早期変形性関節症の検出に対する原子間力顕微鏡の応用

要約

原子間力顕微鏡(AFM)を用いて関節軟骨における細胞レベルにおける変形性関節症の初期変化を調べる方法を紹介する。

要約

細胞や組織の生体力学的性質は、その形状や機能を調節するだけでなく、その活力を維持するためにも重要です。弾力性の変化は、癌や変形性関節症(OA)のような主要な疾患の発症を伝播または引き起こす可能性があります。原子間力顕微鏡(AFM)は、ピコニュートンと同じくらい小さい範囲からマイクロニュートンまでの範囲で、特定の生物学的標的構造の生体力学的特性を定量的かつ定量的に特徴付ける強力なツールとして登場しました。生体力学的特性は、高レベルの緊張を受ける筋骨格組織において特別に重要である。軟骨の変性疾患としてのOAは、細胞外マトリックス(ECM)に埋め込まれた軟骨細胞の細胞内マトリックス(PCM)の破壊および空間的再配置をもたらす。PCMおよびECMの破壊は軟骨の生体力学的特性の変化と関連している。本研究では、軟骨細胞の特定の空間パターン変化に関連して、これらの変化を定量化するためにAFMを用いた。各パターン変化に伴い、PCMとECMの両方に対して、弾力性の有意な変化が観察された。局所弾性を測定することで、OAにおける局所組織変性の程度について直接的な結論を導き出すことができます。

概要

関節軟骨は血管、神経組織である。まばらに散在した軟骨細胞は、それらが埋め込まれている広大な細胞外マトリックス(ECM)を産生し、組織し、維持する。ECMの明確で特殊な部分として、軟骨細胞は、細胞周囲マトリックス(PCM)として知られている特殊なマトリックスの薄い層に囲まれています。PCM は、軟骨細胞²を保護し、その生合成応答³を調節するメカノイセン症セルマトリックス インターフェース¹として機能します。先に説明した^4、健康軟骨において、軟骨細胞は、各組織層および関節^44、55に特異的であり、関節特異的な機械的負荷機構⁶に依存する特定の、明確な空間パターンに配置される。これらのパターンは、健康な軟骨のペアと文字列から変形性関節症(OA)の発症を伴う二重弦に変化する。この疾患のさらなる進行に伴い、軟骨細胞は小さなクラスターを形成し、高度なOAでは大きなクラスターに徐々に大きなクラスターのサイズが増加する。組織構造の完全な損失とアポトーシスの誘導は、エンドステージOAで観察されます。これにより、軟骨細胞配列は、OA進行⁴の画像ベースバイオマーカーとして使用することができる。

細胞や組織の生体力学的性質は、その形状や機能を調節するだけでなく、その活力を維持するためにも重要です。弾力性の変化は、癌やOAのような主要な疾患の発症を伝播または引き起こす可能性があります。原子間力顕微鏡(AFM)は、ピコニュートンからミクロニュートンまで、幅広い力を測定する、特定の生物学的標的構造の生体力学的特性を定量的に定性的に特徴付ける強力なツールとして登場しました。AFMの主な応用は、サブナノメートルの分解能⁷でサンプルの表面地形と機械的特性を測定することです。測定装置は3つの主要な部品から成っている:1)AFMプローブは、片持ち面に取り付けられた鋭い先端であり、サンプルの表面との直接の相互作用に使用される。カンチレバーに力が加えられると、後者の変形は、測定された組織の特性に従って起こる。2)レーザービームをカンチレバーに投影し、検出器に反射する光学系。3)カンチレバーから偏向した光をキャッチするフォトダイオード検出器。カンチレバーによるレーザー偏向に関する受信情報を、解析可能な力曲線に変換します。

