マウスにおける閉鎖胸腔カテーテル法による心機能および圧力容積ループの両心室評価

要約

ここに提示されるのは、閉じた胸部カテーテル法を使用して同じ動物の右心室と左心室から圧力容積(PV)ループを生成することにより、マウスの両心室心機能を評価するプロトコルです。焦点は、手術とデータ収集の技術的側面にあります。

要約

心血管および肺血管の前臨床研究を実施するには、心機能の評価が不可欠です。心臓カテーテル検査中に圧力と容積の両方を記録することによって生成される圧力-容積ループ(PVループ)は、収縮期と拡張期の両方の心機能を評価する際に不可欠です。左右の心機能は密接に関連しており、心室の相互依存に反映されています。したがって、同じ動物で両心室機能を記録することは、心機能の完全な評価を得るために重要です。このプロトコルでは、患者でカテーテル法が行われる方法と一致する心臓カテーテル法への閉じた胸部アプローチがマウスで採用されています。胸部を開くと、前負荷と後負荷に大きな変化が生じ、アーティファクト、特に全身血圧の低下が生じるため、胸部閉鎖戦略はより生理学的なアプローチです。高分解能心エコー検査はげっ歯類の評価に使用されますが、心臓カテーテル検査は、特に両方の心室の拡張期血圧を評価する場合に非常に貴重です。

ここでは、同じ動物で侵襲的な閉鎖胸部、連続した左心室と右心室の圧力-容積(PV)ループを実行する手順について説明します。PVループは、マウスの圧力-容積カテーテルと圧力-容積システム取得によるアドミタンス技術を使用して取得されます。右頸静脈と右頸動脈にアクセスするために必要な頸部解剖から始まり、カテーテルの挿入と位置決め、そして最後にデータ収集まで、手順が説明されています。次に、高品質のPVループを確実に取得するために必要な基準について説明します。最後に、左心室と右心室のPVループの分析と、収縮期および拡張期の心室機能を定量化するために利用できるさまざまな血行動態パラメータについて簡単に説明します。

概要

世界保健機関(WHO)によると、心臓病は男女ともに世界の死因の第1位です^1,2,3。多くの研究は、^{心機能障害}の診断と改善に焦点を当てています4。これらのアプリケーションでは、高品質で再現性のある心機能の評価が重要です。病因反応と治療反応の両方を評価するには、忠実度が高く再現性のあるカテーテルデータが必要です。例えば、心筋梗塞の前臨床モデルにおける薬剤などの治療薬の有効性評価には、心機能の評価が不可欠である⁵。多くの心血管研究は左心室機能に焦点を当てていますが、右心室機能も肺血管疾患患者の機能的能力と予後の重要な決定要因です^6,7。進行性心不全の患者では、右側と左側の充填圧力が持続的に上昇し、死亡、心血管入院、心臓移植の複合リスク^{を予測します8}。大動脈弁と僧帽弁の複合疾患では、術前の心筋機能(心指数や左心室駆出率などのパラメータに反映される)が長期生存の主な予測因子である⁹。右心室機能は、肺動脈性肺高血圧症の罹患率と死亡率の両方の主要な予測因子です^10,11。したがって、右心室機能の評価は、肺動脈性肺高血圧症のモデルを使用した包括的な前臨床試験に必要な要素です12,13,14。

左心室と右心室の機能は、しばしば独立して研究されます。しかし、左心室と右心室の機能は密接に関連しているため、収縮期機能と拡張期機能の両心室評価を1回の検査で得ることが理想的である¹⁵。例えば、右心室は、左心室と左心室と心室中隔の斜め線維を共有しており、これは、左心室と右心室の収縮機能の間の機械的結合の1つを構成する^16,17。収縮期心室相互作用として知られるこの現象により、左心室の収縮が右心室の収縮を増強します。拡張期の心室相互作用も重要です。拡張期の間、一方の心室の容積は反対側の心室の容積に影響を与え、それによって拡張期のコンプライアンスと前負荷を変化させる^18,19。病理学的状態においては、一方の心室の機能低下、または容積負荷の障害は、他方の心室²⁰の機能を直接的または間接的に損なう可能性がある。収縮期心室相互作用の結果として、左心室機能の全体的な低下は、右心室収縮性能を低下させる可能性がある¹⁵。左心室収縮期機能および拡張末期血圧の上昇による心不全の患者では、肺動脈圧が上昇し、間接的に右心室の後負荷が増加する^21,22。逆に、重度の肺高血圧症では、右心室圧の上昇と容積過負荷により、左心が機械的に圧迫されます。心室中隔の左方向へのシフトによって引き起こされる左心室のこのD字型の平坦化は、左心室容積を減少させ、収縮期および拡張期機能を損なう23,24,25,26,27。したがって、左心室と右心室の両方の評価は、ヒト疾患の前臨床モデルで全体的な心機能を評価するために不可欠です。

