ゼブラフィッシュにおける機能化された蛍光シリカナノ粒子を用いた異種移植ヒト癌細胞のビボ標的化

要約

ここで説明するゼブラフィッシュ胚を利用して、生体内のヒト癌細胞を標的とする機能化されたナノ粒子の能力を研究する方法について説明する。この方法は、大型動物および臨床試験における将来の試験に最適なナノ粒子の評価と選択を可能にする。

要約

がん細胞の検出、標的化、破壊が可能なナノ粒子の開発は、ナノメディシン分野において大きな関心を持っています。生体内の動物モデルは、ナノテクノロジーを生体医学の応用に橋渡しするために必要とされています。マウスは、前臨床試験のための伝統的な動物モデルを表します。しかし、マウスは比較的高価であり、各母親からの限られた子孫のために長い実験サイクルを有する。ゼブラフィッシュは、がん研究を含む発達および生物医学研究のための強力なモデルシステムとして登場しました。特に、その光学的透明性と急速な発達により、ゼブラフィッシュ胚は、がん細胞の挙動およびそれらの微小環境との相互作用をリアルタイムでインビボで監視するのに適しています。この方法は、透明キャ スパー ゼブラフィッシュ胚にヒトがん細胞と機能化ナノ粒子を順次導入し、ナノ粒子によるがん細胞の認識と標的化をリアルタイムで監視するために開発されました。この最適化されたプロトコルは、葉酸基で機能する蛍光標識ナノ粒子が、異なるフルオロクロムで標識されたヒト子宮頸部上皮癌細胞を特異的に認識し、標的化できることを示している。認識および標的化プロセスは、試験したナノ粒子の注入後30分で早くも起こり得る。全体の実験は、成魚のいくつかのペアの繁殖を必要とし、完了するまでに4日未満かかります。さらに、ゼブラフィッシュ胚は機能的な適応免疫系を欠き、幅広いヒト癌細胞の生着を可能にする。したがって、ここで説明するプロトコルの有用性により、さまざまなタイプのヒト癌細胞上でナノ粒子を試験することができ、哺乳類および診療所における将来の検査のために、各特定の癌コンテキストにおける最適なナノ粒子の選択を促進する。

概要

がん細胞の検出、標的化、破壊が可能なナノ粒子の開発は、物理学者と生物医学研究者の両方にとって大きな関心事です。ナノメディシンの出現は、リガンドおよび/または化学療法薬^,1、2、32を標的としたものなど、いくつかのナノ粒子の開発につながった。¹³ナノ粒子の追加特性により、生物学的システムとの相互作用が可能となり、治療用途とともに高効率かつ正確な生体事象を検出および監視することができます。金と酸化鉄のナノ粒子は、主にコンピュータ断層撮影および磁気共鳴画像化アプリケーションで使用されます。金および酸化鉄ナノ粒子の酵素的活動は、着色アッセイを介して癌細胞の検出を可能にするが、蛍光性ナノ粒子はインビボイメージングアプリケーション⁴に適している。中でも、超明るい蛍光性ナノ粒子は、より少ない粒子と毒性の低減を伴う早期に癌を検出する能力のために、特に^{有益である。}

これらの利点にもかかわらず、ナノ粒子は、適切なナノ材料の選択と合成プロセスの最適化のためにin vivo動物モデルを使用して実験を必要とする。さらに、薬物と同様に、ナノ粒子は、その有効性と毒性を決定するために前臨床試験のために動物モデルに依存しています。最も広く使用されている前臨床モデルは、その維持が比較的高いコストで来る哺乳類であるマウスです。癌研究のために、遺伝子操作されたマウスまたは異種移植マウスのいずれかが典型的には^66,77を用いる。これらの実験の長さは、多くの場合、数週間から数ヶ月に及びます。特に、癌転移研究のために、癌細胞は、尾^,静脈および脾臓⁸8、9、10などの場所でマウスの循環系に直接注入される。^,910これらのモデルは、腫瘍細胞が遠くの器官を精外に出して植民地化する場合の転移の終わりの段階を表すだけです。また、視認性の問題により、マウスにおける腫瘍細胞遊動やナノ粒子標的化を監視することは特に困難である。

ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、その高い菌性、低コスト、急速な発達、光学的透明性、および遺伝的保存^11、12,12のために癌研究のための強力な脊椎動物システムとなっています。マウスモデルに対するゼブラフィッシュのもう一つの利点は、発達を通じて胚を監視することを可能にする魚の卵元子宮の受精である。胚発生はゼブラフィッシュにおいて急速であり、そして24時間以内に受精後(hpf)、脊椎動物のボディプレーンはすでに¹³を形成している。72 hpfによって、卵は絨毛膜から孵化し、胚から稚魚の段階に移る。ゼブラフィッシュの透明性、特に¹⁴のキャスパー株は、生きている動物のナノ粒子による癌細胞の移動とその認識および標的化を視覚化するユニークな機会を提供する。最後に、ゼブラフィッシュは48hpfによって自然免疫系を発達させ、適応免疫系は遅れ、^受精後28日で機能するだけである。このギャップは、免疫拒絶反応を経験することなく、ゼブラフィッシュ胚への様々なタイプのヒト癌細胞の移植に理想的である。

ここで説明するゼブラフィッシュの透明性と急速な発達を利用して、生体内の蛍光性ナノ粒子によるヒト癌細胞の認識および標的化を実証する方法を説明する。このアッセイでは、赤蛍光タンパク質を発現するように遺伝子操作されたヒト子宮頸癌細胞(HeLa細胞)を、48hpf胚の膜腔内の血管化領域に注入した。20-24時間後、HeLa細胞はすでに魚の循環系を通じて胚全体に広がっていた。明らかな転移を有する胚は、高い毛細血管床がある眼の真後ろにナノ粒子溶液の〜0.5nLをマイクロインジェクションした。この技術を使用すると、超明るい蛍光シリカナノ粒子は、注射後20〜30分の速さでHeLa細胞を標的にすることができます。そのシンプルさと有効性のために、ゼブラフィッシュは、特定の癌細胞を標的とする能力について様々なナノ粒子をテストするための堅牢なin vivoモデルを表しています。

プロトコル

すべての動物の手順は、プロトコルの下でボストン大学医学部の施設動物のケアと使用委員会(IACUC)によって承認されました #: PROTO201800543.

1. キャスパー ゼブラフィッシュ胚の生成

1. 透明なキャスパーゼブラフィッシュ胚を生成するために、自然繁殖のために少なくとも3Casperヶ月齢の成虫魚を選択してください。
2. 夕方に魚の水で2部屋の交配タンクを充填し、仕切りを使用して上部のタンクを分離し、チャンバーの片側に1つまたは2つのメスの魚を置き、分割機で一晩分離した魚を残します。
3. 翌朝8時にライトが点灯したときに、ディバイダーを引き出します。人工濃縮植物を追加し、水の浅い領域を作成するために、上部チャンバーをわずかに傾けます。魚が3-4時間繁殖することを許可します。
4. 魚を含む交配タンクの上部チャンバーを持ち上げ、元のタンクに戻します。
5. メッシュネットを通して水を注ぐことによって底の部屋に位置する卵を収集します。1皿あたり200個以下の密度で無菌ペトリ皿に卵を移します。死んだ卵や未受精卵を取り除き、新鮮な魚の水で2/3いっぱいの料理を満たします。
   注:受精し、健康な卵は半透明で丸いでなければなりません。白濁、白、または不姿の卵は除去する必要があります。魚の水は、魚の施設内の魚のタンクから得られます。
6. 28.5 °Cでインキュベーターで胚を一晩インキュベートする。
7. 翌朝、ゼブラフィッシュブック¹⁶に記載されている標準プロトコルを使用して胚を漂白し、胚をインキュベーターに戻します(任意のステップ)。
8. 午後にインキュベーターから24hpf胚を取り出し、プロナーゼを使用して胚をデコール化する。
   1. ペトリ皿の胚からできるだけ多くの魚の水を取り出し、プロナーゼ溶液(魚水に1mg / mL)を数滴加えます。ペトリ皿をそっと渦巻きます。いったん、発痛の兆候が現れたら、数回、胚を上下にピペットして、胚を放出するために、その後に、その胚を分解する。
   2. 新鮮な魚の水をペトリ皿にすぐに加え、胚の大半が骨盛りから出たらプロセスを終了します。浮遊するコリオンを除去するために魚の水を使用して胚を3倍以上すすります。胚をインキュベーターに戻します。

