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要約

本原稿では、レーザー走査顕微鏡とのSRS実験セットアップの統合により得られる刺激ラマン散乱(SRS)顕微鏡の実装について説明する。SRS顕微鏡は2つのフェムト秒(fs)レーザー源、Ti-Sapphire(Ti:Sa)および同期光学パラメトリック発振器(OPO)に基づいている。

要約

刺激されたラマン散乱(SRS)顕微鏡は近赤外線励起光を使用する;したがって、それは多くのマルチフォトン顕微鏡イメージング特性を共有しています。SRSイメージングモダリティは、適切なバンドパスフィルタとロックインアンプ(LIA)検出スキームを備えた非スキャンフォワードディテクタを装備することにより、市販のレーザー走査顕微鏡を使用して得ることができます。典型的なSRS顕微鏡の概略レイアウトには、2つのパルスレーザービーム(すなわち、走査顕微鏡で向けられたポンプとプローブ)が含まれており、これは画像面の空間と時間の両方で重なり合う必要があり、その後、顕微鏡の目的によって焦点を合わせます。サンプルは、X-y 平面を横切る焦点をラスターする 2 つのスキャン ミラー (SM) を介して行います。サンプルとの相互作用の後、送信された出力パルスは上の目的によって集められ、反転された顕微鏡に挿入される前方検出システムによって測定される。ポンプパルスは光学フィルターの積み重ねによって除去され、一方、試料の焦点体積で起こるSRSプロセスの結果であるプローブパルスはフォトダイオード(PD)によって測定される。PD の読み出しは、変調深度を抽出するために LIA によって復調されます。前方検出部を顕微鏡走査ユニットと同期させることにより、2次元(2D)画像を得ることができます。本論文では、SRS顕微鏡の実装について説明し、実証に成功し、直径3μmのポリスチレンビーズのラベルフリー画像の報告に成功した。SRS顕微鏡は市販されていないので、これらの特性を利用するために、自家製の構造が唯一の選択肢です。SRS顕微鏡検査は多くの分野で普及しつつあるため、SRS顕微鏡の実装に関するこの注意深い記述は、科学界にとって非常に有用であると考えられています。

概要

ライフサイエンスアプリケーションでは、SRS顕微鏡検査はラベルフリーイメージングのための強力なツールとして登場しました。SRS顕微鏡検査の基本的な考え方は、振動コントラストの強さと数秒で画像を取得する能力を組み合わせることです。

SRSは、2つのレーザービーム周波数(ポンプ信号とストーク信号が異なる周波数で信号をストーク)と一致し、ラマン散乱を刺激し、有意な結果を引き起こすプロセスです。ストークス信号の増加。線形ラマン分光法とは異なり、SRSは入射光場に非線形依存性を示し、一貫した放射線を生成します。SRSには、1)速度、サンプルの動きや劣化に起因するアーティファクトに対する画像の感度が低くなる、2)優れた信号対雑音比(SNR)の2つの基本的な利点があります。さらに、SRSは自発的なラマンと同一のスペクトルを示し、SRS信号は、励起1、2、3、4、化学結合の濃度に直線的に比例する。5.

私たちの顕微鏡では、フェムト秒(fs)SRS実験セットアップは、高速ミラースキャンユニット(図1)6、7、8を装備した反転光学顕微鏡と統合されています。この顕微鏡を実装するために2つのパルスレーザー源が使用されます。1つ目は、パルス持続時間が約140fs、繰り返し速度が80MHz、発光波長が680~1080nmのfs-Ti:Saです。第2は、プローブビームとして使用され、Ti:Saによってポンピングされたフェムト秒同期光学パラメトリック発振器(SOPO)で、パルス持続時間は約200fs、繰り返し速度は80MHz、発光波長は1000~1600nmです。なお、Ti:SaとSOPOビームの間の最小光子エネルギー差は2500cm-1である。従って、このレーザーシステムの組み合わせを用いて、ラマンスペクトルの高周波C-H領域(2800-3200cm-1)のみを探索することができる6、7、8。