したがって、AFMの主な原理は、AFMプローブとサンプルの標的構造との間で作用する力の検出である。得られた力曲線は、弾性、電荷分布、磁化、降伏応力、弾性塑性変形力学⁸のようなサンプル表面上のターゲット構造の機械的特性を表す。AFMの他のイメージング技術に対する重要な利点は、AFMが、組織を損傷することなく、ネイティブ状態の培地または組織の生きた細胞の機械的特性を測定するために使用できることです。AFMは液体か乾燥した条件の両方で作動できる。サンプル準備の要件はありません。AFMは、標本を画像化し、生理学的条件に近い標本で同時にその機械的特性を測定する可能性を提供します。本研究では、ネイティブ関節軟骨におけるPCMおよびECMの弾性を測定することによってOAの進行を評価するための新しいアプローチを説明する。軟骨細胞の空間組織と局所組織変性の程度の相関は、OAの早期発見のための全く新しい視点を提供する。しかし、これらのパターンの機能的関連性は、今のところ評価されていません。関節軟骨の主要な機能は低摩擦での耐荷重であるため、組織は弾性特性を有する必要があります。AFMは、ECMの弾力性だけでなく、PCMに埋め込まれた空間セルラーパターンの測定も可能にします。軟骨細胞の空間パターン変化との弾力性の観察された相関関係は非常に強く、弾力性を測定するだけで局所組織変性の成層を可能にする可能性があります。

PCMとECMの弾性率は、軟骨サンプルの同時可視化を可能にする反転相コントラスト顕微鏡に統合されたAFMシステムを使用して、35μm薄いセクションで評価しました。このプロトコルは、我々の研究室⁹から既に発表された研究に基づいており、具体的には、軟骨細胞の空間的配置を特徴付ける方法と、それらの関連するPCMおよびECMの弾力性を測定する方法を記述する。軟骨細胞のパターン変化のたびに、PCMとECMの両方に対しても大きな弾力性の変化が観察され、この技術を使用して軟骨の変性の段階を直接測定することができます。

この検証されたアプローチは、巨視組織の分解が実際に現れ始める前に、初期段階でOAの進行と治療効果を評価する新しい方法を開きます。AFM測定を一貫して行うことは困難なプロセスです。以下のプロトコルでは、AFMによって測定されるサンプルを調製する方法、カンチレバーの調製から始まる実際のAFM測定を行う方法、AFMを較正する方法、および測定を行う方法について説明する。ステップバイステップの手順は、信頼性の高いデータを取得し、それを処理し、解釈するための基本的な戦略を提供するための明確で簡潔なアプローチを提供します。また、この厳格な方法の最も一般的な落とし穴についても説明し、トラブルシューティングのヒントも紹介します。

プロトコル

ヒト軟骨サンプルは、ドイツの火ビンゲン大学病院整形外科部門と、ドイツのロッテンブルク病院で膝の末期OAに対して全膝関節形成術を受けている患者から得られた。研究開始前に、部門、機関、および地方の倫理委員会の完全な承認を得ました (プロジェクト番号 674/2016BO2).インフォームド・コンセントは、参加前にすべての患者から受け取られました。方法は、承認されたガイドラインに従って行った。

