閉経後の心血管機能障害の外因性エストロゲン治療をスクリーニングするためのインビボエストロゲン欠乏マウスモデル

要約

臨床的には、閉経期の女性のエストロゲン欠乏は脂質破壊およびアテローム性動脈硬化症の発生率を悪化させる可能性がある。^{apoE-/-マウス}の二重後体横切開を介した両側眼欠法による生体内エストロゲン欠乏モデルを確立した。マウスモデルは閉経後の心血管機能障害の外因性エストロゲン治療のスクリーニングに適用可能である。

要約

閉経後の女性は閉経前の女性よりも心血管疾患を発症するリスクが高い。卵巣摘出時の雌マウスは卵巣摘出術(OVX)で、無傷の卵巣機能を有する雌マウスと比較して大動脈におけるアテローム硬化性病変を増加させた。しかし、アテローム性動脈硬化症を起こしやすいエストロゲン欠損マウスを含む実験室モデルは欠けている。この赤字は、閉経期の女性の臨床的なエストロゲン欠乏は、既存または進行中の脂質破壊およびアテローム性動脈硬化症の発生率を悪化させる可能性があるため、重要である。本研究では、アポリポタンパク質E(apoE)-/-^マウスにおける二重後体横切開による両側眼欠切による生体内エストロゲン欠損マウスモデルを確立する。次に、ヘーゼルナッツスプレッドを介して経口投与した17β-エストラジオールとシュードプロトジオスチン(PPD)(フィトエストロゲン)の効果を比較する。我々は、PPDがOVX apoE-/-マウスの最終的な体重および血漿TGを減少させる上で何らかの効果を発揮するが、その17β-エストラジオールに匹敵する抗アテローム硬化および心臓保護能力を有することを見出した。PPDは、抗腫瘍特性を発揮することが報告されているフィトエストロゲンである。したがって、提案された方法は、閉経後の女性における伝統的なホルモン補充療法に代わるペラル投与を介して植物エストロゲンをスクリーニングするために適用可能であり、これは潜在的に有害な腫瘍遺伝学を有することが報告されている。容量。ヘーゼルナッツスプレッドを介した経口投与は非侵襲的であり、多くの患者に広く適用可能である。この記事には、ヘーゼルナッツスプレッドを介したapoE-/-マウスおよび前腔17βエストラジオールまたはフィトエストロゲンホルモン置換における二重後側切開による両側眼耳切開のステップバイステップのデモンストレーションが含まれています。心エコー検査を用いて血漿脂質と心血管機能解析を行う。

概要

疫学的および臨床的研究は、閉経後の女性が閉経前の女性^よりも心血管疾患のリスクがかなり高いことを示しています 1,^2.ホルモン補充療法(HRT)は、心血管疾患の相対的なリスクを0.37-0.79³に減らすことができます。他の合併症の中で、心血管疾患によって引き起こされるアテローム性動脈硬化症は、世界的な死亡原因の主要な原因である4.しかし、アテローム性動脈硬化を起こしやすい状態を示すエストロゲン欠損マウスを含む実験室モデルは欠けている。このプロトコルは、閉経後の心血管機能障害の外因性エストロゲン治療をスクリーニングするための生体内エストロゲン欠乏マウスモデルを提供する。