SRS顕微鏡をセットアップするためには、連続する段落に記載されている3つの重要な問題を考慮する必要があります。1 つ目は、高周波変調転送方式の実装です (説明については、プロトコルの図 2およびステップ 2.1 を参照)。SRSの実験的調査では、重要なパラメータはシステムの感度です。SRS信号は励起ビームの強度の小さな変化として検出されます。したがって、レーザー強度ノイズやショットノイズによって破損する可能性があります。この問題は、このシステムを高周波変調転送方式と統合することで解決できます (詳細については、プロトコルの図 2およびステップ 2.1 を参照してください)。この方法では、ポンプを調節するために電気光学変調器(EOM)が使用されます。プローブビームに転送された変調は、光学フィルタのスタックでポンプビームを遮断した後にPDによって検出することができる[刺激されたラマンゲイン(SRG)検出モード]。PD出力はローパスフィルタでロックインアンプ(LIA)に接続され、測定された信号を復調します。ビームの変調周波数を1MHz以上の周波数に増やすことで、PDの本質的な限界を得ることができます。

考慮すべき第二の問題は、前方検出を行うことを可能にする機械マウントの設置と同時に、明るい分野での顕微鏡観察を維持することです。さらに、画像の生成時に機械的振動による騒音を低減し、検出システムの正確な再配置を可能にする必要があります(プロトコルの図3およびステップ2.2を参照)。

第3は、位相感受性検出スキームによって得られた信号の同期であり、ビームは顕微鏡のスキャンヘッドによって監視されるサンプルに置かれる。画像を実現するためには、スキャンヘッドユニットに接続された顕微鏡コントローラが利用できる3つのTTL信号(ピクセルクロック、ライン同期、フレーム同期)が必要です。同期は、PCIカード、3つのTTL信号、およびLIA6、7、8の出力チャネルでの電圧信号の取得を使用して制御することによって達成される。自家製ソフトウェアが開発され、前述の6,7,8, 同期システムのハードウェアが図4で報告されています。

SRSイメージングを行う際の基本的な手順は、顕微鏡アライメントです。これは、連続する段落に記載されている4つのステップの過程で実現されます。1 つ目は、2 つの梁の空間的な重なりです(プロトコルの手順 3.1 を参照)。この実験セットアップでは、2つのビームをダイクロイックミラーによって空間的に結合した。予備ステップは、それぞれが顕微鏡に到達できるように、OPOとTi:Saの位置合わせです。次に、OPOを基準ビームとして考え、位置感度検出器を利用して、Ti:Saを空間的にOPOと重なります。

2 番目の重要な側面は、2 つのビームの時間的な重なりです (プロトコルの手順 3.2 を参照)。ポンプとOPOビームが完全に同期している場合でも9、OPOハウジング内のわずかに異なるビームパスに従うため、OPO出口では約5nsの時間遅延と5cmの空間差があります。したがって、Ti:Sa と OPO は、サンプルで時間的な重複を確実にするために、光学的に再タイミングを行う必要があります。これは通常、Ti:Saと顕微鏡の間に挿入される微細に微調整可能な光遅延ラインで達成されます(図1参照)。2 つのビームの時間的な重なりを得るために、2 つの手法が使用されます。1つ目は高速PDとオシロスコープを使用して行い、2つ目は自動およびクロスオプティカル相関に基づいています。最初の技術を使用して、2つのビームの大まかな重なり(10psの不確実性)、2つのビームの正確な時間的な重なりはクロスコリレータ(1 fsの分解能)を使用して得られます。

第3の重要な側面は、顕微鏡内の2つのビームの位置合わせです(プロトコルのステップ3.3を参照)。サンプルの予備的な白色光観察は、所望の視野(FOV)を分割することを可能にする。その後、レーザー光は、顕微鏡の側面ポートによって顕微鏡に入り、上部に取り付けられたPDに到達するために整列される(図3)。ただし、正しい画像集録を行うには、いくつかのパラメータ(ピクセル寸法やピクセルの所要時間など)を設定する必要があります。サンプリング周波数は、画像内のすべての情報を保持するためにナイキストの合理士によって課される制約を尊重する必要がありますが、各ピクセルで測定されたピクセルの空間座標とSRS値の間の正しい対応のために、統合時間LIA は、ピクセルのドウェル時間と等しいか同等である必要があります。