1. サンプル準備

1. クライオトーム切片付けのための軟骨の準備
   1. 膝関節の変性変化を評価するために、患者からの組織切除後の大腿骨顆の荷重帯から得られた関節軟骨サンプルを採取する。
      注:調査対象のサンプルには、内側と外側の表面に対する組織の配向を明確に識別できるように、少なくとも軟骨下骨の薄い層が含まれている必要があり、したがって、最上位の軟骨層の標準化された組織収穫も可能にする。軟骨は、手術後24時間までAFM測定に使用することができる。この組織は、使用前に2%(v/v)ペニシリンストレプトマイシンおよび1.2%(v/v)アンホテリシンBを有する無血清無換えのダルベックコの修飾イーグル培地(DMEM)に保存することができる。しかし、24時間以上サンプルを保存すると、組織の腫れによるAFM測定でアーティファクトが発生する可能性があります。
   2. メスの助けを借りて軟骨下骨から全体として関節軟骨を切断し、その後、クライオトーム装置で低温下で凍結する凍結用ノブに水溶性埋め込み培地に軟骨サンプルを埋め込みます。
      注:凍結培地は、それが包む組織を安定させる。また、埋め込み培地と共に軟骨サンプルの凍結をもたらす。骨から軟骨を切断する場合は、組織の向きを追跡します。凍結節のために埋め込まれた組織は、軟骨の最上層(すなわち、関節面)が刃に向かうような方法で配置されなければならない。なお、組織は埋め込み培地で完全に覆われね。
2. 軟骨のクライオトーム切片
   1. 標準的なクライオトームを使用して、凍結水溶性埋め込み培地に埋め込まれている関節軟骨の最上層(すなわち、関節面)から厚さ35μmの組織を切り離す。
      注:合計で、最大300 μm(約9つのセクションに相当)を切り分け、解析に使用することができます。提案された300μmの限界は、関節軟骨のようなヒアリン軟骨の蛍光顕微鏡法で通常得ることができる視覚浸透深度に対応する。これにより、主要な局所空間パターンに従って軟骨を並べ替え、次いで対応するセクションでこれらのパターンを測定することができる。
   2. ガラススライド上のセクションを収集し、水溶性埋め込み培地を除去するためにリン酸緩衝生理食塩水(PBS)でセクション3xをすすいでください。
3. AFM互換ペトリ皿への軟骨切片の接着
   注: AFM はサンプル上の機械的なインデントによってデータを収集するため、正確な測定を可能にするためにセクションを固定する必要があります。
   1. 35 μmの厚いセクションを、AFMデバイスと互換性のある組織培養皿に生体適合性サンプル接着剤でそっと接着します。これを行うには、接着剤の2〜3滴を取り、セクションの端が終わる場所で組織培養皿の上に置きます。今、接着剤の上に軟骨セクションを置き、それがティッシュ培養皿の表面にしっかりと固執することを可能にします。
      注:ヒヤリン関節軟骨の厚さ35μmの部分は、カーリングを起こしやすいものではありません。ただし、バッファー媒体からサンプルを取り除く際にカーリングが発生する場合は、できるだけ少ない液体がサンプルに付着するようにしてください。余分な水が乾燥するとすぐに、細胞培養皿の表面に固定されるように、接着剤の分散されたスポットに組織を直接広げる。接着剤は、薄いレイヤーで、サンプルの端にのみ適用され、セクション全体には適用されません。接着領域から遠い部分のみを測定して、測定に干渉する接着剤の可能性を排除します。
   2. 接着剤と組織が適切に接着できるように、室温(RT)で2分間切片をインキュベートします。その後、L-グルタミンなしで、完全に水没するように重炭酸ナトリウムなしでライボヴィッツのL-15培地でセクションをカバー.
      注:固定中または不十分な接着剤の塗布中にサンプルの突然の動きは、組織が培養皿から剥離する結果となる一般的な間違いです。さらに、ライボウィッツ媒体を適用することは、媒体によって作成された「波」のために表面からサンプルを取り外さないように、穏やかな方法で行われるべきです。
   3. 測定が行われるまで、標準的な細胞培養インキュベーターに接着されたセクションを含むペトリ皿を37°Cに置きます。
      注:各ステップをゆっくりと行うことによって、組織切片が安定しており、組織培養皿の表面から切り離さないようにしてください。

2. カンチレバー調製 (微小球を接着)