以前の研究は、高コレステロール食を与えたアテローム硬化性げっ歯類におけるOVXの適用は、アテローム性動脈硬化症5、6、7、8に苦しむ閉経後の女性を模倣できることを示している。閉経期の女性のアテローム硬化状態に似た再現性と便利な動物モデルは、外因性エストロゲン研究の基礎です。ここで、アテローム性動脈硬化症を起こしやすいアポリポプロテインEノックアウト(apoE-/-)マウス9、10に両側側切開の二重後側切開を適用した。中腹部または背部切開と比較して、二重背部横切開は、重度の腹腔の接着および炎症を避けることができるより簡単で、より少ない時間のかかる方法である。ヘーゼルナッツスプレッドを介した経口投与(材料の表を参照)は非侵襲的で便利であり、長期投与モード11として広く適用可能である。スローリリースペレット注入も人気6.しかし、インプラントは、特にOVXを受けたマウスにおける感染の発生率を悪化させる可能性がある。経口ガバゲージや水投与などの他の非侵襲的投与モードにも多くの欠点がある。経口ゲージは、典型的にはマウスにストレスを与え、経口損傷を引き起こす可能性がある。飲料水を介してホルモンを投与することは非常に有益です。しかし、外因性エストロゲンが水中に不溶性であるため、乳化剤としてのDMSOの添加は避けられません。ここでは、長期投与のためのヘーゼルナッツスプレッドを介したペラル17βエストラジオールまたはフィトエストロゲンホルモン置換を選択した。

最近、閉経後女性の心血管系に対するHRTの有益な効果は、女性の健康イニシアチブ(WHI)^試験12で争われている。一方で, 外因性エストロゲン単独で心血管系に有益な効果を発揮;一方、それは心血管イベントのリスクを高めるために酢酸メトヒドロキシプロゲステロンと組み合わせることができます。より深刻に、HRTは乳房および子宮腫瘍の進行につながる可能性があり、この効果は著しくその使用を制限している^13,14.腫瘍細胞15、16、17における有人活性を欠く外因性エストロゲンの心血管保護効果に、より多くの関心が集まっている。ヒトおよび動物における複数の研究は、エストロゲンと同様の構造を有する植物エストロゲンが心血管保護15,18において有益な役割を果たすことができることを示唆している。

したがって、本研究の目的は、(i)apoE-/-マウスおよび(ii)の心血管保護効果を比較するために、二重後体横切開を介して両側眼球切開による生体内エストロゲン欠乏マウスモデルを構築する(i)。ヘーゼルナッツスプレッドを介して17β-エストラジオールおよび擬似プロトジオシン(PPD)を投与した。17β-エストラジオールは、女性の性ホルモン6、11、19に属する外因性エストロゲンの一種である。PPDは、ジオスコア植物由来のステロイドサポニンおよびフィトエストロゲンであり、以前に抗腫瘍^特性20を発揮することが報告されている。

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プロトコル

すべての動物のケアと実験プロトコルは、中国医学アカデミーと北京連合医科大学の機関動物ケアと使用委員会によって承認されました (許可No.: SYXK (北京) 2013-0023).apoE^-/-マウスの起源はC57BL/6J9、10です。