心機能は、非侵襲的心エコー検査、磁気共鳴画像法(MRI)、および侵襲的カテーテル検査によっても評価できます28,29,30。心エコー検査は、比較的安価で入手しやすいため、心臓血管研究で最も一般的に使用される画像診断法です³¹。ただし、心エコー検査には、充填圧力の間接的な測定や拡張期機能を定量化する能力の制限など、いくつかの技術的制限があります。さらに、心エコー検査によって得られるデータの品質は、オペレーターに大きく依存します。心臓MRIは、前臨床画像兵器に比較的新しく追加されたものであり、両心室機能の定量的評価に大きな可能性を秘めています。心臓MRIによる定量化は、心エコー検査とは異なり、心室形状の幾何学的仮定を行わないため、正確である³²。しかし、MRIイメージングプラットフォームは高価であり、めったに入手できません。さらに、MRIデータの処理には、物理学者または同等の科学者による熟練したサポートが必要であり、多くの前臨床検査室ではそれが不足している³³。同様に、前臨床試験におけるマイクロコンピュータ断層撮影(MicroCT)の使用は、非侵襲的に取得できる定量的な高解像度の3次元(3D)解剖学的データを提供し、縦断的研究を可能にする³⁴。しかし、マイクロCTイメージングには造影剤の注入が必要であり、多くの場合、高価です。また、MRIのようなマイクロCTイメージングプラットフォームも高価であり、熟練した技術者も必要です。

対照的に、カテーテル法は、右心室および/または左心室にカテーテルを導入して圧力および/または体積を測定することからなる侵襲的技術です。心臓カテーテル検査に必要なツールは、心エコー検査、CT、MRIほど高価ではありません。ただし、カテーテル挿入や小動物麻酔には相当な技術力が必要です。カテーテル検査により、心機能を直接かつ正確に評価することができます²⁸。このプロトコルでは、アドミタンスPVカテーテルを使用して心機能を評価します。この技術は、血液と心筋の明確な電気伝導特性に基づいており、心臓腔内の圧力と容積の同時記録と、リアルタイムでのPVループの生成を可能にします^5,35。簡単に言うと、カテーテルは、励起電極と記録電極の両方で構成されています。励起電極は、右心室または左心室の内部に電界を発生させる。内部記録電極は、抵抗の変化に比例する電圧変化を測定します。心室容積の導出は、オームの法則(電圧=電流x抵抗)に基づいており、そこからコンダクタンス(つまり、抵抗の逆数)が計算されます。この設定では、測定されたコンダクタンス値は、血液コンダクタンスと筋コンダクタンスの組み合わせです。電界では、血液は純粋に抵抗性ですが、筋肉は容量性と抵抗性の両方を持っています。筋肉の静電容量性は、測定信号に時間遅延を引き起こします。「位相」角として知られるこの遅延を追跡することで、心臓が収縮するにつれて心臓組織が野に侵入することが報告されます。この測定値は収縮期で最も大きく、拡張期で最も低くなります。この特性により、コンダクタンスの筋肉成分を血液の筋肉成分から分離することができ、収縮期および拡張期の絶対容積を近似することができます。圧力-体積ループは、心圧を測定するための液体充填カテーテルを使用した単純な逆行性カテーテル法など、他の方法では容易に測定できないさまざまな血行動態パラメータを提供します。圧力-体積ループは、心室圧を測定するだけでなく、収縮性、弾性、出力、エネルギー、および効率に関するデータも提供します。さらに、PVループは堅牢な定量的測定を提供する³⁶。したがって、カテーテル挿入によって生成されたPVループによる心機能の評価は、前臨床研究のゴールドスタンダードとして浮上しています³⁷。さらに、前臨床技術は、液体で満たされたカテーテルではありますが、心臓カテーテル検査が一般的であるヒト疾患に関連しています。しかし、げっ歯類の心臓カテーテル検査には、過度の失血、低換気、体温の変化を防ぐための非の打ちどころのない麻酔と優れた技術が必要です。