顕微鏡アライメントの最終段階では、空間的および時間的な位置合わせを最適化するために多数の試験が行われます(プロトコルのステップ3.4を参照)。空間的な重なりを最適化するために、Ti:Sa と OPO の両方に対して多数の伝送イメージ (TI) が取得されます。TIでは、単一のビームが使用され、サンプルからの透過ビーム強度がPDによって測定されます。OPOで実現したTIの場合、PD出力信号はPCIカードに直接接続され、Ti:Saで実現したTIの場合は、PD出力信号がLIAに接続され、LIAのアナログ出力がPCIカードに接続されます。透過画像は、FOV、照明、顕微鏡目的の焦点位置を最適化し、2つのビームが空間的に重なっているかどうかを確認するのに非常に有用である6、7、8。

ポンプとプローブビームの時間的な重なりの最適化は、3.3fsのタイムシフトに対応する0.001mmのステップで遅延ラインをスキャンし、直径3μmのポリスチレンビーズサンプルの単一点でSRS測定を行うことによって得られます。SRS信号の振幅は、プローブポンプ遅延の関数としてLIAからの値を測定し、2つのビーム6、7、8の正確な時間的な重なりに対応する最大値を提供する。結論を出す前に、すべての議論された手順は、高品質の画像を得るために必須であることに留意すべきです。

プロトコル

1. レーザーシステムの起動

  1. チラーの温度が20°C以下に保たがあるかどうかを確認します。
  2. 湿度制御ユニットが正常に動作し、湿度が約40%の値で維持されているかどうかを確認します。
  3. Ti:Saレーザーをオンにし、マニュアルの指示に厳密に従ってください。
  4. 波長を 810 nm に設定します。
  5. OPO と接続されているミニコンピュータの電源を入れます。OPO レーザーを制御するアプリケーションを実行します。
  6. OPO ボックスの出口で Ti:Sa レーザー出力の 100% が必要な場合は、バイパスを選択します。
  7. Ti:Saレーザー出力とOPOレーザー出力の20%がOPOボックスの出口で必要な場合は、バイパスの選択を解除します。
  8. Ti:Saのシャッターを開き、Ti:SaビームをOPO入力に放します。
  9. 信号出力とポンプアウトをクリックして、OPO 出口で 2 つのレーザー ビームを解放します。
  10. レーザーTi:SaとOPOの両方が安定するまで待ちます(約45-60分)。
  11. 紙検出器カードを使用して、Ti:SaとOPOの両方のOPOボックスの出口にあるビームスポットを確認し、電源メーターを使用して電力を確認します。
  12. OPO レーザー波長を 1076 nm に調整します。
  13. 各レーザービームの電力を約10mWに下げ、アライメントを実行します。

2. 顕微鏡の設置

  1. 高周波変調伝達法の実装
    1. Ti:Saビームが歪みなしで出入りするような変調器の光アライメント手順を実行します。
    2. ファンクションジェネレータをオンにして、TTL信号(振幅=5V、オフセット=2.5V、周波数=5MHz)を生成します。
    3. TTL 信号を T ジャンクションを使用して 2 つの部分に分割します。1 つは EOM 用、もう 1 つはロックイン アンプ (LIA) 用です (図 2を参照)。
    4. オシロスコープですべての信号レベルを確認します。
    5. LIA をオンにし、ジェネレータ出力チャネルを LIA の参照チャネルに接続します。
    6. 発電機出力チャンネルをEOMの高電圧パワーアンプに接続します。
    7. アンプをオンにし、電圧をほぼ最大レベルに設定します。EOM の出口でビーム電源を監視します。
  2. PDを修正し、xとyの相対運動を割り当てる機械的な土台の統合
    注:顕微鏡によって、xおよびy方向の動き制御があるマイクロメートルが装備されている外的な台紙が導入される。
    1. 2 つの移動変換ステージをマウントして、x 方向と y 方向に沿った移動を許可します (図 3を参照)。
    2. 適切な高さのØ1.5"ポストのステージを修正します。
    3. PD を外部マウントにマウントします。
    4. PD のビームパワーを最大化し、マウントに取り付けられたマイクロメータを使用して PD 位置(x 座標と y 座標)を調整します(図 3参照)。