1. apoEにおける二重後部横切開による両側眼切開^{術-/-マウス}

1. 引き取り(28歳)で、アバーチン(トリブロモエタノール;200mg/kg;精前内)で雌のapoE-/-C57BL/6Jマウスを麻酔する。
   注:32 apoE-/-マウスをランダムに4つのグループに分けた:SHAM、OVX、OVX/E2、およびOVX/PPD群(n=グループ当たり8)。
2. 動物を暖房パッドの上に置きます。麻酔中に目の保護のための目の潤滑剤を適用します。
3. 体温を36 ±0.5 °C以内に維持します。マウスの首の横面に鎮痛薬カルプロフェンの体重5mg/kgを皮下に投与する。
4. 腸の紋から3 x 5 cm²マウス領域の頭を剃ります。3 x 5 cm²絞り外科シートで動物を覆う前に、ヨウ素と70%エタノールで剃った領域を徹底的にきれいにします。実験中は無菌の器具と手袋を使用してください。
5. はさみと鉗子を使用して、中線に1cm横に切開し、肋骨に1cm横に切開します。
6. 鉗子を使用して皮下組織を率直に解剖する。
7. 解剖ゴーグル(材料の表を参照)を使用して、腹腔内の白い脂肪組織を識別します。
8. マイクロシサーとマイクロフォースを使用して、腹腔に達するまで筋膜を0.5〜1cm切開します。
   注:シャム操作グループの場合は、傷口を直接閉じます。モノフィラメント縫合糸を用いて筋肉層と皮膚を別々に縫合する。
9. 腹腔内の白い脂肪組織が見えるとき、マイクロフォースを使用して脂肪組織をつかみ、穏やかに引き出します。腹腔内の脂肪組織で包まれたピンクの桑形の卵巣が見られます。
10. 0.5〜1cmの近位血管と子宮角をモノフィラメント縫合糸を使用してリゲートします。マイクロシサーを使用して卵巣を取り除き、残りの組織を腹腔に戻します。
    注:OVX操作の主な有害症状は、OVX作動マウスの高い死亡率につながる尿管結節である。これは解剖ゴーグルを使用して組織を識別することによって避けることができる。
11. 傷口を閉じてモノフィラメント縫合糸を用いて筋肉層と皮膚を別々に縫合する。
12. はさみと鉗子を使用して、中間線に1cm横に、反対側の肋骨に1cmの横に別の切開を行います。上記の手順を繰り返します (1.5 ~ 1.11)。
13. 動物に麻酔から目を覚まさせてください。手術後の最初の日にマウスを別々に保管してください。
14. 回復フェーズ中にケージを頻繁にクリーニングまたは交換します。
15. 手術後約24時間、鎮痛カルプロフェンの体重5mg/kgを皮下に投与する。

2. ヘーゼルナッツスプレッドによる17βエストラジオールまたはPPDの経口投与

1. ゴマ油に17βエストラジオールまたはPPDを十分に溶解し、ごま油とヘーゼルナッツスプレッドを混ぜます(材料の表参照)。各30gマウスの1日当たり3μg、PPDの15μg、ゴマ油4μL、ヘーゼルナッツスプレッド60mgを含む。各30gマウスのプラセボを準備し、ゴマ油の4 μLとヘーゼルナッツスプレッドの60mgが含まれています。
   注:17β-エストラジオールまたはPPDの毎日の投与部分は、以前の研究6、11および予備実験に基づいていました。
2. OVXの1週間後、高コレステロール食(1.25%コレステロール、0%のコレート)でマウスに12週間給餌する。本研究で用いられる典型的な実験的処置スキームを図1に示す。
3. 第4週にヘーゼルナッツの浸透投与が広がる5日前に、約30mgのヘーゼルナッツスプレッドを含むプラセボを5日間5日間2〜5匹のマウスに食べさせるマウスを訓練する。最初の3日間、自宅のケージでグループでマウスを訓練します。トレーニングの4日目と5日目にマウスを別々のケージに入れ、実験状況に似た毎日の部分を提供します。
4. 最後の9週間の間に、マウスを別々のケージに入れ、その後、すべての摂食機会のためにヘーゼルナッツスプレッド部分を毎日提供します。
   注:17β-エストラジオール(0.1 mg·kg^-1)またはPPD(0.5 mg·kg^-1)を含む毎日の部分を提供し、それぞれOVX/E2およびOVX/PPD群で広がるヘーゼルナッツを介して。シャムとOVXグループに広がるホルモンフリーヘーゼルナッツを含む毎日の部分を提供します。