ヒト患者では、心臓カテーテル検査は閉じた胸部構成で行われ、血管アクセスは右心室の場合は頸静脈または鎖骨下静脈、左心室の場合は橈骨動脈または大腿動脈を介して行われます。マウスはサイズが小さいため、胸部閉鎖アプローチはしばしば困難です。したがって、マウスで行われる研究は、一般的にオープンチェストアプローチを採用しています。この技術は、胸部を開き、それによって心臓を露出させ、左心室および/または右心室尖³⁸の穿刺を介してカテーテルの挿入を容易にすることを含む。このアプローチは技術的にはそれほど難しくなく、かなり再現性がありますが、その主な制限には、出血やその他のカテーテルの頂端挿入の合併症、および胸腔を大気圧に開放することによる心圧の著しい低下が含まれます。換気されたげっ歯類で胸部を開くと、左心室収縮期血圧が5〜10mmHg低下し、右心室圧が2〜5mmHg低下する³⁹。したがって、心臓への外傷が少なく、より生理学的に関連性のある測定値が得られ、心機能の臨床評価に簡単に変換できる閉鎖胸部アプローチが開発されました。

プロトコル

すべての実験は、クイーンズ大学のバイオセーフティおよび倫理ガイドライン(ROMEO/TRAQ#6016826)に従って実施されました。従った手順は、機関のガイドラインに従って行われました。これは端末プロシージャです。左右のカテーテル検査は侵襲性が高いため、データ取得後すぐに安楽死させる必要があります。 安楽死は、施設の動物実験ガイドラインに従って行う必要があります。

1. 実験の準備とセットアップ

1. 実験開始の30分前に、生理食塩水/ヘパリンを含む10 mLシリンジにカテーテルを入れ、室温で30分間入れます(図1A)。
2. 30分後、メーカーの推奨に従ってカテーテル(ベースラインや取得システムなど)を校正します。アクイジションシステムには、実験開始前にアクイジションシステムのキャリブレーションに使用される高いキャリブレーション値と低いキャリブレーション値が表示されます。これらの値を出力し、一致していることを確認します。
   1. 「圧力バランス制御」、「粗い+/-」、または「細かい+/-」ボタンを使用して、ベースライン圧力値をゼロに設定します。
   2. 高信号と低信号の2点校正を実行します。
      1. コントロールコンソールで、「カテーテルメニュー」の「システム設定」を押します。
      2. 「システム設定メニュー」の「キャリブレーション信号の送信」を押して、ロー信号を送信します。圧力、容量、位相、マグニチュードがそれぞれ0 mm Hg、0 μL、0°、0 μsであることを確認します。
      3. 「Enter」を押してハイ信号を送信します。圧力、容量、位相、マグニチュードがそれぞれ100 mm Hg、150 μL、20°、5,000 μsであることを確認してください。
      4. 「Enter」を押して「システム設定メニュー」に戻ります。
      5. 「6」を押して「カテーテルメニュー」に戻ります。次に、「データを取得」を押します。
3. 30 Gの針を約90°に曲げます(図1B、C)。この曲がった針は、頸動脈と頸動脈の血管に穴を開けるために使用されます。

2.麻酔と体温調節

1. マウス(28 g、本プロトコルではC57BL/6)を麻酔ガス(すなわち、酸素100%、誘導用イソフルラン3〜4%)を含む麻酔チャンバーに入れます。
2. 動物が麻酔をかけられ、前足や尻尾をつまんでも反応しない場合は、37°Cに設定した加熱パッドの上にマウスを仰臥位に置きます。
3. 100%の酸素と2%のイソフルランの混合物を提供するノーズコーンを介してマウスをマスクに接続します。推奨される換気設定を自動的に計算するには、タッチスクリーンを使用して動物の体重を人工呼吸器の専用ソフトウェアに入力します。計算には、次の式を使用します。
   一回換気量= 6.2 x動物質量^1.01 (kg)、
   呼吸数= 53.5 x動物質量^-0.26 (kg)。
4. 麻酔室からノーズコーンまでの麻酔ラインをオンにします。
5. 温度フィードバックプローブを直腸に挿入し、パッドプローブをパッドとマウスの背面の間に挿入し、希望の体温を37°C〜37.5°Cに設定します。 モニター画面で動物の体温を制御します(図2A、B)。
6. サージカルテープを使用して、マウスの前足と遠位片片を加熱ブランケットにテープで固定し、片方の後足を自由にして麻酔の深さを監視できるようにします。

