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要約

ここでは、精巣での RBP 候補の主要な RNA 標的を決定するための eCLIP プロトコルを紹介する。

要約

精子形成は、哺乳動物における男性生殖細胞分化の高度に順序付けられたプロセスを定義する。精巣では、転写および翻訳はクロッピングであり、RBPs によって組織化された遺伝子発現の転写後調節の重要性を強調している。RBP の機械的役割を解明するために、架橋免疫沈降 (CLIP) 法を用いて内因性の直接 RNA 標的を捕捉し、実際の相互作用部位を定義することができます。拡張クリップ (eCLIP) は、従来のクリップよりもいくつかの利点を提供する新たに開発された方法です。しかし、eCLIP の使用は、これまでのところ、拡張されたアプリケーションを呼び、細胞株に限定してきました。ここでは eCLIP を用いて、マウスの精巣における2つの既知の RNA 結合ヘリカーゼの MOV10 と MOV10L1 を研究した。予想通り、MOV10 は主に 3 ' 非翻訳領域 (UTRs) の mRNA に結合し、MOV10L1 は Piwi 相互作用 RNA (ピルナ) 前駆体転写物に選択的に結合することがわかった。私たちの eCLIP 法は、ディープシーケンシングを進めるための令状として、subclones の小規模なシーケンシングと、資格のあるライブラリの可用性を介して、様々な RBPs に縛られた主要な RNA 種を迅速に決定することができます。この研究は、哺乳類の精巣における eCLIP の適切な基礎を確立する。

概要

哺乳類の精巣は、複雑な細胞分化プログラムが、多数の精子を生成するために周期的に動作する優れた発達モデルを表しています。このモデルのユニークな値は、精子形成の特定の段階での転写不活化の出現にあり、典型的に meiotic 性染色体不活性化 (MSCI) が1,2発生し、ラウンド spermatids が起こるときspermiogenesis3の間の抜本的核圧縮。これらの inconsecutive 転写イベントは、RNA 結合タンパク質 (RBPs) が重要な役割を果たし、トランスクリプトームを形成し、男性生殖能力を維持する転写後の遺伝子調節を必要とします。

インビボで個々の RBP の真正な RNA 標的を同定するために、架橋免疫沈降 (CLIP) 法が、通常の RNA 免疫沈降 (RIP) を超えて4,5を開発した、6、7、紫外線 (UV) 架橋を含む主要なステップの組み込みによって、シグナル特異性を改善するために厳しい洗浄およびゲル転送を行う。クリップの高度なアプリケーションと高スループットのシーケンシングは、ゲノム全体のレベル8におけるタンパク質-RNA 相互作用のプロファイリングに大きな関心を引き起こしました。RBP 機能に関する遺伝学的研究に加えて、内因性タンパク質と RNA の直接相互作用を同定する生化学的方法は、RBPs の RNA 調節役割を正確に解明するために不可欠である。例えば、MOV10L1 は、男性生殖能力および Piwi 相互作用 RNA (ピルナ) 生合成9に必要な精巣特異的 rna ヘリカーゼである。その paralogue MOV10 は、RNA 生物学の複数の局面における役割を持つ遍在発現および多機能性 RNA ヘリカーゼとして知られている10、11、12、13、14,15,16,17,18. 従来の CLIP seq を採用することにより、MOV10L1 が一次ピルナ前駆体を結合して調節し、初期ピルナ処理19,20を開始し、mRNA 3 ' UTRs と非ノンコーディング RNA を結合 MOV10 ことを発見しました。精巣生殖細胞における種 (データは示さず)。

それにもかかわらず、クリップは元々、クリップタグの著しい損失でライブラリの準備をシーケンスすることによって、面倒な放射性手順です。従来のクリップでは、両方の RNA 末端で連結されたアダプターを使用して、cDNA ライブラリを用意しています。タンパク質消化後、架橋短ポリペプチドは RNA フラグメントに付着したままである。この架橋マークは、cdna 合成時の逆転写酵素 (RTase) 進行を部分的にブロックし、cdna ライブラリ21,22の約 80% を表す切り捨てられた cDNAs をもたらす。これにより、架橋部位をバイパスする RTase (読み出し) に起因する cDNA フラグメントのみが配列される。最近では、パークリップ、iCLIP、eCLIP、uvCLAP などの様々なクリップアプローチが、生きている細胞の RBPs の架橋サイトを特定するために採用されています。パークリップは、365 nm の UV 放射線および photoactivatable ヌクレオチド類似体の適用を含み、したがって、培養中の生細胞に排他的であり、そして新たに合成された転写物へのヌクレオシド類似体の組み込みはバイアスを生じる傾向があるRNA がタンパク質23、24と物理的に相互作用するところ。ICLIP では、1つのアダプターだけが、3 ' 架橋 RNA フラグメントの端に連結されます。逆転写 (RT) の後、intramolecularly 環状化および再線形化によって、cDNAs およびリードスルーの両方によって得られ、次いでポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) 増幅25、26が続く。しかし、分子内環状化の効率は比較的低い。旧式のクリッププロトコルは、放射性同位体を用いた架橋 RNA の標識を必要とするが、紫外線架橋および親和性精製 (uvCLAP) は、厳しいタンデム親和性精製の過程で、放射能27に依存しない。それにもかかわらず、uvCLAP は、タンデム親和性精製のために 3x FLAG − HBH タグを担持した発現ベクターでトランスフェクトされなければならない培養細胞に限定される。