2. 移植のためのヒトがん細胞の調製

1. インキュベーター温度を正確に35.5 °Cに設定します。 インキュベーターを監視して、インキュベーター内部の温度計を使用して一貫した安定した温度を確保します。
2. ガラス瓶に1Lの魚の水を詰めます。100mLのオートクレーブ魚水に3gの電気泳動グレードのアガロースを加え、アガロースが完全に溶解するまでマイクロウェーブを行い、3%のアガロース溶液を作ります。
   1. 3/4がいっぱいになるまでペトリ皿に熱いアガロース溶液を注ぎます。アガロースにマイクロインジェクションモールドを置きます。鋳型がペトリ皿の底に接触せず、下に泡が形成されていないことを確認します。
   2. 溶液を固め、慎重にプレートから金型を取り除きます。プレートに魚の水を詰め込み、4°Cで保存します。 ヒラ細胞を収穫する前に、35.5°Cインキュベーターでアガロースプレートと魚の水を前温め。
3. 500で圧力、560で熱、100で引っ張り、100で速度、200で時間/遅延:ピペットプラーに1.0 mm O.D.x 0.78ミリメートルのホウケイ酸ガラス毛細血管を引っ張ります。エタノールタオルで拭いた大きなペトリ皿にパテに針を保管してください。
   注意:引っ張られた針は非常に鋭く、壊れやすい。取り扱いの際は注意してください。
4. MS222をオートクレーブされた魚の水に溶解させることにより、トリケーヌメタンスルホン酸(MS222、4 mg/mL)のストック溶液を調製します。使用前に渦。希釈MS222ストック溶液1:100魚水(すなわち、20mLの魚水に20mLの魚水に200μLを加えて、最終的な濃度40μg/mL)を、次の手順で胚を麻酔します。
5. 培養hLabel HeLa細胞は^、17に記載されたプロトコルを用いてPLenti6.2_miRFP670レンチウイルスとそれらをトランスフェクトすることによって。移植前にRFP+HeLa細胞を30分-1時間収穫する。
   注:ヒトHeLa細胞は、5%CO2で補った37°Cで完全増殖培地(DMEM培地10%FBS)において最大70%合流までの組織培養インキュベーターで培養されている。₂
   1. 組織培養フード内の吸引によりHeLa細胞培地を除去する。細胞層を滅菌PBSで簡単にすすいで、血清の痕跡をすべて除去します。
   2. T-75フラスコに3.0mLの滅菌トリプシン-EDTA溶液を加え、細胞を37°C組織培養インキュベーターに3〜5分間戻して酵素消化を容易にします。細胞の80%が懸濁されるまで顕微鏡下でフラスコを観察する。
   3. フラスコに完全な成長培地の6-8 mLを追加します。穏やかにピペットによって15 mLの無菌管に細胞を集める。遠心分離機 135 x g 5 分間
   4. 上清を吸引し、完全増殖培地の3mLでHeLa細胞を再懸濁する。上記の洗浄工程2xを繰り返す。完全な成長培地の1 mLで細胞を再懸濁し、ヘモサイトメーターを使用して顕微鏡下で細胞を数えます。
   5. 細胞を再び回転させ、上清を取り除き、5 x 10⁷ 細胞/mLの濃度で1.5 mLマイクロ遠心分離管の細胞を再懸濁させる。魚の施設に運ぶときに片手で管を握って細胞を暖かく保つ。
      注:胚を注入する前または注入中に35.5°Cインキュベーター内に細胞を保管することによって、細胞を常に暖かく保ちます。