3. 手術部位へのアクセス

1. 下顎骨から舌骨の高さまで2cmのH字型の腹側正中線頸部切開を行います。
   1. 下にある筋肉から皮膚を遠ざけます。必要に応じて、これらの筋肉を切除して視覚化を良くすることができます。
   2. 顎下腺をそっと脇に動かします。
   3. 頸部軟部組織を解剖し、鈍的解剖法を用いて鉗子で胸鎖乳突筋と胸骨舌骨筋を露出させます。
   4. 真ん中で筋膜を分割し、対になった胸骨舌骨を覆います。対になった胸骨舌骨筋を横方向に引っ込めて気管を露出させます。気管に沿って走る頸動脈や迷走神経を傷つけないように注意してください。
2. 鉗子を気管の下に通して気管を持ち上げます。次に、4.0の外科用シルク縫合糸を気管の下に通し、縫合糸の中央に潜在的な結び目を作り、後で締めて気管内チューブを固定します(図3A)。
3. はさみを使用して、喉頭の高さより下の気管の軟骨リングの間に小さな切り込みを入れます。気管内チューブを挿入します(図3B)。
4. 気管切開チューブを人工呼吸器に接続し、100%酸素と2%イソフルランで換気を開始します。気管の周りの結び目を締めて気管内チューブを固定し、人工呼吸器チューブを手術台にテープで固定します。気管が閉塞したり潰れたりしていないことを確認してください(図3C)。

4.右頸動脈と右頸動脈の分離

1. 右頸動脈の分離
   1. 鈍的解剖を使用して、胸骨舌骨筋を横方向に変位させ、右頸動脈を露出させて分離します。
   2. 鉗子を用いた鈍解剖により、迷走神経から頸動脈を分離する。
   3. 迷走神経を除く頸動脈の下に3本の外科的縫合糸(4.0)を通します。
2. 右頸静脈隔離
   1. 顎下腺と耳下腺を横方向に変位させて、右頸静脈を視覚化します。鉗子を使用して右頸静脈を鈍く解剖して露出させます。静脈を慎重に解剖し、周囲の筋膜を取り除きます。
   2. 頸静脈の下に鉗子を通します。
   3. 頸静脈の下に外科用縫合糸を1本通し、静脈の頭蓋側で結びます。止血クランプを使用して、この縫合糸に頭の方向に穏やかな牽引を加えます。
   4. 頸静脈の下にさらに2本の縫合糸を通します。止血クランプを使用して、最も遠位の縫合糸を尾方向にそっと引っ張ります。真ん中の縫合糸に緩い結び目を作ります。
   5. 温めた生理食塩水を数滴、血管切開部位の血管に置きます。

5. 右心室・左心室カテーテル法の外科的処置

1. 右心室カテーテル法(図4 A–D)。
   1. 実体顕微鏡を使用して、頸静脈を特定します。
   2. 静脈に優れた牽引力を優しく適用します。頭蓋縫合糸と中央縫合糸の間に30Gの湾曲した針を挿入して、静脈切開を行います。針を静脈に対して140°の角度で挿入し、同軸で入るようにします。
   3. 挿入したら、針を動かして静脈切開部を拡張します。カテーテルの先端を静脈切開室の針の下に挿入します。次に、真ん中の縫合糸を静かに結び、カテーテルを固定します。
      注意: 過度の力はカテーテルを損傷する可能性があるため、縫合糸をきつく結びすぎないように細心の注意を払ってください。
   4. 尾側縫合糸を解放し、カテーテルを右心室に進め、連続モニターで古典的な右心室圧波形を検出します。
   5. 右心室圧を安定させます。.カテーテルを右心室に正しく配置して、最適なPVループを生成します。
      1. 血液と筋肉を反映するマグニチュードを安定させて、圧力とマグニチュードのループ(つまり、Y軸の圧力、X軸の大きさ)を生成します。必要に応じて、カテーテルシャフトを静かに回転させて、右心室の軸に沿ってカテーテルを最適に配置します。
         注意: 筋肉を反映する最大位相値は、7°未満である必要があります。
   6. 圧力-マグニチュードループ信号が最適な場合は、収集中にコンソールの「Enter」を押してベースラインスキャンを実行します。モニター画面に毎分拍数(bpm)で報告される心拍数が生理学的範囲(つまり、400〜600 bpm)にあることを確認します。
   7. PV ループを生成します。X軸のパラメータとして「Magnitude」を「Volume」に変更し、圧力をY軸として維持します。PVループ信号が最適になったら、30秒間録音します。
   8. 記録を停止します。カテーテルを引き戻し、ガーゼでやさしく拭きます。カテーテルをヘパリン/塩化ナトリウム溶液に入れ、尾側縫合糸を結んで頸静脈からの出血を止めます。
2. 左心室カテーテル検査(図5 A–D)。
   1. 湾曲した鉗子を動脈の下にスライドさせることにより、以前に分離された右頸動脈(5A)を静かに持ち上げます。
   2. 前の縫合糸を結び、それによって動脈を閉塞します。次に、止血クランプを使用して頭蓋方向に牽引を静かに適用します。
   3. 止血クランプを使用して、最も遠位の縫合糸を尾方向に引っ張ります。真ん中の縫合糸に緩い結び目を作ります。
   4. 温めた生理食塩水を数滴、予想される動脈切開術の部位の血管に置きます。脳定位固定装置を使用して、尾側と中央縫合糸の間の頭蓋部分に焦点を合わせます。
   5. 動脈に優れた牽引力を優しく適用します。頭蓋縫合糸と中央縫合糸の間に30Gの湾曲した針を挿入して、動脈切開術を行います。針を動脈に対して140°で挿入し、同軸で入るようにします。
   6. カテーテル先端を動脈切開術に挿入し、中央の縫合糸を締めてカテーテルを固定します。同時に、遠位縫合糸を解放し、カテーテルを大動脈に進めて記録を開始します。圧力チャネルが典型的な大動脈トレースを示していることを確認します。
   7. カテーテルを大動脈弁を横切って左心室に逆行させます。左心室への侵入は、大動脈からの拡張期血圧の突然の著しい低下から明らかです。
   8. 左心室圧を安定させます。.左心室のカテーテルを正しく配置して、最適なPVループを生成します。
      1. 血液と筋肉を反映するマグニチュードを安定させて、圧力とマグニチュードのループ(つまり、Y軸の圧力、X軸の大きさ)を生成します。必要に応じて、カテーテルシャフトを静かに回転させて、左心室の軸に沿ってカテーテルを最適に配置します。
         注意: 筋肉を反映する最大位相値は、7°未満である必要があります。
   9. 記録を停止します。カテーテルを引き戻し、ヘパリン/塩化ナトリウム溶液に入れます。次に、尾側縫合糸を結びます。
   10. 酵素界面活性剤(エンドジムなど)でカテーテルを洗浄します。
       注:手術後、施設の動物実験ガイドラインに従って動物を安楽死させてください。 