3. 顕微鏡の位置合わせ

  1. 梁の空間的な重なり
    注: OPO ビームを参照として考慮し、位置に敏感な検出器を利用して、Ti:Sa は次の手順に従って OPO に重なる必要があります。
    1. OPO と Ti:Sa レーザービームを合わせて、両方とも顕微鏡に到達します。
    2. レーザー光位置センサ検出器をダイクロイックミラー1とミラー6の間の2つの位置に配置し、第1の位置はダイクロイックミラー1の近くに位置し、第2の位置はミラー6に近い。各位置について、センサーを使用して OPO ビームの x 座標と y 座標を検出します (図 1に従います)。
    3. Ti:Saレーザービームのx座標とy座標が、センサー検出器の両方の位置で同じOPOであることを確認します。一部の位置で Ti:Sa と OPO の座標が一致しない場合は、隣接するミラーの傾きを調整して差を補正します (図 1を参照)。
    4. M6-M7 間のパスの OPO に対して Ti:Sa ビーム位置を揃えるには、同じ手順に従います (図 1に従います)。
  2. ビームの時間的同期
    1. 高速フォトダイオードプラスオシロスコープの使用:
      1. Ti:SaおよびOPOビームの伝搬を停止し、OPOビームの前に高速検出器を配置します(M6とM7の間)。
      2. Ti:Saレーザーボックスが提供するトリガ信号を、チャンネル2のオシロスコープで接続します。
      3. 検出器ケーブルをチャネル 1 のオシロスコープに接続し、OPO 時数プロファイルを視覚化します。
      4. 最大値に対応するオシロスコープで測定した時間(abscissa)、すなわちt1を記録します。
      5. OPO ビームを停止し、Ti:Sa ビームを放します。
      6. Ti:Sa テンポラルプロファイルを視覚化し、最大値(t2)に対応する時間(abscissa)を記録します。
      7. 2 つの梁を重ねるために遅延ラインを使用して t1-t2 の差を最小限に抑えます。この場合、最小測定可能な差は10psです。
      8. M6とM7の間の高速検出器を取り外します。
    2. オートコレレータの使用:
      注:図 1に示す回路図では、ビームの光パスに干渉することなくオートコレレータが取り付けられています。さらに、M6とM7の間のフリップフロップマウント(FFM/AMと呼ばれる)に追加のミラーを導入し、ビームをオートコレレータに流用します。
      1. AM を反転して、ビームをオートコレレータに向します。
      2. Ti:Sa を停止し、OPO を解放します。
      3. オートコレレータのビーム距離調整ねじマイクロメータを法線位置(8.35mm)に設定します。
      4. オートコレレータコントローラの電源を入れ、それを制御するパーソナルコンピュータ上でソフトウェアアプリケーションを起動します。
      5. OPO ビームを FFM/AM から入力ミラーにオートコレレータに投影します。
      6. オートコレレータのアライメントウィンドウ上の梁の反射スポット(紙検出器カードを使用)を制御します。
      7. ノービーム強度または低ビーム強度の場合は、FFM/AMの位置と向きを最適な範囲に調整し、入力ミラー(オートコレレータに取り付けられた)を調整して、レーザーパルス信号を最大化します。オートコレレータ信号は、図5aに示すように得られる。
      8. FFM/AMからTi:SaビームのOPOとプロジェクトを停止し、ミラーをオートコレレータに入力します。手順 3.2.2.6 および 3.2.2.7 を繰り返します。オートコレレータ信号は、図5bに示すように得られます。
      9. ビーム距離調整ねじマイクロメーターをクロス位置(7.30 mm)に設定します。
      10. 両方の梁を放します。
      11. 遅延ラインをスキャンして、OPO と Ti:Sa が重なり合った 2 つのビームを取得します。クロスコリレータ信号は、図6に示すように得られます。
      12. ビームがM7に到達し、顕微鏡の頭部をスキャンできるように、ミラーFFM/AMを反転します。
  3. 顕微鏡アライメント
    1. 白色光顕微鏡観測を行う:
      注:顕微鏡観察の前に、顕微鏡が適切に整列していることを確認してください。
