and Laboratory Characteristics. Turkish Journal of Haematology. 34 (4), 300-306 (2017).
  32. Yaragatti, M., Basilico, C., Dailey, L. Identification of active transcriptional regulatory modules by the functional assay of DNA from nucleosome-free regions. Genome Research. 18 (6), 930-938 (2008).
  33. Wilken, M. S., et al. DNase I hypersensitivity analysis of the mouse brain and retina identifies region-specific regulatory elements. Epigenetics Chromatin. 8, 8(2015).
  34. Narlikar, L., Ovcharenko, I. Identifying regulatory elements in eukaryotic genomes. Briefings in Functional Genomics and Proteomics. 8 (4), 215-230 (2009).
  35. Hnisz, D., et al. Activation of proto-oncogenes by disruption of chromosome neighborhoods. Science. 351 (6280), 1454-1458 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

転載および許可

このJoVE論文のテキスト又は図を再利用するための許可を申請します

許可を申請

さらに記事を探す

145 CRISPR Cas9 sgRNA CTCF HOX Rt qpcr

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

個人情報保護方針

利用規約

一般データ保護規則

お問い合わせ

図書館への推薦

JoVE ニュースレター

研究

教育

著者

図書館員

JoVEについて

Copyright © 2023 MyJoVE Corporation. All rights reserved