6. データ解析

1. 確立された推奨事項に従って PV ループ分析を実行します。
   1. 最適な圧力-体積トレースを選択します(理想的には、完全に安定した30秒の記録)。ソフトウェアで、「アドバンス」をクリックし、「ループ」をクリックしてから、「オフライン計算」をクリックします。
   2. ボリュームをボリュームチャネルとして選択し、圧力チャネルとして圧力を選択します。
   3. 一貫した結果を得るには、最低でも 20 回のループが必要です。

結果

カテーテルは、カテーテル挿入の30分前に室温でヘパリン化生理食塩水の溶液を含む10mLシリンジに入れられました(図1A)。30Gの針を~90°曲げ(図1B、C)、直径1.45mmの気管切開カニューラを作製した(図1C)。

生理的な体温の維持は重要です。マウスはテープで固定され、ノーズコーンを介して人工呼吸器に接続されました。フィードバックプローブは、マウスのパッドと背面の間に配置されました。動物の体温をモニターするために直腸プローブを挿入しました(図2A)。体温(37.1°C)とパッド(40.7°C)の温度をモニターしました(図2B)。

挿管手順の重要なステップの写真は、 図3A–Cに示されています。挿管が成功し、妨害がなければ、安定したピーク圧で通常の呼吸数が得られました(図2B)。

右心カテーテル挿入術の重要なステップ、頸静脈の分離(図4A-C)から頸静脈へのカテーテルの挿入までを図4Dに示します。図5は、右頸動脈の分離(図5 A、B)やカテーテル挿入(図5 C、D)など、左心カテーテル挿入の重要なステップを示しています

カテーテルは頸静脈に導入され、右心室に進みました。その後、右心室圧が安定し、正しい位置が確認されました。すべてのカテーテルの電極(長さ6mmの長軸)は、右心室内にあり、心室壁に接触していない必要がありました。 図6A に概略的に表されるようなカテーテルの最適な位置決めは、最適なPVループ(すなわち、三角形、規則的)を生成した。 図6B に概略的に示されているように不適切な位置決め(すなわち、心室壁との接触)は、欠陥のあるPVループ(すなわち、崩壊した不規則なループ)をもたらす。

カテーテルは頸動脈に導入され、大動脈に進み、次に大動脈弁を横切って左心室に逆行しました。左心室圧は安定し、右位置を確認した。すべてのカテーテルの電極 (長軸の長さ 6 mm) は、左心室内にあり、心室壁に接触していない必要があります。 図6C に概略的に表されるようなカテーテルの最適な位置決めは、最適なPVループ(すなわち、長方形、規則的)を生成した。 図6D に概略的に示されているように、不適切な位置決め(すなわち、心室壁との接触)は、欠陥のあるPVループ(すなわち、崩壊した、非長方形、および不規則なループ)をもたらしました。