ECLIP では、アダプターは最初に 3 ' RNA の端に、その後に RT が、そして次に分子間モードで cDNAs の 3 ' の端でライゲーションされました。したがって、eCLIP は、すべての切り捨ておよび読み取りスルー cDNA28をキャプチャすることができます。また、単ヌクレオチド分解能を維持しながら、放射性標識に制限されず、またその原理に基づいて細胞株を使用することもない。

ここでは、マウスの精巣に適応した eCLIP プロトコルの手順を順を追って説明します。簡単に言うと、この eCLIP プロトコルは精巣細管の UV 架橋から始まり、続いてタンパク質特異的抗体を用いた部分 RNase 消化と免疫沈降が続きます。次に、タンパク質結合 RNA を dephosphorylated し、アダプターをその 3 ' 末端までライゲーションする。プロテインゲル電気泳動およびゲル間移動後、RNA は、予想されるサイズ範囲の膜面積を切断することによって分離されます。RT の後、DNA アダプタが cDNA の 3 ' 末端に続いて PCR 増幅される。ハイスループット・シーケンシングの前の subclones のスクリーニングは、ライブラリーの品質管理として行われます。このプロトコールは、RBPs のタンパク質結合 RNA の主要な種を同定するのに効率的であり、2つの精巣発現 RNA ヘリカーゼ MOV10L1 および MOV10 によって例示される。

プロトコル

すべての動物実験は、南京医科大学の委員会によって承認されています.オス C57BL/6 マウスは、制御された光周期条件下で保持し、食物および水を供給した。

1. ティッシュの収穫および紫外線架橋

  1. Euthanize は、二酸化炭素 (CO2) を 1-2分または呼吸が止まるまで使用して2つの成体マウスを用いた。次に、各マウスに頸椎脱臼を行う。
  2. 各免疫沈降実験のために適切な年齢のマウスから100の精巣を収穫し、その組織を氷冷リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) に入れる。
  3. 中膜の albuginea を1組の微細なピンセットでそっと取り除いてください。
  4. ティッシュグラインダーで氷冷 PBS を 3 mL 追加し、ゆるいガラスの乳棒を使用して穏やかな機械的力によって組織を triturate します (ガラス乳棒をタイプします)。
    注:このステップの目的は、細胞を溶解することではなく、組織を引き離すことである。細胞の生存率と完全性の維持が重要である。
  5. 組織懸濁液を細胞培養皿 (直径 10 cm) に移し、氷冷 PBS を6ml まで添加する。
  6. 液体が皿の底を均等に覆うように、プレートを素早く振ります。組織が適切に接地されている場合、均一に分布した seminiferous 尿細管が目に見えるが、組織集塊の存在は、組織分散が最適でないことを示す。
  7. サスペンションを 400 mJ/cm2 で3回、氷上で 254 nm に架橋。各照射間に懸濁液を混合する。
    注:新しい実験ごとに、架橋を最適化する必要があります。
  8. 15 mL の円錐形のチューブとペレットで懸濁液を 1200 x gで、4° c で5分間回収します。上清を取り除き、ペレットを PBS の1Ml で再懸濁してから、懸濁液を 1.5 mL の遠心管に移す。4° c で2分間 1000 x gで回転し、上清を除去します。
  9. この時点で、すぐに残りのプロトコルを続行するか、またはスナップを液体窒素中のペレットを凍結し、使用するまで-80 ° c で保管してください。

2. ビーズの準備

  1. 試料 (ペレット) ごとに磁気ビーズを新鮮な遠心管に125μ l のタンパク質を加えます。
    注:マウス抗体にはプロテイン G 磁気ビーズを使用してください。
  2. チューブをマグネットの上に置き、ビーズを溶液から分離します。10秒後、上清を除去する。1 mL の氷冷溶解緩衝液でビーズを2回洗浄します。
    注:その後のタンパク質の分離磁気ビーズは、このステップに従います。溶解バッファー組成物は、50 mM トリス-HCl、pH 7.5;100 mM NaCl;1% NP-40;0.1% SDS;0.5% デオキシコール酸ナトリウム;1/50 ethylenediaminetetraacetic 酸 (EDTA)-遊離プロテアーゼ阻害剤カクテル (フレッシュ追加)。
  3. 再懸濁は、10μ g eCLIP 抗体を用いた冷間溶解バッファー中の100μ l のビーズを含む。45分の室温でチューブを回転させます。
    注:免疫沈降の最終抗体濃度は10μ g/mL である。抗体濃度が不明な場合は、抗体の量を最適化する必要があります。
  4. 1 mL の氷冷溶解緩衝液でビーズを2回洗浄します。

