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要約

このプロトコルは、ヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-CAS9を用いて定義されたヘテロ接合性またはホモ接合ヌクレオチド変化の生成を容易にする方法を提供する。

要約

ヒト多能性幹細胞は、遺伝子機能を研究し、疾患に関連する特定の変異をモデル化するための強力なシステムを提供します。正確なヘテロジゴウス遺伝子改変の生成は、CRISPR-CAS9が第2対立遺伝子のインデル形成を媒介しているため困難である。ここでは、1 つだけが目的のシーケンス変更を表現する 2 つの修復テンプレートを使用して、この問題を克服するためのプロトコルを示しますが、両方のテンプレートには、再切断とインデル形成を防ぐためのサイレント変異が含まれています。この方法論は、DNAの遺伝子編集コード領域がヒト疾患および生物学を研究するための等元制御および変異ヒト幹細胞株を生成するのに最も有利である。さらに、遺伝子編集実験の労力とコストを削減するために、トランスフェクションおよびスクリーニング方法論の最適化が行われている。全体として、このプロトコルは、ヒト多能性幹細胞モデルを利用した多くのゲノム編集プロジェクトに広く適用可能である。

概要

ヒト胚性幹細胞(HESC)および誘導多能性幹細胞(iPSC)は、異なる系統の細胞型を生成する能力を維持しながら、更新能力のためにヒト疾患をモデル化するための貴重なツールである1,2 、3、4.これらのモデルは、遺伝子機能を調知する可能性を開き、特定の変異および文言型が様々な疾患5,6にどのように関連しているかを理解する。しかしながら、特定の変化が特定の表現型にどのように連結されるかを理解するためには、対同原性制御および変異細胞株の使用は、線対線変動性7、8を制御するために重要である。転写活性化剤様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)および亜鉛フィンガーヌクレアーゼは、原発細胞を含む多様な遺伝モデルにおける挿入または欠失(インデル)変異を生成するために使用されてきた。しかし、これらのヌクレアーゼは、使用し、高価な9、10、11、12、13、14を使用するのが面倒なことができます。クラスター化された定期的に間隔をあけた短いパリンドロミックリピート(CRISPR)-CAS9ヌクレアーゼの発見は、ゲノムの事実上あらゆる領域におけるインデル形成の効率、使用の簡素化、およびコストの削減により、フィールドに革命を起こしました15,16歳,17歳,18歳,19.

CRISPR-CAS9ベースのゲノム編集技術を用いる上での課題は、第2対立遺伝子20にインデル変異を作成することなく、1つの対立遺伝子における特定の突然変異の生成または補正であった。このプロトコルの主な目標は、2本鎖オリゴヌクレオチド(ssODN)修復テンプレートを使用して、第2対立遺伝子のインデル形成を減少させるために、この課題を克服することです。両方のssODNは、CAS9ヌクレアーゼによる再切断を防ぐために無声突然変異を含むように設計されていますが、目的の変化が含まれているのは1つだけです。この方法は、第2対立遺伝子におけるインデル形成を誘導することなく、特定のヘテロザイゴウス遺伝子改変を生成する効率を高める。このプロトコルを用いて、6つの独立したゲノム位置における遺伝子編集実験は、第2対立遺伝子におけるインデル形成なしで1つの対立遺伝子における所望のゲノム変化の正確な導入を実証し、〜10%の全体的な効率で起こる。記載されたプロトコルは、Maguireらら21から適応されている。

プロトコル

1. ガイドRNA(gRNA)の設計・施工

注:各gRNAは、100 bpの二本鎖(ds)オリゴヌクレオチド(図1A-C)を生成するためにアニールされた2つの60塩基対(bp)オリゴヌクレオチドで構成されています。gRNAの設計、生成、試験の効率は約2週間です(図2)。

  1. ゲノム編集対象のDNA領域を選択し、フォーマットに適合する3-4 23 bp配列を同定し、5'-G(N 19)NGG-3'を同定する。これらのシーケンスは、対象地域の 20 bp 以内に配置する必要があります。
    注:ターゲティングは、センスまたはアンチセンスストランドで実行することができます。
  2. CRISPOR(http://crispor.tefor.net)などのリソースを使用して、ゲノムの冗長性とオフターゲット確率のgRNA配列を評価します。
  3. 20 bpターゲット配列(プロトスペーサー隣接モチーフまたはPAMを除く)を2つの60merオリゴヌクレオチドに組み込みます(シーケンスは5'~3'、赤と緑は図1Cに示すように逆補数です)。
  4. 選択したベンダーから2つの60 bpオリゴヌクレオチドを注文します。オリゴヌクレオチドを受け取ったら、それぞれをddH2Oで100μMの最終濃度に再中断し、10μMの作業ストックを作ります。
  5. 2つのオリゴヌクレオチドをアニールし、DNAポリメラーゼ(材料の表)を使用して100 bp dsDNA断片を生成する。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)ストリップチューブで10μM前方オリゴヌクレオチドの5μLと10μM逆オリゴヌクレオチドの5μLを組み合わせ、95°Cで5分間インキュベートし、室温(RT)で10分間反応を冷却します。
  6. 表 1に説明するように PCR をセットアップします。表 2で概説したパラメータを使用して、サーマル サイクラーで PCR 増幅を実行します。
  7. 1.5%(w/v)エチジウム臭化(EtBr)のアガロースゲルエレクトロフォアでPCR製品を可視化し、80-100Vで40分間、100bp帯(図3A)を切除し、LEDライトボックス上で可視化し、カミソリブレードを用いてゲルを使用して精製する。抽出キット(材料の表)。