3. マイクロ超音波システムを用いた内分厚と心機能障害の判定

1. 超音波バイオ顕微鏡検査
   1. 終了の1日前に、前述^の21のように、マイクロ超音波システム(材料の表を参照)を使用して、内性媒体の厚さと心臓機能障害を調べる。
   2. 検査の前に、各マウスに麻酔としてアバーチン(トリブロモエタノール)の200mg/kgのペリトネアル注射を与える(n = 8マウス/グループ)。
   3. 各マウスの首の毛を慎重に剃ります。最適な画質を確保するために、暖かい超音波ゲルを自由に適用します。
   4. 12.7 mm の焦点と 40 μm の解像度で 30 MHz スキャン ヘッドを使用して、大動脈根と上昇大動脈のベースライン超音波画像を取得します。
   5. 監視のための鉛II構成の心電図を使用する。
   6. 収縮期の1つの平面で上昇大動脈、大動脈アーチ、および上皮動脈の枝の右のパラスター的な長軸画像をキャプチャします(図3)。
2. 内膜と最大プラーク厚さの測定
   1. トランスデューサと動脈部位との間の距離を容易に調整して、鮮明な画像を得ます。
   2. 画像解析システム上のオフライン検査のために10sシネループをデジタルで保存します。
   3. さらなる測定のために、最適なフリーズフレーム超音波画像を手動で選択します。上昇大曲の小さな曲率の画像を確認します。上昇大動脈のプラークが見られる場合は、最大プラークの厚さを測定します。上昇大動脈のプラークが見えない場合は、最大IMTを測定します。
   4. IMT(血管発光親密なインターフェイスと中間臨度インタフェース間の距離)を測定します。最大プラークの厚さ(血管内膜とアドベンティタル層の境界間の最も厚い距離)を測定します。
   5. 3つの病変部位からの平均データ(図3)。
3. 心エコー検査を用いた心機能障害の判定
   注:前述の22.i.i.を用いて、マイクロ超音波システムを用いて心エコー検査を行う。
   1. 乳頭筋の近くで、心臓に向かって超音波ビームを指示します。
   2. 2次元心電図ベースのキロヘルツビジュアライゼーションを実現します。
   3. 30 MHzスキャンヘッドを用いて左心室の生体経胸エコー検査を行う。
   4. Mモードトレースから心臓機能に関連するパラメータをデジタルで測定します。
   5. 3~ 5 回の心臓周期のデータの平均値 (表1)。
4. 観測内および観測間の変動
   1. 観測点内変動の検証のために、2 つの異なる機会に 1 人のオペレータによってデータを分析します。
   2. 観測値間変動の評価を行う場合は、別のオペレータ別のデータを分析します。