3. 組織溶解および部分的 RNA 消化

  1. 再懸濁は、冷溶解緩衝液中の 1 mL の組織ペレットを溶解する (20 μ l の 50x (EDTA)-フリーのタンパク質阻害剤カクテルおよび 1 mL の溶性緩衝液に11μ l の RNase 阻害剤を添加する)。
    1. 再懸濁は、実験のグループごとに2つの UV 架橋ペレットと2つの非架橋ペレットを使用します: eCLIP ライブラリ用 UV-架橋-1 ペレット (UV-1);ECLIP ライブラリ (UV-2) のための UV 架橋-2 ペレット。コントロールとしての eCLIP ライブラリの非架橋-1 ペレット (非 UV);抗体の特異性を実証するために IgG IP のための非架橋-2 ペレット。
      注: UV 架橋されたワイドタイプ精巣の eCLIP ライブラリーのための理想的な制御は、同じごみのマウスからの UV 架橋ノックアウト精巣のそれである。
  2. 溶解するのサンプルを氷上で15分間保持します (タンパク質および RNA の分解を防ぐため)。
  3. 超音波処理は、デジタル sonicator を 10% の振幅で5分間、30秒オン/30 秒でオフにします。常に氷の上にサンプルを置き、各サンプルの間のヌクレアーゼフリーの水でプローブをきれいにします。
  4. 各チューブに4μ l の DNase を加え、よく混ぜる。37° c で10分間インキュベートし、1200 rpm で振盪します。
  5. 10μ l の希釈した RNase I (PBS 中の 4 U/μ l RNase I) を加え、よく混ぜる。37° c で5分間インキュベートし、1200 rpm で振盪します。
  6. 遠心分離で 15000 x gで20分間 (4 ° c で) 溶解液を消去します。
  7. 慎重に上清を収集します。50μ l の溶解液を残し、ペレットを廃棄します。
  8. 入力サンプルをRWB (ウェスタンブロット用に実行) およびRRI (RNA 分離のために実行) として保存します。20μ l を保存 (2%)UV-1、UV-2、非 UV および IgG サンプルの RWB ゲルローディングのための入力として。20μ l を保存 (2%)の UV-1 または UV-2 サンプルを RRI ゲルローディングの入力として使用できます。

4. 免疫沈降

  1. 1 mL の溶解液 (ステップ3.7 から) をビーズ (セクション2で調製) に加え、サンプルを4° c で2時間または一晩回転させます。
  2. 磁気スタンドでビーズを収集し、上清を破棄します。900μ l の高塩分緩衝液 (50 mM トリス-HCl、pH 7.5; 1 M NaCl; 1 mM EDTA; 1% NP-40; 0.1% SDS; 0.5% デオキシコール酸ナトリウム) を2回洗浄してから、900μ l の洗浄バッファーでビーズを2回洗浄します
    注:IgG のサンプルについては、ここで手順を一時停止し、洗浄バッファーに氷の上に保管してください。
  3. 1x dephosphorylation バッファー500μ l (10 mM トリス-HCl、pH 7.5; 5 mM MgCl2; 100 mM KCl; 0.02% トリトン X-100) でビーズを1回洗浄します。

5. RNA 3 ' 末端の Dephosphorylation

  1. 磁気スタンドでビーズを収集し、上清を破棄します。細かいピペットチップを使用して残留液を除去します。Dephosphorylation マスターミックスの100μ l を追加します (10 μ l の 10x dephosphorylation バッファ [100 mM トリス-HCl、pH 8.0; 50 mM MgCl2; 1 M KCl; 0.2% トリトンの X-100; 1 Mg/mL ウシ血清アルブミン (BSA)];; ヌクレアーゼフリー水の2μ l、2μ l の RNase 阻害; 8 μ l の alkaline ホスファターゼ) を各試料に、37° c で15分間インキュベートし、1200 rpm で振盪する。
  2. 300μ l のポリヌクレオチドキナーゼ (PNK) マスターミックスを追加します (60 μ l の PNK pH 6.5 バッファー [350 mM トリス-HCl、pH 6.5; 50 mM MgCl2]; PNK のヌクレアーゼフリー水の223μ l; 5 μ l RNase 阻害剤; 2 μ l の DNase; 3 μ l、0.1 M ジチオスレイトール) 各サンプル、37° c で20分間インキュベートし、1200 rpm で振盪します。
  3. 磁気スタンドでビーズを収集し、上清を破棄します。500μ l のコールドウォッシュバッファーでビーズを1回洗浄します。次いで、500μ l の冷高塩緩衝液でビーズを1回洗浄する。この順序でもう一度これらの洗浄を繰り返します。
  4. 500μ l の冷間洗浄バッファーでビーズを1回洗浄し、300μ l の冷1x ライゲーションバッファー (no ジチオスレイトール、50 mM トリス HCl、pH 7.5; 10 mM MgCl2) を使用します。