1. AFM デバイスの準備と微小球の希釈
   1. 空気測定用に指定したガラスブロックに片持ち面を置き、スプリングで固定し、AFMヘッドにガラスブロックを取り付ける。
   2. マイクロスフィアを100%エタノール(100個の粒子/10 μL)で希釈し、超音波処理を10秒にして、微小球が分離して凝集しないようにします。
2. 接着のためのセットアップの準備
   1. 70%エタノールでガラススライドをクリーニングし、AFMデバイスのサンプルホルダーに取り付けます。
      注: スライドのクレンジングにより、接着プロセスを妨げる塵の斑点がスライドの表面に蓄積するのを防ぐことができます。
   2. スライドの中央にマイクロスフィア懸濁液の2μLを、マイクロスフィアサスペンションの近くに2μLの接着剤を配置します。
      注: マイクロスフィアのサスペンションと接着剤を互いに近くに置くと、接着剤と微小球の間で片持ち面をすばやく移行できるようにすることをお勧めします。カンチレバーを接着剤に浸漬して微小球と接触させる間の遷移が長すぎると、接着剤は最終的に硬化し、接着特性を失います。
   3. エタノール液体をマイクロスフィア懸濁液中で空気乾燥させ、マイクロスフィアを所定の位置に残します。
3. カンチレバー先端の微小球を接着する
   1. チップが接着剤で覆われるまで、ステッパーモーターの助けを借りて、片持ちレバーを手動で接着剤に浸します。接着剤が速く乾燥するので、このステップを迅速に実行します。
   2. 片持ち片持ちを再び100 μm引き込み、マイクロスフィアに向かって移動し、片持ちの先端を単一のマイクロスフィアの真上に配置します。
   3. 力分光法測定を実行して、選択したミクロスフィアにカンチレバーの先端を浸し、表1に示すパラメータを使用します。
      注: このステップを実行すると、マイクロスフィアの表面の測定を使用して、片持ち面の先端と微小球との接触を確立します。表1に示す比較的長い接触時間により、接着剤と微小球との間の十分な接合時間が可能となる。この工程で得られた力距離曲線は、カンチレバー先端に微小球を接着する副産物として生成され、さらなる分析のために処理されない。
   4. ミクロスフェアを片持ちに取り付けたら、片持ち面を上部に取り付けたガラスブロックを引き込み、顕微鏡からAFMヘッドを取り外します。最後に、AFMヘッドからガラスブロックと片持ち面を取り外します。
   5. 65°Cでカンチレバーを2時間インキュベートし、測定を開始する前にRTで一晩乾燥させます。
      注:カンチレバーのインキュベーションは接着剤の接着特性を高め、カンチレバーマイクロスフィア複合体をより安定にします。

3. 測定用のAFMデバイスの準備

1. 上面が AFM ホルダーに対して平行になるように、AFM ホルダーの液体環境で測定するために指定されたガラス ブロックを調整します。
2. ピンセットの助けを借りて、慎重に、マイクロスフィアとAFM先端が研磨された光学平面の上に突き出るように、ガラスブロックの表面に選択した片持ち体を取り付けます。
   注:カンチレバーの先端は、AFMのレーザーを光検出器に反射させるために、磨かれた平面の上に突き出る必要があります。ガラスブロックの研磨光学表面を傷つけないように、AFM上に片持ちレバーを置く際には非常に注意してください。ガラスブロックを傷つけると、レーザーの位置合わせの調整が困難になり、その後の測定に支障をきたす場合があります。
3. カンチレバーは機械的圧力の影響を受けるため、所定の位置に固定する必要があります。金属スプリングをブロックの溝にスライドさせ、ピンセットの助けを借りて、スプリングで片持ちの上部をクランプすることによって、ガラスブロックの片持ち面を安定させる。
4. ガラスブロックをAFMヘッドに慎重に置き、統合されたロック機構で固定します。ばねが左側に向いているため、片持ちレバーが正しい方向に配置されるようにします。次に、AFMデバイスに片持ち器を取り付けてAFMヘッドを取り付けます。