ヒトがん細胞の移植

1. 移植前にエタノールタオル(はさみ、ピンセット、プラスチックピペット、カミソリブレードなど)を使用して作業領域を清掃してください。
2. プラスチックピペットを使用してアガロースプレートの溝内の胚を整列させます。前子を前方に向けて側面に胚を置きます。
   注:魚の水が胚を覆っていることを確認してください。がん細胞を注入しないようにいくつかの胚を脇に置き、コントロールとして使用してください。
3. 空気源とマイクロインジェクターをオンにします。培養器からHeLa細胞を取り出し、P200チップを使用して細胞を上下にピペットします。切り取られた端が付いたゲルの負荷の先端を使用して、すぐに針に3μLの細胞混合物をロードする。針の鋭い下端に向かって慎重にチップを挿入します。必要に応じて、針を振って、細胞混合物が針を下に移動して鋭い端を満たしていることを確認します。
   1. 針を針ホルダーに差し込みます。ピンセットを使用して、針の先端を慎重に開きます。マイクロインジェクターの圧力と時間を調整して、針先の中のすべての気泡を押し出します。射出液滴の大きさが〜1nLになるまで圧力と射出時間を短くする。
   2. 注射板を顕微鏡の下に置き、卵子側を針に向けて持つ適切な位置に置きます。希釈したMS222溶液(40μg/mL)を5滴添加して胚を麻酔します。
   3. 注射器を配置し、針が各胚の膜膜腔に触れるようにします。
4. フットペダルを押して、膜腔の下の血管化領域の胚に細胞混合物を注入する。
5. 非支配的な手を使用して、注射プレートを次の胚に移動させます。フットペダルを同時に押しながら注入器を伸ばしたり引き込んだりして、インジェクションを継続します。注入された胚に滅菌魚の水の数滴をピペット。プレート上のすべての胚の注入が完了したら、無菌の魚の水で胚を洗い流し、滅菌ペトリ皿に入れ、すぐに35.5°Cインキュベーターに移します。
6. 3時間後、注入された胚を調べ、死んだ胚を取り除く。
7. 生きた胚を35.5°Cインキュベーターに戻し、20〜24時間インキュベートして、HeLa細胞が注射部位から身体の他の部分に広がるようにします。
   注:胚は、細胞が28.5°Cでうまくいっていないので、ヒト癌細胞の生存と移動を可能にするために35.5°Cインキュベーターに保管され、温度魚の胚は通常インキュベートされます。

4. ナノ粒子または車両の注入

1. 希釈したMS222溶液を5滴で翌朝移植した胚を麻酔する。これは胚を殺すので、あまりにも多くのMS222を追加しないでください。蛍光顕微鏡の下で、慎重にRFP + HeLa細胞の尾転移を伴う胚を拾い、滅菌魚の水で新しいペトリ皿に入れます。
2. セクション 2 で説明したとおりに、500 の圧力、645 の熱、60 で引き、速度が 50、100 の時間/遅延の設定を使用して、注射針を作成します。
3. ステップ3.1-3.3の手順に従って、胚と負荷車両(例えば_、H2O)またはナノ粒子溶液を針に整列させます。
4. 目の後ろに1 mg/mLナノ粒子溶液の0.5 nLを注入し、ステップ3.5-3.6に記載されているように注射を続ける(図1B)。目の後ろのこの位置は毛細血管で富み、ナノ粒子が循環に入ることを可能にする。
5. 同様の手順に従って、移植されたHeLa細胞と(すなわち、コントロール)を有するもの(すなわち、コントロール)を用いてナノ粒子を胚に懸濁させるために用いた車両(例えば_、H2O)を注入する(図1A、C)。
6. 注射した胚を35.5°Cで全てインキュベートする。