6. rna 3 ' 末端への RNA のアダプターの結紮

  1. 上清を破棄し、細かいピペットチップで残留液を除去します。各サンプルに 3 ' のライゲーションマスターミックス25μ l を加えます。ピペッティングによって慎重に混合します。このステップは、泡を生成する傾向があります。
    注:ライゲーションマスターミックスは、3μ l の10倍ライゲーションバッファー [500 mM トリス-HCl、pH 7.5; 100 mM MgCl2] を含みます。ヌクレアーゼフリーの水の9μ l;RNase 阻害剤の0.4 μ l;0.1 M の ATP の0.3 μ l;0.8 μ l のジメチルスルホキシド (DMSO);9μ l の 50% ポリエチレングリコール (PEG) 8000;2.5 μ l の RNA リガーゼ [30 U/μ l]。
  2. 各サンプルに2.5 μ l の rna アダプター X1A (表 1) と2.5 μ l の RNA アダプター X1B (表 1) を加えます。ピペッティングまたはフリックによって慎重に混合し、25° c で75分間インキュベートし、10分ごとに混合するようにフリックします。
  3. 500μ l のコールドウォッシュバッファーでビーズを1回洗浄します (ここで IgG サンプルを再開してください)。
  4. 500μ l の冷間塩緩衝液を使用し、次いで500μ l のコールドウォッシュ緩衝液でビーズを1回洗浄します。もう一度これらの洗浄を繰り返します。
  5. 磁気的にビーズを分離し、微細なピペットチップで残留液を除去します。
  6. 再懸濁は、100μ l のコールドウォッシュバッファーにビーズを組み込みます (ここで IgG サンプルを一時停止し、洗浄バッファーに氷を保管してください)。20μ l を RWB サンプルとして新しいチューブに移動します。残りの80μ l を RRI サンプルとして磁気的に分離します。RRI サンプルの上清を取り除き、20μ l の洗浄緩衝液でビーズを再懸濁ます。
  7. 37.5 μ l の4x リチウムドデシル硫酸 (LDS) サンプルバッファーと15μ l の10x サンプル還元剤を IgG サンプルに追加します。(残りの) サンプルに、4x LDS サンプルバッファーの7.5 μ l と3μ l の10倍のサンプル還元剤を加えます。(ピペットで混合しないでください)。70° c で10分間インキュベートし、1200 rpm で振盪します。氷上で1分間冷却し、1000 x gで4° c で1分間遠心分離します。

7. SDS-ページと膜の転送

  1. ロードゲル。
    1. RRI ゲル (4-12% Bis-トリスタンパク質ゲル、10ウェル、1.5 mm) 用チューブを磁石の上に置き、ビーズから分離したタンパク質溶出液を配置します。1ウェルあたり30μ l のサンプルを積む。サンプルは、予め染色されたタンパク質サイズマーカーによって離間している。
    2. RWB ゲル (4-12% Bis-トリスタンパク質ゲル、10ウェル、1.5 mm) 用チューブを磁石の上に置き、ビーズからタンパク質溶出液を分離します。1ウェルあたりのサンプルの15μ l を荷を積む。残りのサンプルをバックアップとして-20 ° c で保存します。
  2. 500μ l の抗酸化剤を 500 mL の 1x SDS 実行バッファに加えます。50分の間、または染料の前面が下部になるまで 1x SDS で 200 V で実行します。
    注:抗酸化剤は、N、N-Dimethylformamide、バイサルファイトナトリウムを含み、これはメチオニンおよびトリプトファンのような感受性アミノ酸の再酸化を防ぐために還元タンパク質と共に移行する。
  3. 10% メタノール (vol/vol) の1xtransfer バッファーで70分間 10 V でゲルからニトロセルロース膜にタンパク質-RNA 複合体を転写します。RRI 膜を低温 PBS ですすぎ、ラップで包み、-80 ° c で保存します。
  4. TBST で 5% の牛乳で RWB 膜を1時間室温でブロックします。 TBST で膜をすすいでください。4° c で TBST の一次抗体を一晩でインキュベートします。5分間 TBST で2回洗浄します。二次抗体 (1: 5000 HRP ヤギ抗ウサギ IgG) を室温で1時間 TBST でインキュベートし、それぞれ5分、10分、15分の TBST で3回洗浄します。
  5. Electrochemiluminescence (ECL) バッファー A とバッファー B の等量を混合し、膜に添加して1分間インキュベートし、プラスチックラップで膜を覆い、室温で2-3 分間 X 線フィルムに露出させます。その後、フィルムを現像する。
    注:露出過度のフィルムは、膜の縁の形状を明確に示し、フィルムを RWB 膜に位置合わせすることができる。次いで、その中のマーカーの位置に基づいて RWB および RRI 膜を位置合わせする。下から上に向けて、フィルム、RWB 膜、RRI 膜を順に重ねて配置しています。