      1. 直径3μmのポリスチレンビーズが分散したリン酸バッファー溶液から成る試験試料を調製する。溶液は、2つのガラススライドのサンドイッチの中に配置されます。
      2. 白色光の顕微鏡と電源をオンにします。白色光の下での観察のためのマニュアルに従ってください。
      3. コンデンサーを使用してサンプルを照らします。光を収集するために60倍の目的を使用してください。サンプルをステージに配置します。60x顕微鏡目的の焦点位置を最適化します。
      4. 対象の FOV を選択します。サンプルの CCD 画像を撮ります (図7)。
      5. 白色光の電源をオフにします。
    2. フェムト秒レーザービームとの顕微鏡アライメント:OPOとTi:Sa
      1. エスケープボタンを使用してコンデンサーを取り外し、60倍の顕微鏡対物レンズを一時的に取り込みます。60倍の顕微鏡対物レンズを光学経路から外し、鼻を回転させます。
      2. 外部機械式マウントを使用して、顕微鏡上部に検出器を取り付けます。50Ωのローパスフィルタを介して検出器出力をオシロスコープに接続し、OPO信号を監視します。
      3. スキャナーヘッドを制御するプロセッサの電源を入れます。OPOビームを顕微鏡のスキャナーヘッドに投影します。
      4. 顕微鏡内のビームの位置を確認し、ビームの位置が中心または中心付近にあることを確認します。
      5. PDの頭の内側の梁の位置が中心にあることを確認します。
      6. x-yトランスレータを使用して検出器で測定する電力を最大化します。
      7. ビームをOPOからTi:Saに切り替え、チタンサファイアレーザーの最大信号も得られることを確認します。THis は、両方の梁が整列していることを示します。
      8. ビームアライメントを完成させ、60倍の顕微鏡対物レンズを導入し、ノーズピースを回転させます。
      9. 顕微鏡のリフォーカスボタンを使用して、60倍の顕微鏡対物レンズに最終焦点を取り戻します。
      10. サンプルに触れたり邪魔したりすることなく、コンデンサーの代わりに倍率40倍の目的を置きます。
  4. ビームの空間的および時間的な同期の最適化
    1. テンポラル同期
      1. 顕微鏡の前に測定したTi:SaとOPOのパワーを、両方のビームに対して30mWに設定します。ポンプとプローブがビーズの振動周波数と共振しないように、OPOの波長を前の値とは異なる値に設定します。
      2. 両方のビーム(Ti:SaおよびOPO)を離して顕微鏡に入るようにします。
      3. コンピュータ化された翻訳者のスキャン遅延ラインを実行し、遅延ラインの各位置のLIAによって測定された強度を記録します。遅延ラインのスキャンが完了するまで待ちます。得られた時間プロファイルは図8aで視覚化されます。
      4. ポンプとプローブがビーズの振動周波数と共振するように、OPOの波長を再び1076nmに設定します。ステップ 3.4.1.3 を繰り返します (得られた時間プロファイルは図 8bで視覚化されます)。
      5. SRSイメージを取得するには、遅延ラインで得られたオーバーラップビーム位置を設定します。
    2. 梁の空間同期
      注:透過画像は、顕微鏡の目的のFOV、照明、焦点位置を最適化し、2つのビームが空間的に重なっているかどうかを確認するのに役立ちます。
      1. OPOの伝送画像取得
        1. Ti:Saビームを停止し、OPO電力を8mWに下げる。
        2. 検出器の読み出しをデータ取得カードに接続します。
        3. 顕微鏡スキャンコンソールと一緒にデータ取得プログラムを実行します。
        4. ファイルを保存し、画像を取得するためにデータを処理します。生のイメージは図 9aに示すように表示されます。
      2. Ti:Saの伝送画像取得
        1. OPO ビームを停止し、Ti:Sa の電力を 2.5 ~ 4.5 mW に減らします。
        2. 検出器をLIAおよびLIAの読み出しとデータ集録カードで接続します。
        3. 手順 3.4.2.1.3 および 3.4.2.1.4 を繰り返します。生のイメージは図 9bに示すように表示されます。