左右のPVループによって生成された代表的な血行動態は、心拍数410bpm、心拍出量9,107μL/min、ストローク量24.5μLを示しました。 特定の右心室パラメータは、21.9 mm Hgの右心室収縮期血圧、右心室拡張末期血圧1.049 mm Hg、駆出率56.1%、dp / dt最大1,469 mm Hg / s、 dp/dt max -1,504 mm Hg/s、拡張末期容積 38.4 μL、ストロークワーク 0.068 mJ、圧力-容積面積 0.089 mJ、肺動脈弾性 (Ea) 0.83 mm Hg/μL、タウ係数 12.8 ms。特定の左心室パラメータは、77.1 mm Hgの左心室収縮期血圧、2.33 mm Hgの左心室拡張末期血圧、駆出率59.1%、dp / dt最大4,695 mm Hg / s、dp / dt最大-3,553 mm Hg / s、拡張末期容積36.9 μL、ストロークワーク0.14 mJ、圧力-容積面積0.22 mJ、 動脈の弾性(Ea)は5.37 mm Hg/μL、タウ係数は15.1 msです(表1)。

血行動態パラメータ
人事(BPM)	410.6 ± 23.3
CO (μL/min)	9107 ± 1016
SV (μL)	24.5 ± 2.3
RV機能
RVSP(mmHg)	21.9 ± 2.15
RVEDP(ミリヘルツ)	1.042 ± 0.12
EF (%)	56.1 ± 4.4
最大dP/dt(mmHg/s)	1469 ± 170
最大dP/dt (- mmHg/s)	1504 ± 215
EDV(μL)	38.4 ± 3.7
SW (mジュール)	0.068±0.008
PVA(mジュール)	0.084±0.009
Ea(mmHg/μL)	0.83 ± 0.09
タウ係数 (ms)	12.8 ± 0.8
LV機能
LVSP (mmHg)	77.1 ± 2.4
LVEDP(mmHg)	2.33 ± 0.17
EF (%)	59.1 ± 3.6
最大dP/dt(mmHg/s)	4695 ± 355
最大dP/dt (- mmHg/s)	3553 ± 373
EDV(μL)	36.9 ± 4.8
SW (mジュール)	0.14 ± 0.013
PVA(mジュール)	0.22 ± 0.03
Ea(mmHg/μL)	5.37 ± 0.9
タウ係数 (ms)	15.07 ± 1.7
CO、心拍出量;Ea、動脈弾性;EDV、拡張期末期容積;心拍数、心拍数;LVEDP、左心室拡張期末期容積;LVSP、左心室収縮期血圧;PVA、圧力体積面積;RVEDP、右心室拡張期末期血圧;RVSP、右心室収縮期血圧;SV、ストローク量;SW、ストロークワーク;タウ因子、タウ・ミルスキー。N = 6匹のマウス。値はSEM±表されます

表1:血行動態パラメータの表。 6匹のマウスで測定された左右の心室血行動態パラメータ。

図1:実験の準備とセットアップ。 (A)生理食塩水/ヘパリン10mLシリンジのカテーテル、(B)、(C)約90°に曲げた30Gの針、(D)気管切開カニューラ、直径1.45mm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図2:麻酔、 体温調節 。 (A)3本の足をテープで固定し、ノーズコーンを介して人工呼吸器に接続し、フィードバックと直腸プローブを挿入したマウス。ウォーミングパッドはサージカルブランケットの下にあることに注意してください。(B)体温(直腸)とパッド(フィードバック)の温度と換気パラメータ(呼吸数(RRの設定)、平均一回換気量(Meas TV)、ピーク圧力(PeakPress)、および分換気(MinVol)を示す温度モニター制御。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図3:挿管手順。 (A)皮を剥がして切った。顎下腺を静かに脇に移動させた。胸鎖乳突筋と胸骨舌骨筋を引き離し、鉗子を気管の下に通し、穏やかで鈍い解剖を行いました。(B)外科用シルク(4.0)を気管の下に通し、気管の2つの軟骨リングの間に前方に小さな切り込みを入れました。気管切開を挿入し、縛りました。(C)気管切開チューブを人工呼吸器に接続し、チューブに縫合糸を巻き付けた。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図4:右心室カテーテル検査。 (A)、(B)、(C)右頸静脈を分離し、その下に1本の外科的縫合糸を通し、静脈の頭蓋側で結んだ。止血クランプを使用して、この縫合糸に頭の方向に穏やかな牽引を加えました。さらに2本の縫合糸を遠位、頸静脈の下に通した。最も遠位の縫合糸は、止血クランプを使用して尾方向に静かに引っ張られました。縫合糸の真ん中に緩い結び目が作られました。(D)カテーテルを頸静脈に挿入し、中間縫合糸をカテーテルに結び付けた。(C)と(D)の画像は実体顕微鏡で拡大されます。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図5:左心室カテーテル検査。 (A)、(B)右頸動脈を分離し、頸静脈の下に1本の外科的縫合糸を通し、静脈の頭蓋側で結びました。止血クランプを使用して、この縫合糸に頭の方向に穏やかな牽引を加えました。さらに2本の縫合糸を頸動脈の下に通した。最も遠位の縫合糸は、止血クランプを使用して尾方向に静かに引っ張られました。真ん中の縫合糸に緩い結び目が作られました。(C)カテーテル先端を頸動脈に挿入し、中間縫合糸をカテーテルに結び付けて固定する。(D)カテーテルは、頸動脈を下って大動脈に向かって緩やかに逆行しました。(B)、(C)、(D)の画像は実体顕微鏡で拡大されます。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図6:カテーテルの位置決めと結果として生じるPVループの概略図。(A)右心室での最適なカテーテルの位置。カテーテルの先端は心室の中央にあり、心室壁から隔離されています。右心室における最適なカテーテルの位置(すなわち、安定、三角形)から生じる代表的なPVループ。(B)右心室への不適切なカテーテルの位置。カテーテルの先端は心室壁に接触しています。代表的なPVループは、右心室のカテーテルの位置が最適でない(つまり、潰れている、不規則)ことに起因するノイズです。(C)左心室での最適なカテーテルの位置。カテーテルの先端は心室の中央にあり、心室壁から隔離されています。左心室での最適なカテーテルの位置決めから生じる代表的なPVループ(すなわち、安定、長方形)。(D)左心室での不適切なカテーテルの位置。カテーテルの先端は心室壁に接触しています。左心室におけるカテーテルの位置が最適でない(すなわち、虚脱、不規則)ことに起因する代表的なPVループ。50HzのFIRノイズフィルタを適用してPVループを生成しました。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