2. スクリーニング用PCRプライマーの設計

  1. 目的の遺伝子の400-500 bp領域を増幅するように特別に設計された前方および逆PCRプライマーを用いて編集されたDNAのスクリーニングを行う(表2)。任意の対照iPSCラインから単離されたDNAを使用して、スクリーニングPCRを実行する際にクリーンアンプリコンを確認します。
  2. 1時間80-100Vで電気泳動後1.5%(w/v)ゲルでPCR製品を可視化します。
    注: 編集されたクローンのシーケンスは、スクリーニングプライマー・セットの確認後に設計されたネストされたプライマーを使用して実行されます。サンプルは、シーケンス用の商用ソースに送信されます。

3. gRNA_クローニングベクタープラスミドの調製

  1. クローニングベクターを線形化するには、1.5 mL遠心管を取り、gRNA_クローニングベクターのDNAの1-5 μgを加え、AflII制限酵素バッファーの4μLとAflII制限酵素の1.5 μLを加えます。ddH2Oの24 μLに反応を持ち上げる. 上下にピペッティングして反応を混合します。一晩37°C(O/N)でインキュベートします。
  2. 1%のアガロースゲルを1時間80-100Vで、物品バンド(予想バンドサイズは〜3519 bp)。
  3. ステップ1.6のように抽出し、精製します。

4. gRNAベクターの組み立て

  1. 反応を設定し、表3に記載されているように、AflII消化gRNAクローニングベクターの1:5比で組み立てキット(材料の表)を用いてDNA断片を組み立てます。
  2. 50°Cで反応を15分間インキュベートし、ddH2Oで反応を1:3に希釈し、メーカーの指示に従って3μLを使用して細菌変換を行います(材料の表)。カナマイシンLB/寒天プレート上のプレート細胞。
  3. gRNAあたり3-5コロニーを選びます。各コロニーをLBの4mLで接種し、軌道揺れインキュベーターで37°CでO/Nを成長させる。
  4. ミニプレッププラスミド単離キットを使用してプラスミドDNAを精製し、以下のプライマーを使用して各gRNAを配列してクローニングを成功させました: フォワード: GTACAAAAAAAAGGAGGCTAAGGAAGGAAGGAAGGAAGG;リバース: TGCCAACTTTAGAAAGCT.

5. gRNA切断効率のテスト

  1. 前述の21を用いた6ウェルプレートに照射されたマウス胚線維芽細胞(MEF)上のプレートhESC。細胞が70-80%の合流に達したら、表4に概説されたトランスフェクションマスターミックスを準備する。
  2. ピペッティングで混合し、RTで15分間インキュベートし、細胞にドロップワイズを追加し、37 °Cで48時間(24時間後にメディアが変化する)でインキュベートします。
  3. 48時間後に選別するための細胞を収穫する。
    1. 3分RTインキュベーションでMEFを酵素的に取り除きます。
    2. hESC培地(表5)で細胞を1xをすすいで、hESC培地+10μM Y-27632二塩化物(材料表)に削り取る。
    3. ペレット細胞を3分間3分間300xgで再濁させ、hESC培地+10 μM Y-27632二塩酸塩の0.5mLで再中断する。
    4. 35 μmのセルストレーナーキャップを通して5 mLチューブにフィルターを入れます。
  4. 蛍光活性化細胞選別(FACS)を用いて、生細胞上にゲートを付け、緑色蛍光タンパク質(GFP)陽性細胞をソートする。
  5. 最大1.5×104個分の細胞を10cm2皿に直接移し、Y-27632ジヒドロ塩化物を含むhESC培地(表5)に1:3基基膜マトリックス(材料表)を塗製した。
  6. Y-27632二塩酸塩を使用せずにhESC培地(表5)を使用して毎日培地を変更し、コロニーが直径が約1mmの場合、10-15日後に手動でクローンを選びます。
    1. P200ピペットと顕微鏡を使用して、慎重に単一のクローンを掻き取り、ピペットに細胞を引き込みます。
    2. コロニーで描かれた培地に96ウェルプレートに3〜4倍を穏やかに配管して細胞を分散させる。
    3. スクリーニング用のPCRストリップチューブに分配し、10,000 x gで細胞を5分間遠心分離してペレットし、gRNA当たり20個のコロニーを選びます。