8. RNA の分離

  1. RWB 膜とフィルムをガイドとして、タンパク質バンドから 75 kDa (RNA の約 220 nt) まで領域をカットします。
    注:タンパク質で保護された RNA 分子としては、最大長が225塩基であり、塩基当たり約 340 Da であり、全てのタンパク質 RNA 複合体を回収するために RBP バンドの上に約 75 kDa の領域を切断するのが妥当である。
  2. 膜の摘出された部分をいくつかの小さなスライスにカットし、それらを新鮮な 1.5 mL 遠心チューブに入れます。プロテイナーゼ K (PK) バッファーの200μ l (100 mM トリス-HCl pH 7.5; 50 mM NaCl; 10 mM EDTA) を、膜片に40μ l の PK で追加します。混合し、37° c で20分間インキュベートし、1200 rpm で振盪します。
  3. 各サンプルに200μ l の PK 尿素バッファー (100 mM トリス-HCl pH 7.4; 50 mM NaCl; 10 mM EDTA; 7 M 尿素) を加えます。37° c で20分間インキュベートし、1200 rpm で振盪します。
  4. 400μ l の酸フェノール/クロロホルム/isoamyl アルコール (25:24:1) を加え、よく混ぜ、37° c で5分間インキュベートし、1200 rpm で振盪します。
  5. 遠心分離機に 2 mL 位相ロックゲル (PLG) 重管を置き、25 s の 15000 x gでスピンします。
  6. 膜スライスを除くすべての内容物を PLG の重いチューブに移します。37° c で5分間インキュベートし、1200 rpm で振盪します。
  7. 室温で、15000 x gを15分間回転させる。水性層を新しい 15 mL の円錐管に移す。
  8. Rna 精製および濃縮カラムを使用して RNA を抽出します。
    1. 各サンプルに2巻 (800 μ l) の RNA 結合緩衝液 (ステップ8.7 から) を加えて混ぜます。100% エタノールの等量 (1200 μ l) を加えて混ぜます。
    2. 750μ l のサンプル (ステップ8.8.1 から) を回収管の RNA 精製および濃縮カラムに移し、30秒間 15000 x gで遠心分離します。フロースルーを破棄します。
    3. すべてのサンプルが列を通過するまで、ステップ8.8.2 を繰り返します。400μ l の RNA 調製バッファーをカラムに添加し、30秒間 15000 x gで遠心分離します。フロースルーを廃棄し、RNA 洗浄緩衝液の700μ l を塗布し、30秒間 15000 x gでカラムを遠心分離します。フロースルーを破棄します。
    4. 400μ l の RNA 洗浄緩衝液をカラムに添加し、15000 x gで2分間遠心分離します。カラムを新しい 1.5 mL チューブに慎重に移します。カラムマトリックスに10μ l のヌクレアーゼフリーの水を加え、2分間座って、30秒間 15000 x gで遠心分離し、-80 ° c で eCLIP サンプルを RT (ステップ 11.1) まで保存します。

9. 入力 RNA 3 ' 末端の Dephosphorylation

  1. Dephosphorylation マスターミックスの15μ l を加えます (2.5 μ l dephosphorylation バッファ [100 mM トリス-HCl、pH 8.0; 50 mM MgCl2; 1 M KCl; 0.2% トリトンの X-100; 1 Mg/mL BSA); μ l の RNase インヒビター; 9.5 μ l) 〜10μ l の入力サンプル (ステップ8.8.4 から)。37° c で15分間インキュベートし、1200 rpm で振盪します。
  2. 75μ l の PNK のマスターミックス (20 μ l の PNK PH 6.5 バッファ [350 mM トリス-HCl、pH 6.5; 50 mM MgCl2]; 44 μ l のヌクレアーゼ阻害剤の1μ l を添加します。の DNase; 2 μ M、PNK 酵素を7μ l、1μ l をジチオスレイトール) 試料にする。37° c で20分間インキュベートし、1200 rpm で振盪します。
  3. 入力 RNA のクリーンアップ
    1. 再懸濁 thenucleic 酸抽出磁気 beadsin バイアル (30 秒以上の渦)。試料ごとに磁性ビーズを20μ l 抽出して新しいチューブに添加する。磁気スタンドでビーズを収集し、上清を破棄します。
    2. 1 mL の RNA 精製溶解バッファー (RLT buffer) でビーズを一度洗浄します。チューブを磁石の上に30秒間置き、上清を捨てます。
      注:その後、核酸抽出用磁性ビーズを分離し、この工程に従った。
    3. 300μ l の RLT バッファーを再懸濁ビーズをサンプルに添加します。10μ l の 5 M NaCl および615μ l の 100% エチルアルコール (Etoh 中) を添加し、ピペッティングにより混合します。室温で15分間回転させ、ビーズを磁気的に分離し、上清を除去する。
    4. 再懸濁ビーズを1ml の 75% Etoh 中、新しいチューブに移します。30秒後、磁気スタンドでビーズを集め、上清を捨てる。75% の Etoh 中で2回洗浄し、ビーズを磁気的に分離し、微細なピペットチップで残留液を廃棄します。空気は5分間乾燥します (過度の乾燥を避けてください)。
    5. 再懸濁は10μ l のヌクレアーゼフリーの水でビーズを培養し、5分間磁気的に別々のビーズでインキュベートし、5μ l の上澄みを新しいチューブに移動させる (3 ' アダプタのライゲーション下)。残りの RNA はバックアップとして-80 ° c で貯えることができる。