心機能の評価は、前臨床の心血管および肺血管研究にとって重要なステップです。この研究では、マウスの心機能の閉鎖胸部両心室評価のプロトコルを提案しました。このアプローチにより、右心室と左心室のPVループを同じマウスで生成できます。このアプローチは、心機能の堅牢で完全な評価を提供し、収縮期機能と拡張期機能、および脳卒中量と心拍出量の測定を可能にします。げっ歯類のカテーテル検査に古典的に使用される開胸アプローチとは異なり、この閉鎖胸部技術は、より安定した生理機能とより生理学的に関連するデータをもたらします。カテーテルを右心室と左心室にうまく配置するには、技術的に困難でオペレーターのスキルが必要ですが、胸部閉鎖アプローチは、開胸手術に関連する外傷や出血を制限し、肺を大気圧にさらすことに伴う急激な圧力変化を軽減します。また、胸部閉鎖アプローチは、患者に実施される心臓カテーテル検査をより良くエミュレートするため、前臨床研究におけるこの技術の使用の関連性が高まります。

外科的処置は、プロトコルの重要なステップです。頸静脈や頸動脈へのカテーテル挿入に手術用顕微鏡を使用する場合でも、この手術には練習と技術が必要です。穏やかで鈍い解剖によって周囲の筋膜から解放された血管を慎重に解剖することで、出血のリスクを最小限に抑えながら、カニューレ挿入の成功率を高めることができます。出血を最小限に抑えるには、頸動脈を順番にカニューレ挿入することが重要です:1)カテーテル先端を頸動脈に導入します。2)カテーテルを含む動脈の部分の周りに縫合糸をそっと結びます。3)安全な縫合糸を解放し、出血を最小限に抑えるために穏やかな上向きの牽引を維持しながらカテーテルを移動できるようにします。4)カテーテルを大動脈まで進めます。リアルタイムの波形モニタリングによって決定される心室へのカテーテルの位置決めは、このプロトコルの最も困難な部分です。すべてのカテーテルの電極は心室腔内にあり、どれも壁に触れてはなりません。カテーテルの位置が不適切な場合、不規則なPVループが発生し、データ取得に悪影響を及ぼしたり、データ取得が妨げられたりします。すべての電極が心室内にあることから生じる特徴的な圧力-体積波形を認識することで、適切なカテーテルの位置を確信することができます。PVモードに移行して体積を取得する前に、安定した心室圧波形と安定した圧力-大きさループを取得することが重要です。心臓の生理学と解剖学に関する適切な知識は、この手順を成功させるために不可欠です。心房、三尖弁領域、および右心室からのPVトレースのオンライン読み取りは、カテーテルの前進を示し、適切な位置決めを達成するのに役立ちます。正常な心拍数(400〜600 bpm)、および予想される波形と圧力(例、右心室収縮期血圧、18〜25 mm Hg、拡張期血圧<5 mm Hg、左心室収縮期血圧60〜120 mm Hg、拡張期血圧<8^mmHg)を知ることが重要です。