6. クローンスクリーニング

  1. 細胞ペレットを20μLのプロテアーゼKバッファー(表5)(55°Cで1時間、95°Cで10分)で細胞ペレットをインキュベートし、渦を強く分離する。10,000 x gで5分間遠心分離機を採取し、上清を回収する。
  2. 目的領域を増幅するように設計されたプライマーと、プロテアーナーゼKダイジェストの5μLを含むマスターミックスを用いて、総体積20μLでPCR(セクション2)のスクリーニングを行う。対照として遺伝子編集した細胞株から分離したゲノムDNAを用いる。
  3. 2.5%(w/v)のアガロースゲル(図3B,C)で70-90Vで1時間電気泳動後のPCR産物のサイズ変化を評価する。任意のサイズの違いは、切断を示しています。

7. 一本鎖オリゴDNA(sSODN)を用いて多能性幹細胞で正確なゲノム編集

  1. 最も効率的なgRNA配列を中心とした100 bp ssODNを設計し、最高の切断効率を実現します。
  2. gRNA配列にサイレント変異を導入することにより、再結合されたODNの再切断を防ぎます。PAM 配列の単一のサイレント変異で十分ですが、不可能な場合は 3~ 4 のサイレント変異が機能します。
    注:標的クローンのスクリーニングを容易にするために、gRNA配列の約20bp以内の制限部位の導入が理想的である。
  3. 目的の基本変更を使用して 1 つの ODN を設計し、基本変更なしで関心の突然変異を作成し、1 つの ODN を作成します。
    注: これらの変更は、組み換えがより遠い距離でかなり低下するので、予測された CRISPR/CAS9 カット サイトから約 20 bp 以下にする必要があります。
  4. 選択したベンダーから2つのsSODNを注文し、1 μg/μLの株式を作るために水で再中断します。-20 °Cで在庫を保管してください。

8. トランスフェクションのセットアップ

  1. ssODNとCRISPR-CAS9プラスミドをトランスフェクトするには、照射されたMEFの6ウェル皿にターゲット細胞株をプレート化し、O/Nインキュベーション後に70-80%の合流性に達する。
  2. 表6に記載されているようにトランスフェクション反応を設定する。ピペッティングで反応を混合し、RTで15分間インキュベートします。
  3. 48h後、セクション5.3に記載されているように細胞ソート用の細胞を調合する。
  4. 200 μLピペットを使用して単一細胞をめっきした後、コロニー~10日後に選びます。100 μLの細胞を、以前にゼラチンで被覆した24または48ウェルプレートの1つのウェルに、Y-27632二塩酸塩を用いたhESC培地で照射したMEFを移す。セクション6で説明するように、残りの100 μLをDNA単離に使用します。

9. 単一コロニーにおける変異のチェック

  1. ssODNの正常な統合を確認するには、セクション2で設計されたスクリーニングプライマーを使用してPCRを実行するために、各コロニーから単離されたDNAの5 μLを取ります。PCR製品(材料表)を精製し、ssODNで作成された独自の酵素部位を用いて制限酵素消化を調製します。
    注:この消化には、制限酵素バッファーと40 μLの体積における制限酵素のメーカー推奨濃度も含まれます。
  2. ピペッティングで反応を混合し、1-3 hのメーカーの推奨温度でインキュベートします。
  3. 消化されたPCR製品を1.5%(w/v)EtBrアガロースゲル電気泳動で40分間80-100Vで可視化します。ssODN の統合が正常に行われた場合は、ネストされたプライマーを使用して特定の突然変異を配列します。

結果

gRNAの生成とインデルのスクリーニング

各gRNAをプラスミドベクターにクローニングし、U6プロモーターを用いて発現する。AflII制限酵素は、プラスミド(#41824アジーン)を線形化するために使用され、U6プロモーターの後に位置する。2つの60bpオリゴをアニーリングした後に生成された100bpバンドは、DNAアセンブリを用いてgRNA発現ベクターにクローニングさ...

ディスカッション

このプロトコルでは、CRISPR-CAS9と2つのssODN修復テンプレートを使用して、ヒト多能性幹細胞において特定のヘテロ接合性またはホモ接合ゲノム変化を生成することが実証されている。この方法により、10%に近い効率でヘテロ接合ゲノム変化を発現する等元細胞株の生成に成功した。このプロトコルは、細胞選別後に低密度で細胞を培養した後の細胞増殖と生存をサポートする照射MEF上で成長?...