4. 毎週の体重測定と血漿総コレステロール(TC)とトリグリセリド(TG)判定

1. 毎週の体重測定
   1. 週 -1 から第 12 週まで週に 1 回体重を測定します。
      注:n = 1群あたり8匹のマウス。
2. プラズマ調製
   1. 心内穿刺を通じて血液サンプルを収集する前に、注射器とチューブを準備してください。抗凝固剤としてEDTAを使用してください。各 2 mL シリンジに 0.5 M EDTA の 10 μL を追加し、各 1.5 mL チューブに 0.5 M EDTA の 8 μL を追加します。
   2. 第12週で、一晩の断食の後、アバーチン(トリブロモエタノール;200mg/kg;食後経)でマウスを麻酔する。
      注:n = グループあたり3匹のマウス。
   3. 70%エタノールで腹部胸部を準備します。
   4. はさみと鉗子を使用して胸腔を開き、心臓が露出するまで肋骨を切ります。
   5. 25Gの針を右心室に挿入します。血液が注射器に流れ始めるまでゆっくりと吸引する。
      注:私たちは、25 G針で無菌状態で使い捨て注射器を使用しています(材料の表を参照)。
   6. 安定した、さらには圧力で吸引し続けます。血液が見られない場合は、針の位置を変更し、吸引を繰り返します。
   7. 必要な血液量を収集する前に、マウスを深く麻酔しておいてください。通常、最大1mLの血液を採取することができます。この深い麻酔状態下で子宮頸部脱臼によってマウスを安楽死させる。
   8. ピペット血液サンプルを1.5mLチューブに入れ、血液を十分に反転させ、EDTAを血液中に混合することを確認します。その後、すぐに氷の上に血液サンプルを置きます。
   9. 収集の30分以内に4 °Cで400 x gで20分の遠心分離機のサンプル。
   10. 上清を慎重に収集します。アリコートと-80 °Cでプラズマサンプルを保存します。
3. TC または TG コンテンツ測定用の標準曲線を構築する
   1. TC標準曲線の場合、コレステロール標準濃度は、0 mmol/L、0.52 mmol/L、1.03 mmol/L、2.07 mmol/L、4.14 mmol/L、6.20 mmol/L、8.27 mmol/L、10.34 mmol/L、10.34 mmol/Lの各標準量に対して調合します。各コレステロール標準の平均 O.D. を設定します。縦(Y)軸値として、水平(X)軸値として濃度を設定する。統計ソフトウェアを使用して標準曲線を作成します。
   2. TG標準曲線の場合は、TG規格の様々な濃度を調用意します:0 mmol/L、0.45ミリモル/L、0.90 mmol/L、1.81 mmol/L、3.62 mmol/L、5.42 mmol/L、7.23 mmol/Lおよび9.04 mmol/L.メジャーO.DG。各 TG 標準の平均 O.D. を垂直 (Y) 軸値として設定します。水平 (X) 軸値として濃度を設定します。統計ソフトウェアを使用して標準曲線を作成します。
      注:本研究では、標準曲線構造に4パラメータのロジスティックカーブフィッティング(4pl)を用いた。プラズマサンプルを測定する前に標準曲線を確認し、r2が0.995より大きいことを確認してください。
4. TC含有量測定
   1. TCアッセイキットのカラー試薬ボトル(25mL)を「TCワーキングソリューション」としてラベル付けします。
   2. 冷蔵標本を短時間渦にします。希釈を準備する:蒸留水の80 μLのプラズマの20 μL。簡単に渦希釈。
   3. 96ウェルプレートの適切なウェルに2.5 μLのコレステロール値(5.17ミリモル/L)または希釈プラズマの2.5 μLまたは蒸留水(ブランク)の2.5 μLを追加します。三部張りをお勧めします。
   4. すべてのウェルに、カラー試薬の250 μLを追加します。
   5. 37 °Cで10分間インキュベートします。
   6. マイクロプレートリーダーの電源を入れ、10分ウォームアップします。
   7. インキュベーターからプレートを取り出し、マイクロプレートリーダーを510nmで読み取ります。マイクロティターウェルまたはプレートの底部に気泡やほこりがそれぞれ存在しないことを確認します。
   8. TC 濃度を次のように計算します。
      TC+コレステロール標準+(血漿試料O.D.ブランクO.D)/(コレステロール基準O.D.ブランクO.D)
5. TG含有量測定
   1. TGアッセイキットのカラー試薬ボトル(25mL)を「TGワーキングソリューション」としてラベル付けします。
   2. 冷蔵標本を短時間渦にします。
   3. 希釈プラズマの 2.5 μL または 2.5 μL の希釈プラズマまたは蒸留水の 2.5 μL を 96 ウェルプレートの適切なウェルに 2.5 μL を追加します。三部張りをお勧めします。
   4. すべてのウェルに、カラー試薬の250 μLを追加します。
   5. 37 °Cで10分間インキュベートします。
   6. マイクロプレートリーダーの電源を入れ、10分ウォームアップします。
   7. インキュベーターからプレートを取り出し、マイクロプレートリーダーを510nmで読み取ります。
      注:マイクロティターウェルまたはプレートの底部に気泡やほこりが存在しないことを確認します。
   8. TG 濃度を次のように計算します。
      TG コント = TG 標準続行 × (プラズマサンプル O.D.ブランク O.D)/(TG 規格 O.D.ブランク O.D)