5. ナノ粒子とがん細胞のイメージングと追跡

1. 0、30、60、90、120、180、および210分のナノ粒子の注入後に蛍光顕微鏡で注入された胚を調べ、その分布と癌細胞ターゲティングの程度を監視する。ナノ粒子による癌細胞の標的化は、試験したナノ粒子の種類に応じて、早ければ30分の注射後に観察することができる。
2. ピペット2~3胚をペトリ皿に入れ、希釈したMS222溶液(40μg/mL)を5滴加えて固定化します。胚が泳ぐのを止めたら、ほとんどの水を取り除いて、胚が横たわっているのを許します。
3. 細くて柔らかいブラシが付いたピペットを使用して胚を整列させ、前眼を前方に横たわり、片方の目だけが見えるように胚を整列させます。
4. 低倍率(2x)で胚を赤、青、明るいフィールドチャンネルで画像化し、胚全体を捕獲し、より高い倍率(6.4x)で繰り返して尾部を捕獲します。ナノ粒子の出血を避けるために、赤いチャネルの下に胚を集中させます。
   注: イメージング中に胚が動かないようにしてください。動きは、ぼやけた画像と異なるチャンネルからの画像を重ねることができないにつながります。
5. イメージングの直後に胚に新鮮な魚の水を加え、インキュベーターに戻します。ステップ 5.2 ~ 5.4 を繰り返して、異なる時点で胚を画像化します。

結果

図 1のプロトコルの概略図は、この調査の全体的な手順を示しています。透明キャスパーオスおよびメスの成魚を飼育して胚を生成した(セクション1)。RFP+HeLa細胞を、48hpfでゼブラフィッシュ胚の膜膜腔下の血管化領域に注入し、未注入胚をコントロールとして(セクション3)。マイクロインジェクションで経験した個体では、胚の生存率が?...

ディスカッション

ここで説明するプロトコルは、ナノ粒子が転移性ヒト癌細胞を認識し、標的とする能力をテストするin vivoシステムとしてゼブラフィッシュを利用する。実験の成功に影響を与える要因がいくつかあります。まず、胚は48 hpfで完全に発達する必要がある。胚の正しい発達段階は、ヒト癌細胞の移植に耐え、生き残ることを可能にする。48hpf未満の胚は、古くて発達した胚に比べて生存率が有意?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	KSE scientific	BMK-A1705
Borosilicate glass capillaries	World Precision Instruments	1.0 mm O.D. x 0,78 mm
Computer and monitor	ThinkCentre	X000335
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)	Corning	10-013-CV	sold by Fisher
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F0926
Fish incubator	VWR	35960-056
Hemocytometer	Fishersci brand	02-671-51B
Magnetic stand	World Precision Instruments	M10
Microloader tip	Eppendorf	E5242956003	sold by Fisher
Micromanipulator	Applied Scientific Instrumentation	MMPI-3
Needle Puller	Sutter instruments	P-97
Olympus MVX-10 fluorescent microscope	Olympus	MVX-10
P200 tip	Fishersci brand	07-200-293
PBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1X)	Corning	21-030-CV	sold by Fisher
Petri dish	Corning	SB93102	sold by Fisher
Plastic pipette	Fishersci brand	50-998-100
pLenti6.2_miRFP670	Addgene	13726
Pneumatic pico pump	World Precision Instruments	SYSPV820
Pronase	Roche-Sigma-Fisher	50-100-3275	Roche product made by Sigma- sold by Fisher
Razor blade	Fishersci brand	12-640
SZ51 dissection microscope	Olympus	SZ51
Tricaine methanesulfonate	Western Chemicals	NC0872873	sold by Fisher
Trypsin-EDTA	Corning	MT25053CI	sold by Fisher
Tweezer	Fishersci brand	12-000-122