開示事項

著者は何も開示していない。

謝辞

この研究は、国立心臓・肺・血液研究所(NHLBI)、国立衛生研究所(助成金U01HL099656(P.G.およびD.L.F.)およびU01HL134696(P.G.およびD.L.F.)からの資金提供によって支援されました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
5-ml polystyrene round-bottom tube with cell-strainer capCorning352235
6-well polystyrene tissue culture dishesCorning353046
AflII restriction endonucleaseNew England BiolabsR0520
AgaroseVWRN605
DMEM/F12 mediumThermoFisher11320033
dNTPsRoche11969064001
Fluorescence-activated cell sorter (FACS) apparatus
Gel extraction kitMacherey-Nagel740609
Gibson Assembly KitNew England BiolabsE2611
gRNA_Cloning VectorAddgene41824
LB agar plates containing 50 μg/ml kanamycin
Lipofectamine Stem ReagentThermoFisher(STEM00001)
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR)Corning354230
Murine embryonic fibroblasts (MEFs)
Nucleospin Gel Extraction and PCR Clean-up KitMacherey-Nagel740609
Orbital shaking incubator
pCas9_GFP vectorAddgene44719
PCR strip tubesUSA Scientific1402-2900
Phusion High Fidelity DNA Polymerase and 5× Phusion bufferNew England BiolabsM0530
PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep KitInvitrogenK210011
Proteinase KQiagenQiagen 19133
StellarTM electrocompetent Escherichia coli cellsTakara636763
SOC mediumNew England BiolabsB9020S
TrypLE Express EnzymeThermoFisher12605036
Y-27632 dihydrochloride/ROCK inhibitor (ROCKi)Tocris1254

参考文献

  1. Srivastava, D., Dewitt, N. Review In Vivo Cellular Reprogramming: The Next Generation. Cell. 166 (6), 1386-1396 (2016).
  2. Clevers, H. Review Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  3. Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of Embryonic Stem Cells to Relevant Populations: Lessons from Embryonic Development. Cell. 132 (4), 661-680 (2008).
  4. Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), 1-6 (2018).
  5. Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (3), 170-182 (2016).
  6. Tiyaboonchai, A., et al. GATA6 Plays an Important Role in the Induction of Human Definitive Endoderm, Development of the Pancreas, and Functionality of Pancreatic β Cells. Stem Cell Reports. 8 (3), 589-604 (2017).
  7. Guo, M., et al. Using hESCs to Probe the Interaction of the Diabetes-Associated Genes CDKAL1 and MT1E. Cell Reports. 19 (8), 1512-1521 (2017).
  8. Zeng, H., et al. An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery. Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).
  9. Wang, Y., et al. Genome editing of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells with zinc finger nucleases for cellular imaging. Circulation Research. 111, 1494-1503 (2012).
  10. Xue, H., Wu, J., Li, S., Rao, M. S., Liu, Y. Genetic Modification in Human Pluripotent Stem Cells by Homologous Recombination and CRISPR/Cas9 System. Methods in Molecular Biology. 1307, 173-190 (2014).
  11. Huang, X., et al. Production of gene-corrected adult beta globin protein in human erythrocytes differentiated from patient iPSCs after genome editing of the sickle point mutation. Stem Cells. 33 (5), 1470-1479 (2015).
  12. Wang, X., et al. Unbiased detection of off-target cleavage by CRISPR-Cas9 and TALENs using integrase-defective lentiviral vectors. Nature Biotechnology. 33 (2), 175-178 (2015).
  13. Sim, X., Cardenas-Diaz, F. L., French, D. L., Gadue, P. A Doxycycline-Inducible System for Genetic Correction of iPSC Disease Models. Methods in Molecular Biology. 1353, 13-23 (2015).
  14. Hockemeyer, D., Jaenisch, R. Review Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing. Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).
  15. Byrne, S. M., Mali, P., Church, G. M. Genome editing in human stem cells. Methods in Enzymology. 546, 119-138 (2014).
  16. Zhu, Z., González, F., Huangfu, D. The iCRISPR platform for rapid genome editing in human pluripotent stem cells. Methods in Enzymology. 546, 215-250 (2014).
  17. Hou, Z., et al. Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15644-15649 (2013).
  18. Cong, L., Zhang, F. Genome engineering using CRISPR-Cas9 system. Methods in Molecular Biology. 1239, 197-217 (2015).
  19. Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nature Methods. 10 (10), 957-963 (2013).
  20. Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).
  21. Maguire, J. A., Cardenas-Diaz, F. L., Gadue, P., French, D. L. Highly efficient crispr cas9-mediated genome editing in human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 64 (2019).

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