5. 大動脈硬化性硬化性病変の顔解析

1. 大オルタの分離と切除
   1. 第12週で、一晩の断食の後、アバーチン(トリブロモエタノール;200mg/kg;食後経)でマウスを麻酔する。この深い麻酔状態下で子宮頸部脱臼によってマウスを安楽死させる。
      注:1群につき3匹のマウスを用いた。
   2. 70%エタノールで腹部胸部を準備します。はさみと鉗子を使用して胸腔を開き、心臓が露出するまで肋骨を切ります。
   3. pH 7.4でリン酸緩衝生理食べ物で50 mLシリンジを充填してください(材料の表を参照)。左心室に25Gの針を挿入し、灌流からの高圧を避けるために右心房を切る。
   4. 0.05-0.08 mL/minの流量で灌流を行い、組織で灌流液を吸収します。
   5. 胸腔内の肋骨と肺をはさみと鉗子で取り除く。その後、腹腔を開き、大動脈のより良いビューのために内部の器官を削除します。
   6. 心臓をマイクロフォースで保持し、大腸骨分離までマイクロサイザーで背骨から背部に大疹を分離することにより、大腸を取り除きます。
      注:腎心房の枝の近くで解剖するときは、大抗断を避けるためにマイクロシサーを使用して深く切断します。
   7. 4%のパラホルムアルデヒドで48時間の心臓と大器を固定します。大小のいくつかを室温または2-8 °Cで生理食生理食(生理食)で数時間保存します。
      注:この手順により、クリーニングが容易になります。
2. 大器の調製
   1. 心臓を取り除く。ステレオ顕微鏡下でマイクロフォースとマイクロシサーを使用して、大官から気性組織を慎重に取り除きます。洗浄中に組織を湿らせておくために生理生理生理を使用してください。
      注:大動脈や、一般的な頚動脈を残した動脈、左鎖骨下動脈などの重要な枝を引き裂いたり、傷つけたりしないように注意してください。
   2. 1mmのイノミツを残し、一般的な頚動脈を残し、左鎖骨下動脈全体を切り取る。
   3. 外側の曲率を切り開き、次に左の一般的な頚動脈に切り開き、次に左鎖骨下動脈に切り取る。
   4. 腹部部分の底部に昇る部分の内側の曲率に沿って開いて切る。
   5. 黒いプラスチックシートに大器を平らに固定し、大断が乾燥するのを防ぐために生理生理を適用します。
3. 大器の親密な領域の画像
   1. ステレオ顕微鏡で顔大通りの写真を撮ります。測定を校正するために、画像にミリメートルスケールの定規を含めます。
   2. 同じ画像にアーチと胸部領域を含め、別の画像に腹部領域を含めます。JPEG または TIFF としてイメージを保存します。
      注:アーチ領域は心筋の接合部から左鎖骨下動脈から3mm遠位に、胸部領域は左鎖骨下動脈から最後の肋間動脈まで3mm遠位であり、腹部領域は腸骨への最後の肋間動脈である。分岐。
4. アテローム硬化性病変体法の定量化
   1. 校正
      1. 画像解析ソフトウェアで画像を開き(「材料の表」を参照)、空間キャリブレーションに進み、指示に従います。
      2. ルーラーをライン上に配置して、参照単位を mm に変更します。
   2. 測定
      1. 各画像に正しいキャリブレーションを設定します。
      2. 定規で3mmを測定します。
      3. アーチと胸部領域の測定: 心筋の接合部から左鎖骨下動脈から3mm遠位までのアーチ領域と、左鎖骨下動脈から最後の肋間動脈まで3mmの胸部領域の輪郭を描く。アーチおよび胸部領域の病変をトレースし、顕微鏡を通して大器を見る。
      4. 腹部領域測定:胸部領域の終わりから腸分泌分岐までの腹部領域の概要を説明する。腹部の病変をトレースし、顕微鏡を通して大動脈を見ます。
      5. 大陸の内面に対する病変領域を計算します。
      6. 研究グループに盲目の2人目の観察者を通じて定量を確認します。

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結果

本研究で用いられる典型的な実験的処置スキームを図1に示す。引き取り(28日目)において、雌のapoE-/-C57BL/6Jマウスをアバーチン(トリブロモエタノール;200mg/kg;精米内)で麻酔した。マウスは、1cmの後部切開を介して両側OVXまたはシャムを操作した。両側OVXの1週間後、マウスに高コレステロール食(1.25%コレステロール、0%のコレート)を12週間...