10. 入力 RNA 3 ' 末端への RNA アダプタのライゲーション

  1. 1.5 μ l の DMSO と0.5 μ l の RiL19 アダプター (表 1) を入力 RNA の5μ l (ステップ9.3.5 から) に加え、65° c で2分間インキュベートし、1分以上氷上に置く。各サンプルに13.5 μ l の 3 ' ライゲーションマスターミックスを追加、ピペットで混合し、25° c で75分間インキュベートし、フリックで15分ごとに混合します。
    注:ライゲーションマスターミックスには、2μ l の10個のライゲーションバッファー [500 mM トリス-HCl、pH 7.5; 100 mM MgCl2; 10 mM ジチオスレイトール] が含まれています。ヌクレアーゼフリーの水の1.5 μ l;RNase 阻害剤の0.2 μ l;0.1 M の ATP の0.2 μ l;DMSO の0.3 μ l;8μ l の 50% PEG8000;1.3 μ l の RNA リガーゼ [30 U/μ l]。
  2. ライゲーションした入力 RNA のクリーンアップ
    1. 各試料について磁気ビーズを抽出した核酸を磁気的に分離し20μ l、上清を除去する。1 mL の RLT バッファーでビーズを1回洗浄します。
    2. 再懸濁は61.6 μ l の RLT の緩衝液および移動懸濁液を各サンプルに抽出した。100% Etoh 中の61.6 μ l を加えなさい。5分ごとに磁気的に別々のビーズを15分間混合し、上清を除去するためにピペットを使用してください。
    3. ステップ9.3.4 を繰り返します。
    4. 10μ l のヌクレアーゼフリーの水でビーズを再懸濁し、それを5分間、磁気的にビーズを分離して、10μ l を新しいチューブに移す。
      注:これは停止ポイントの可能性です (入力サンプルは翌日まで-80 ° c で保存できます)。

11. 逆転写、cDNA 3 ' 末端への DNA アダプター結紮

  1. 0.5 μ l の RT プライマー (表 1) を10μ l の入力 rna (ステップ10.2.4 から) および10μ l のクリップ RNA (ステップ8.8.4 から) に加え、加熱前の PCR ブロックで2分間65° c でインキュベートし、1分以上氷上で行います。
  2. RT マスターミックスの10μ l を追加します (RT バッファの2μ l [500 mm のトリス-HCl、pH 8.3; 750 mM KCl; 30 mM MgCl2); ヌクレアーゼ非の0.3 水の4μ l; 0.1 m ジチオスレイトール; 0.2 μ l の 0.1 m dCTP; 0.2 μ l の0.1 μ l の dATP0.1 M dGTP;0.1 M dTTP の0.2 μ l;0.9 μ l の逆転写酵素) を各サンプルに混合し、予熱した PCR ブロックで55° c で45分間インキュベートします。
  3. 20μ l の RT 反応生成物を3.5 μ l の PCR 産物クリーンアップ試薬と混合します。37° c で15分間インキュベートします。
  4. 0.5 M EDTA の1μ l を添加し、ピペットで混合します。1 M NaOH の3μ l を加え、ピペットで混合し、PCR ブロック上で70° c で12分間インキュベートして、テンプレート RNA を加水分解します。
  5. 1 M HCl の3μ l を加え、ピペット-ミックスして緩衝液を中和する。
  6. CDNA のクリーンアップ
    1. 各サンプルについて磁気ビーズの核酸抽出を磁気的に分離し10μ l、上清を除去する。500μ l の RLT バッファーで1回洗浄してください。
    2. 93μ l の再懸濁ビーズを RLT バッファーと転送懸濁液をサンプルに加えた。100% Etoh 中の111.6 μ l を加え、それを5分間インキュベートし、そしてピペットは2分ごとに混合する。磁気スタンドでビーズを集め、上清を捨てる。再懸濁ビーズを1ml の 80% Etoh 中し、新しいチューブに移動します。
    3. 30秒後、磁気スタンドでビーズを集め、上清を捨てる。80% の Etoh 中で2回洗浄します。磁気的に分離し、ファインチップで残留液を廃棄します。空気は5分間乾燥します (過度の乾燥を避けてください)。再懸濁は5つの mM のトリス-HCl の5つのμ l でビーズを使用し、5分間インキュベートします。
  7. ビーズに0.8 μ l の DNA アダプター (表 1) と1μ l の DMSO を加え、75° c で2分間インキュベートします。1分以上氷の上に置きます。
  8. 調製12.8 μ l のライゲーションマスターミックス (2 μ l の10x 結紮緩衝液 [500 mM トリス-HCl; 100 mM MgCl2; 10 mM ジチオスレイトール]; 1.1 μ l の 0.2 M ATP; 9 μ l の 0.1% PEG8000; 50 μ l の RNA リガーゼ [30 U/μ l])、フリックでミックスし、遠心分離機で簡単にスピンし、各サンプルにそれを加えて、ゆっくりとピペットチップでサンプルを攪拌する。
  9. 別の1μ l の RNA リガーゼ [30 U/μ l] を各サンプルに加え、フリックして混合します。25° c で 30 s をインキュベートし、1200 rpm で振盪します。25° c で一晩インキュベートします。フリックを軽く5〜6回、1時間に1回混合する。
  10. 連結 cDNA のクリーンアップ
    1. 試料毎に磁気ビーズを抽出して5μ l の磁気的に分離し、上清を除去する。
    2. 500μ l RLT バッファーで1回洗浄します。
    3. 60μ l の再懸濁ビーズを各サンプルにビーズおよび転写懸濁液に RLT した。100% Etoh 中の60μ l を加え、それを5分間インキュベートし、ピペットで2分ごとに混合し、上澄みを捨てる。
    4. ステップ9.3.4 を繰り返します。
    5. 再懸濁ビーズを 10 mM トリス-HCl の27μ l で、それを5分間磁気的にインキュベートし、新しいチューブに25μ l のサンプルを移動させる。1μ l のライゲーション cDNA を新しいチューブで9μ l のヌクレアーゼフリーの水で希釈します。残りのサンプルは、ステップ13.1 まで-20 ° c で保管してください。