4. カンチレバーのサンプルとキャリブレーションのロード

注:ここでは、デバイスのキャリブレーションは、サンプル組織なしでライボヴィッツの媒体で満たされたペトリ皿のきれいな表面に力曲線を実行することによって実行されます。キャリブレーションは、試料を含まないAFM培地のみを充填した別の制御AFMディッシュを用いて行うこともできます。

1. AFM デバイスへのサンプルの取り付け
   1. ステップ1.3.3で用意したペトリ皿をAFMサンプルホルダーに置きます。
   2. ペトリ皿ヒーターをオンにし、37 °Cに設定します。組織培養皿が最適な温度(すなわち、20分)に達することを許可する。
   3. AFMヘッド内の媒体の凝縮を避けるために、片持ち体アセンブリのベースに保護ホイルを置きます。
2. デバイスのキャリブレーション
   1. ソフトウェア (材料表) を開き、レーザー位置合わせウィンドウ、およびアプローチパラメータ設定を示すウィンドウを開きます。次に、ステッパーモーター、レーザー光、CCDカメラをオンにします。
   2. 顕微鏡のCCDカメラを使用して、カンチレバーを可視化して識別します。ステッパーモータ機能を使用して、カンチレバーが媒体に完全に沈むまで100 μmのステップでカンチレバーを下げます。
      メモ:液体中のカンチレバーの沈み込みは、CCDカメラを介して視覚的に識別可能です。水面を壊すと、片持ち線先端は水中で簡単に目立つ円形の反射を作り出します。
   3. 調整ねじを使用して、片持ちレバーの上にレーザーを向けます。
      注: ネジはレーザーアライメント機構を損傷するので、ねじを巻き戻しません。カンチレバーは下から見て、レーザービームは上から来る。
   4. レーザーがカンチレバーに配置されたら、反射されたビームが光検出器の中心に落ちるように、AFMデバイスのネジの助けを借りてレーザービームを調整します。レーザーアライメント機能を使用して、レーザー光の位置を監視し続けます。
      メモ:検出器は、カンチレバーで反射したレーザービームの偏向を拾い上げ、電気信号に変換します。
   5. レーザー片持ち面調整の後、Sum信号は1V以上である必要があり、横方向および垂直偏向は0に近くなければなりません。これらの値が得られない場合は、光検出器を調整します。
3. 較正力曲線の取得
   1. 測定を開始するためにAFM皿の表面に到達するために、表2に示したアプローチパラメータを使用してスキャナアプローチを実行します。組織培養皿の底部に達したら、片持ち面を100μm引き込みます。
      注:この時点で、プローブはティッシュ培養皿の底からちょうど100 μm上にあります。
   2. RUNパラメータを設定し、表 3に表示されるパラメータを調整します。[RUN]ボタンをクリックして測定を開始し、キャリブレーション力距離曲線を取得します。
      注: ここで得られる力曲線を図 1に示します。
   3. キャリブレーション力距離曲線で、ソフトウェア内のリニアフィットの領域を選択します。
      メモ:直線フィットは、カンチレバーの感度を測定するために行われます。線形フィットが配置されると、値はソフトウェアによって保存されます。ばね定数測定またはカンチレバーの熱ノイズは、その後ソフトウェアによって計算されます。
   4. 測定は37°Cの温度で媒体で行われるように、できるだけ密接に生理的条件を模倣するようにソフトウェアの37°Cに温度変数を設定します。
      注: キャリブレーションの終了までに、垂直偏向が保存され、フォトダイオード検出器による元の登録の単位であるボルト(V)ではなく、力の単位であるニュートン(N)に表示されます。