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ディスカッション

ここで説明する方法論は、閉経期の女性に見られる脂質破壊およびアテローム性動脈硬化症に似たマウスモデルである。閉経後の女性におけるエストロゲン欠乏は、徐々に複雑で広範囲に広がるアテローム性動脈硬化病変1を伴う既存または進行中の高コレステロール血症の発生率を悪化させることができることが十分に文書化^{されている。}診療所におけるアテローム性動脈...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
17β-estradiol, >98%	Sigma-Aldrich	E8875-250MG	Estrogen
Disposable syringes (with 25 G needles)	Hunan Luzhou Huikang Development Co., Ltd	0.5*19TWLB	Cardiac bleeding
High-cholesterol mouse diet	Huafukang Bio-Technology	N/A	1.25% cholesterol, 0% cholate
High-Resolution In Vivo Micro-Imaging System	VisualSonics	Vevo®770	Measurements of intima-media thickness and cardiac dysfunction
2-Methyl-2-butanol	Sigma-Aldrich	152463-250ML	Preparation of avertin
Micro Dissecting forceps, Curved 8mm	Kanghua Medical Equipment Co., Ltd		Surgical tools
Micro Dissecting forceps, Straight 8 mm	Kanghua Medical Equipment Co., Ltd		Surgical tools
Micro Dissecting Scissors, Curved/Sharp 8 mm	Kanghua Medical Equipment Co., Ltd		Surgical tools
Micro Dissecting Scissors, Straight/Sharp 8 mm	Kanghua Medical Equipment Co., Ltd		Surgical tools
Monofilament suture 4-0 1/2 5 x 12 19 mm	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd	R413	Suture and ligation of the tissues
Nut cream (Nutella)	Ferrero	N/A	Medium for peroral 17β-estradiol or PPD
OptiVisor optical glass binocular magnifier	Dohegan Optical Company Inc.	N/A	Assistant of identifying the tissues during ovariectomy
Phosphate-buffered saline at pH 7.4	SIGMA	P3813	Preparing 1 L saline
Pro MultiLabel Microplate Reader	Tecan	Infinite M1000	Plasma TC and TG determination
Pseudoprotodioscin	Shanghai Winherb Medical S & T Development	W-0427	CAS registry no. 102115-79-7
Rimadyl, 50 mg/mL	Pfizer Pharma GmbH	462986	Postoperative analgesia after ovariectomy
Sesame oil	Sigma-Aldrich	S3547-1L	Dissolving the 17β-estradiol or PPD
Solcoseryl Eye-Gel	Menarini, Solco Basle Ltd.		Eye protection during anesthesia
Stereo microscope	MCALON	MCL-6STV	Image of the intimal region of aorta
Table model high speed centrifuge	SIGMA	1-14K	Preparation of plasma
Scissors, slight Curve (14 cm)	Kanghua Medical Equipment Co., Ltd		Surgical tools
Scissors, straight Flat (14 cm)	Kanghua Medical Equipment Co., Ltd		Surgical tools
Tissue forceps, serrated, slight Curve (14 cm)	Kanghua Medical Equipment Co., Ltd		Surgical tools
Tissue forceps, serrated, straight Flat (14 cm)	Kanghua Medical Equipment Co., Ltd		Surgical tools
Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402-5G	Preparation of avertin
Triglycerides (TG) assay kit	Institute of Nanjing Jiancheng Biology Engineering	A110-1	Plasma TG determination
Total cholesterols (TC) assay kit	Institute of Nanjing Jiancheng Biology Engineering	A111-1	Plasma TC determination