4. SRS画像取得

注:データを格納するために専用のアルゴリズムが実現されました。512 px x 512 px および 256 px x 256 px のイメージ形式をサポートし、取得時間は 16 s、8 s、4 s、および 2 s です。

  1. ポンプパルス(Ti:Sa)を除去し、ストークス信号(OPO)のみを取得するために、40倍の目的とPDの間にフィルタのスタックを導入します。
  2. 8 mW の集中電力でポンプ信号を 810 nm に設定し、プローブ信号を 8 mW の集束電力で 1076 nm に設定し、典型的なポリスチレンの C-H 結合 (3054 cm-1のラマン シフト) を調製します。
  3. 検出器を LIA および LIA 読み出しとデータ取得カードに接続します。
  4. 必要に応して画像集録ピクセル形式を設定し、取得時間を設定します。
  5. 顕微鏡コントローラを制御するプログラムを実行します。
  6. 顕微鏡コントローラ、検出システム、およびDAQ間の同期として機能する専用のアルゴリズムプログラムを実行します(図4を参照)。
  7. 取得が完了したら、マトリックス ファイルを保存します。
  8. 生のデータ ファイルをインポートし、ImageJ ソフトウェアを使用して必要な形式 (通常は .tif 形式で保存) にイメージを保存します。図 10に示します。

結果

SRS測定の例(すなわち、試料の単一点におけるSRS測定)が図7に報告されている。ビームが時間または空間で重なっていない場合、得られた結果は図8aに報告される。オフレゾナンスでは、LIAによって測定される信号の振幅はゼロであり、LIAによって測定された信号の位相は負の値と正の値の間でジャンプします。一方、ビームが空間内で重なり?...

ディスカッション

SRS顕微鏡は、特に細胞や細胞構造の基礎である脂質などの複雑な生物学的構造の研究において、ラベルフリーイメージングを新たな高みに引き上げました。脂質は、生体膜の産生などの複数の生理学的経路に関与し、生合成前駆体およびシグナルトランスデューサ10として機能する。脂質は、脂質液滴(LD)とも呼ばれる特殊な細胞内小器官に包装されています。その直径は数?...

開示事項

著者は利益相反を宣言しない。

謝辞

IMM CNRのV.Tufano氏は、貴重な技術支援を受け、ニコンインスツルメンツの製品スペシャリストであるジャコモ・コッツィ氏に対し、有益な議論と継続的なサポートを提供し、感謝しています。この研究は、イタリア国立手術プログラムPONa3 00025(BIOforIU)とユーロバイオイメージング大規模な汎ヨーロッパ研究インフラプロジェクトによって部分的にサポートされました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Acquisation toolNikonNikon C2ToolAcquisation supported tool
APE Pulse link control softwareAPE-APE Pulse link control softwaresoftware control
AutocorrelatorAPEAPE PulseCheck USB 50Autocorrelator
DetectorThorlabsThorlabs DET10APhotodiode
Detector cardThorlabsThorlabs VRCIR detector Card
Dichroic mirrorSemrockSemrock FF875-Di01-25X36Dichroic mirror
Dichroic mirrorSemrockFF875-Di01-25x36Dichroic mirror
EOMConoptics(EOM CONOPTICS 3350-160 KD*P).Pockels cell
Fast detectorThorlabsThorlabs DET025AL/MPhotodiode
Fast mirror scanning unitNikonC2Microscpe scanning head
Femtosecond laser Ti:SACoherentCoherent Chameleon Ultra IIChameleon Ultra II
Function generatorTTiTG5011 AIM – TTiFunction generator
Inverted optical microscopeNikonEclipse TE-2000-E, NikonEclipse TE-2000-E, Nikon
Lock-in AmplifierStandford Research SystemSR844-200 MHz dual phaseA lock-in amplifier from Stanford Research Systems
Notch filter,SemrockNF03-808E-25Notch filter
Optical delay lineNewportNewport M-ILS200CCTunable optical delay line
Optical Parametric OscillatorCoherentCoherent Compact OPOCoherent Compact OPO
OscilloscopeWaveRunner640Zi 4GHz OSC/LeCroyDigital Oscilloscope
PCI CardNational instrumentNI PCIe 6363Data acquisation card
Position Sensors DetectorsNewportNewport Conex PSD9Position detector sensor
Power meter headCoherentPowerMax PM10,Laser power detector
Translation StagesThorlabsThorlabs PT1/MMeachnical Translation Stage with Standard Micrometer

参考文献

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