12. リアルタイム定量 PCR (qPCR) による cDNA の定量化

  1. 9μ l の qPCR マスターミックス (5 μ l の2個のマスターミックス、3.6 μ l のヌクレアーゼフリー水、0.4 μ l のプライマーミックス [10 μ m PCR-D50X および10μ m PCR-R-D70X]) を96ウェル qPCR プレートに追加します。1μ l の1:10 希釈 (H2 O) cDNA (ステップ11.10.5 から)、シール、ミックスを加えます。
  2. Thermocycler での qPCR プログラムの実行:50 ° c で2分;95° c で2分;95° c で 3 s、68° c で 30 s、40サイクルを続けます。95° c で15秒、68° c で60秒、その後に95° c で 15 s、1サイクル。Ct (サイクル閾値) 値に注意してください。

13. cDNA の PCR 増幅

  1. 35μ l の PCR マスターミックス (25 μ l の 2x PCR マスターミックス; 5 μ l のヌクレアーゼフリー水; プライマー混合物の5μ l [20 μ m PCR-F-D50X および20μ m pcr-R-D70X]) を8ウェルストリップにします。クリップグループのために、H2O のクリップサンプル + 2.5 μ l の12.5 μ l を加えなさい;入力グループの場合は、入力の10μ l + H2o の5 μ l を加えてください。よく混ぜると遠心分離機で簡単にスピン。
  2. PCR プログラムを実行してください:98 ° c で30秒;98° c で15秒、68° c で30秒、72° c で40秒、6サイクルを続けます。15 s で98° c、次いで72° c で N サイクル = (qPCR Ct 値-3)-6 の 60 s。72° c で 60 s;4° c ホールド。
    注:最初の2つのクリップに対して、1 ~ 2 個の追加 PCR サイクルを実行することをお勧めします。

14. ゲル精製

  1. サンプルを 3% 高解像度のアガロースゲルに積載します。サンプルの間に1つの空ウェルを残して、ゲルの両側にはしごを使用しています。1x トリス-ホウ酸-EDTA (TBE) バッファで75分の 100 V で実行します。
  2. 青いライトの照明の下で、各サンプルのための新しいかみそりの刃を使用して切られたゲルのスライス 175-350 bp。それらを円錐形の管の15の mL に置きなさい。
    1. ゲルスライスを計量し、ゲル抽出キットを使用してゲルを溶出します。
    2. 6倍のゲル溶解バッファーを加えてゲルを溶融させる (100 mg ゲル = 600 μ l のゲル溶解バッファー)。室温でゲルを溶解させます。(ゲルスライスが完全に溶解するまで15分ごとに混ぜます)。100% の isopropanol の1つのゲルの容積を加え、よく混ぜる。
    3. 750μ l のサンプル (ステップ14.2.2 から) を回収管のカラムに移し、17900 x gで1分間遠心分離します。フロースルーを破棄します。
    4. すべてのサンプルがカラムを通過するまでステップ14.2.3 を繰り返し、500μ l のゲル溶解バッファーで1回洗浄します。
    5. 750μ l の洗浄緩衝液 (ゲル抽出キットから) をカラムに添加し、17900 x gで1分間遠心分離し、17900 x gで2分間回転させる。カラムを新しい 1.5 mL チューブに置きます。
    6. 柱のプラスチックの紫色の縁から残りの洗浄液をすべて取り除きます。空気は2分間乾燥させ、膜の中心にヌクレアーゼフリーの水の12.5 μ l を加える。カラムを室温で2分間静置し、17900 x gで1分間スピンさせます (歩留まり改善のため、溶出工程を繰り返します)。

15. PCR 産物の TOPO クローン

  1. TOPO クローニング反応ミックス (ステップ14.2.6 からの PCR 産物の1μ l、クローニングミックスの1μ l、滅菌水の3μ l) を準備します。穏やかに混合し、20-37 ° c で5分間インキュベートします。氷の上で涼しい。
  2. 氷上で化学的に有能な大腸菌菌を解凍します。有資格細菌29の100μ l に TOPO クローニング製品の5μ l を加えます。ゆっくりとよく混ぜる。氷上で30分間インキュベートします。
  3. 42° c で 60 s のヒートショック。氷上で2分間冷却し、900μ l の lysogeny ブロス (LB) 培地を加え、37° c で1時間インキュベートし、225 rpm で振盪する。1分間 1000 x gでスピンし、900μ l の上清を取り除いてください。ソリューションの残りの部分を再懸濁します。
  4. 変換されたバクテリアを、アンピシリン (100 μ g/mL) を含む 1.5% LB 寒天プレートの上にプレートし、37° c で一晩インキュベートします。
  5. 各コンストラクトに少なくとも20個の 1.5 mL 遠心チューブを準備します。100μ g/mL のアンピシリンを含む500μ l の LB 培地を1セット満たしてください。滅菌ピペットチップを使用して、1つの細菌コロニーをランダムに剥がし、500μ l の LB 培地で (ピペッティングにより) 混合します。37° c で5時間インキュベートし、225 rpm で振盪します。
  6. CAGGAAACAGCTATGAC を使用してインサートフラグメントを配列します: サンガー法シーケンス30による。

結果

ECLIP の手順と結果を図1、図 2、図 3、図 4に示します。マウスを、手術用ハサミを用いて下腹部に二酸化炭素と小切開で安楽死させた (図 2a、B)。マウスの精巣を除去し...