データの品質と再現性は、手順の速度と失血または出血によって異なります。麻酔からデータ取得の完了までの手順は、平均して30~40分/匹かかります。右心カテーテルカテーテルは、カテーテルの挿入からデータ取得まで5〜10分、左心カテーテル挿入からデータ取得まではさらに10〜15分かかります。論文掲載品質のデータは、~75%の症例で得られます。心臓カテーテル検査の一連のステップは、動物間で一定に保つ必要があります。この手順では、マウスを最初に挿管し、次に右心室カテーテル法、最後に左心室カテーテル法を行います。この順序で進める決定は、左心と右心カテーテル法の難易度と出血リスクが高いことに基づいています。非特異的な50Hzノイズ記録アーチファクトが観察されます。このノイズは、ソフトウェアで 50 Hz で高いカットオフと低い 0 のカットオフを持つ FIR フィルターを使用して低減できます。ボリューム チャネルに対して、新しいチャネル/フィルター/FIR フィルターを作成します。また、データ取得時に50Hzのノッチフィルタを適用して、主電源ノイズを除去し、無線周波干渉を除去することもできます。

カテーテル検査が速く行われるほど、データの品質は向上します。これまでの経験から、15分以内にデータを取得することをお勧めします。カテーテル挿入時間が長くなると、動物の生理的ストレスが増加し、腔内にカテーテルが存在するため、不整脈のリスクが高まります。これらの力は、ストロークボリュームを減少させ、波形の再現性と解釈可能性を損なう可能性があります。さらに、カテーテルの先端は鋭利であり、心室を損傷したり穿刺したりする可能性があります。これは、左心室の厚さの1/3~3^である 右心室にとって特に重要です。

侵襲的気管切開と陽圧式人工呼吸により、マウスの呼吸が安定し、制御され、PVループ獲得のばらつきが減少します。ただし、呼気終末陽圧(PEEP)は、陰圧現象である通常の換気とは著しい対照です。陽圧換気とPEEPを組み合わせることで、心拍出量が低下し、右心圧が下がります。したがって、安定したデータの取得には必要ですが、麻酔の機械的換気と心抑制効果はPVループに影響を与え、制限として考慮する必要があります。PVループの短時間の録音中に機械的換気を一時的に停止することは、この潜在的なアーチファクトの発生源を排除するために使用されます。なお、換気効率は、二酸化炭素のカプノグラフィーモニタリングにより確認することができる。

クローズドチェストアプローチに必要な技術的スキルは、このテクニックの限界かもしれません。同様に、心室内のカテーテルを適切かつ安定的に位置決めすることは困難です。成功の確率は、オペレーターの経験とマウスのサイズと重量によって増加します。20g未満のマウスのカテーテル挿入は非常に困難です。右心室のユニークなチャンバー形状は、容積測定に影響を与える可能性があり、考慮する必要があります。.使用する麻酔薬、心拍数、体温、および動物の緊張は、血行動態パラメータに影響を与える可能性があるため、注意深く報告および監視する必要があります。.

結論として、このプロトコルでは、右心室と左心室の両方のカテーテル検査が同じマウスで行われます。科学者の特定の目的に応じて、左心室または右心室カテーテル法は、両心室手順の関連部分を使用して独立して実行できます。ただし、提示されたアプローチは、心機能の完全な評価に最適です。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
ADVantage Pressure-Volume System (ADV500)	Transonic	FY097B
Endozime AW triple plus	Ruhof	34521
Fiber optic dual Gooseneck	Volpi Intralux	# 6000-1
Forceps	F.S.T	11052-10
Forceps	F.S.T	11251-20
Gauze sponges	Dermacea	441400
Hemostatic clamp	F.S.T	13003-10
Hemostatic clamp	F.S.T	13018-14
Heparin sodium	Sandoz	023-3086	100 U/L
High-fidelity admittance catheter	Scisence; Transonic	FTH-1212B-3518
Isofluorane	Baxter	CA2L9108
labScribe v4 software	iworx	LS-30PVL
Needle (30 gauge)	BD	305106
sodium chloride injection	Baxter	JB1309M	0.9%(wt/vol)
Stereo microscope	Cole-Parmer	OF-48920-10
Surgical suture	SERAFLEX	ID158000	black braided silk, 4.0
Surgical tape	3M, Transpore	SN770
Tabletop Single Animal Anesthesia Systems	Harvard apparatus	72-6468
Tracheotomy canula 1.45 mm diameter	Harvard apparatus	72-1410
Ventilator, far infrared warming pad for mice and rats PhysioSuite	Kent scientific corporation	# PS-02