5. AFMを介した弾性測定によるECMおよびPCMの生体力学的特性解析

1. 軟骨部の軟骨細胞パターンの同定
   1. AFMシステムに組み込まれた位相コントラスト顕微鏡下で軟骨部を観察し、変形性膝関節症の関節軟骨の特定の細胞パターン¹⁰を同定する:単一の文字列(健康な組織領域)、二重文字列(組織変性の開始)、小および大きなクラスター(両方の高度な組織変性)。図 2A-Dを参照してください。
   2. 特定の目的のパターンが特定されたら、マトリックスタイプ(PCMまたはECM)ごとに選択されたパターンごとに2つの部位を測定し、各測定部位で9回の測定繰り返しを行う(図2E,F)。サンプルサイズが不正確な可能性を考慮できるように十分な大きさを確保します。
      注: PCM 測定では、セルの近くに片持ちレバーを配置します(図 2E,Fの赤い円で示すように)。ECM の測定を行うために、セルのない領域 (図 2E,Fの青い領域で示されている領域) を選択し、ステップ 5.2 で説明したようにインデントを実行します。
2. 対象サイトのインデント
   1. アプローチを実行し、続いて引き込み、カンチレバーが組織の上に100 μm配置されるようにします。
   2. 測定するパターンの PCM または ECM に焦点を当て、その時点でコンピューターのマウスを固定します。
      注: マウスは、インデントのターゲット サイトのビジュアル マーカーとして機能します。焦点が片持ちの先端に移ると、組織構造は区別がつかないか、またはぼやける。
   3. 次に、プローブに焦点を合わせ、プローブの先端をコンピュータの矢印で以前に固定された位置に移動します。次に、カンチレバーのキャリブレーションによって得られた設定点パラメータを使用して、RUNで測定を開始する。
      注: 単一の文字列の PCM を測定した場合に得られる例示的な力曲線を補足図 1に示します。

6. データ処理

注: 弾性係数のデータ分析または決定は、前に説明した^11、,12のように Hertz モデルを使用して実行されます。インテンターの形状は先端の微小球の使用により球状であり、ポアソンの比率は、前の文献^{13、14、1514,15}に基づいて0.5に保たれた。¹³

1. AFM装置から取得したデータと互換性のあるデータ処理ソフトウェア(資料表)を開きます。
2. 力距離カーブを処理するソフトウェアで、Hertz モデルを選択します。ポアソン比を0.5に設定し、先端形状を球面、先端半径12.5μmに設定します。
3. すべてのパラメータが調整されると、結果が適合され、ヤング率が計算され、ソフトウェアによって表示されます。

結果

弦から二重弦、小さな、そして最後に大きなクラスタまでの病理学的モデルに沿って、ECM(図3A)とPCM(図3B)の両方が、各パターン変化の間で大幅に減少しました。唯一の例外は、文字列と二重文字列の間の ECM の違いでした (p = 0.072)。結果は、ECM/PCM比(図4B)が有意に変化しなかったことを示し、ECMとPCMの間の弾力性の絶対差の著?...

ディスカッション

AFMをナノスケールレベルで生体材料の生体力学的特性を測定する新しい強力な技術として、ヒト変形性関節関節関節軟骨におけるECMおよびPCMの弾性特性を測定した。軟骨サンプルは、局所組織変性のための画像ベースのバイオマーカーとして軟骨細胞組織のそれらの主要な空間パターンに従って選択した。予想通り、空間軟骨細胞再編成に伴い、ECMとPCMの両方の弾性値の強い低下が見られた?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B	Merck	A2942
Atomic Force Microscope (AFM)	CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany	JPK00518
AFM head	(CellHesion 200) JPK	JPK00518
Biocompatible sample glue	JPK Instruments AG, Berlin, Germany	H000033
Cantilever	tip C, k ¼ 7.4 N/m, All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria	AIO-TL-10
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)	Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany	41966052
Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM)	AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany	L201306_03
Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine	(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)	F1315
Microspheres	Polysciences	07313-5
Penicillin-Streptomycin	Sigma	P4333
Petri dish heater associated with AFM	JPK Instruments AG, Berlin, Germany	T-05-0117
Scalpel	Feather	2023-01
Tissue culture dishes	TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland	TPP93040
Tissue-tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands	SA6255012