ディスカッション

生物学的および病理上の文脈の両方で RBPs の普遍的な役割の理解が増すにつれて、クリップ法は RBPs20、32、33の分子機能を明らかにするために広く利用されてきた。 34、35。ここで説明するプロトコルは、マウスの精巣への eCLIP 方法の適応された適用を表す。

開示事項

作者は何も開示することはありません。

謝辞

私たちは、元のプロトコルとの有用な指導のためのエリック L ヴァン Nostrand と遺伝子 W ヨに感謝します。K.Z. は、中国の国家キー R & D プログラム (2016YFA0500902、2018YFC1003500)、および中国の国家自然科学財団 (31771653) によって支持されました。L.Y. は、中国国家自然科学財団 (81471502、31871503) と江蘇省の革新的で起業的なプログラムによって支えられました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Antibodies
Anti-mouse MOV10  antibodyProteintech, China10370-1-AP
Anti-mouse MOV10L1 antibodyZheng et al.20109polyclonal antisera UP2175provided by P. Jeremy Wang lab, University of Pennsylvania
HRP Goat Anti-Rabbit IgG ABclonalAS014
Rabbit IgGBeyotime, ChinaA7016
Equipment
CentrifugeEppendorf, Hamburg, Germany5242R
Digital sonifierBRANSON,USABBV12081048A450 Watts; 50/60 Hz
DynaMag-2 MagnetInvitrogen,USA12321D
Mini Blot ModuleInvitrogen,USAB1000
Mini Gel TankInvitrogen,USAA25977
Shaking incubatorEppendorf, Hamburg, GermanyThermomixer comfort 
Tissue Grinder, DouncePYREX, USA1234F35only  the "loose" pestle is used in this protocol
TProfessional standard 96 GradientBiometra, Germanyserial no.: 2604323
Tube Revolver Crystal, USAserial no.: 3406051
UV-light cross-linkerUVP, USACL-1000
Materials
TC-treated Culture DishCorning, USA430167100 mm 
TubesCorning, USA43079115 mL
Microtubes tubesAXYGEN , USAMCT-150-C1.5 mL 
Reagents 
Acid phenol/chloroform/isoamyl alcohol Solarbio, ChinaP101125:24:01
AffinityScript EnzymeAgilent, USA600107
AntioxidantInvitrogen,USANP0005
DH5α competent bacteriaThermo Scientific, USA18265017these economical cells yield >1 x 106 transformants/µg control DNA per 50 µL reaction.
DMSOSigma-Aldrich, USAD8418
DNA LadderInvitrogen, USA10416014
dNTPSigma-Aldrich, USADNTP100-1KT
Dynabeads Protein A Invitrogen, USA10002D
ECL reagentVazyme, ChinaE411-04
EDTAInvitrogen, USAAM9260G
EDTA free protease inhibitor cocktailRoche, USA04693132001add fresh
Exo-SAP-ITAffymetrix, USA78201PCR Product Cleanup Reagent 
FastAP enzymeThermo Scientific, USAEF0652
LDS Sample BufferThermo Scientific, USANP0007
MetaPhor Agarose lonza, Switzerland50180
MgCl2Invitrogen, USAAM9530G
MiniElute gel ExtractionQIAGEN, Germany28604column store at 4 ?; buffer QG=gel dissolving buffer; buffer PE= wash buffer(for step 14)
MyONE Silane beadsThermo Scientific, USA37002Dnucleic acids extraction magnetic beads
NaClInvitrogen,USAAM9759
 
NP-40Amresco, USAM158-500ML
NuPAGE Bis-Tris Protein GelsInvitrogen, USANP0336BOX4%–12%,1.5 mm, 15-well
NuPAGE MOPS SDS Buffer Kit Invitrogen, USANP0050
PBSGibco, USA10010023
Phase-Locked Gel (PLG) heavy tube  TIANGEN, ChinaWM5-2302831
PowerUp SYBR Green Master MixApplied Biosystems, USAA25742
Proteinase KNEB, New England P8107S
Q5 PCR master mix NEB, New England M0492L
RLT bufferQIAGEN, Germany79216RNA purification lysis buffer 
RNA Clean & Concentrator-5 columns ZYMO RESEARCH, USAR1016RNA purification and concentration columns
RNase I Invitrogen, USAAM2295
RNase InhibitorPromega, USAN251B
RQ1 DNasePromega,USAM610A
Sample Reducing AgentInvitrogen,USANP0009
SDS SolutionInvitrogen, USA1555302710%
Sodium deoxycholateSigma-Aldrich, USA30970protect from light
T4 PNK enzymeNEB, New England M0201L
T4 RNA ligase 1 high concNEB, New England M0437M
TA/Blunt-Zero Cloning MixVazyme, ChinaC601-01
TBEInvitrogen,USAAM9863
Tris-HCI BufferInvitrogen, USA15567027
Triton X-100Sangon Biotech, ChinaA600198 
Tween-20Sangon Biotech, ChinaA600560
UreaSigma-Aldrich, USAU5378
X-ray FilmsCaresteam, Canada6535876

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