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このプロトコルは、CRISPR/Cas9遺伝子編集ツールで動作するように最適化された Culex quinquefasciatus 胚のマイクロインジェクション手順について説明します。この技術は、この研究対象疾患ベクターの遺伝的技術を構築するために使用できる部位特異的、遺伝性、生殖細胞系列突然変異を効率的に生成することができる。
キュレックス・キンケファシアトゥス は、鳥インフルエンザ、西ナイルウイルス(WNV)、日本脳炎、東方脳炎、リンパ系フィラリア症、セントルイス脳炎など、多様なベクター媒介性疾患のベクターです。特に、鳥類マラリアは多数の固有の島鳥類種の絶滅に大きな役割を果たし、WNVは米国で重要なベクター媒介性疾患となっています。 C.キンケファシアトゥス 生物学に関するさらなる洞察を得て、その遺伝的制御ツールボックスを拡大するためには、この種のゲノム工学のためのより効率的で手頃な価格の方法を開発する必要があります。しかし 、Culex 蚊、特に卵のいかだに特有の生物学的形質の中には、ゲノム工学に必要なマイクロインジェクション手順を実行することが困難になっています。これらの課題に対処するために 、Culex 蚊のユニークな特性に関連する技術的障害を軽減することに焦点を当てた最適化された胚マイクロインジェクションプロトコルを開発しました。これらの手順は 、C.quinquefasciatus でのマイクロインジェクションを成功させるために不可欠な卵の収集、卵いかだの分離、その他の取り扱い手順に最適化された方法を示しています。CRISPR/Cas9ゲノム編集技術と組み合わせることで、高度なゲノム工学を行い、現在研究されていない疾患ベクターで遺伝子制御技術を開発するために必要な、部位特異的で効率的で遺伝性の生殖細胞系列突然変異を達成することができます。
C.キンケファシアトゥスは、一般に南部の家の蚊として知られており、西ナイルウイルス(WNV)、日本脳炎、セントルイス脳炎、および東方脳炎を含む多数の病原体の有能なベクターです。特に、1999年にニューヨークで初めて検出されて以来、WNVは米国大陸全体で主要なベクター媒介性疾患となり、1999年から2018年の間に約2,300人が死亡し、2008-201920092年の間に報告された馬の症例は4,500人を超えています。さらに、北米で見つかった少なくとも23種の鳥類は、WNV3の結果として回復不可能と分類される少なくとも12種のWNV感染の影響を受けている。WNVがヒト、馬、鳥類集団に及ぼす影響は、そのベクターの日和食摂食行動によるものです。通常、鳥はWNVの主要なホストであり、人間と馬は偶発的または行き止まりのホストです。C.キンケファシアトゥスによってベクター化されたいくつかの病原体は、鳥類マラリア原虫、マラリア原虫などの鳥類にのみ感染する。ハワイでは、C.キンケファシアトゥスは鳥類マラリアの主要なベクターであり、多くの在来鳥種4、5の絶滅を引き起こしている。
C.キンケファシアトゥスによって伝染する疾患を制御するために、研究者およびベクターコントロール機関は、殺虫剤用途6のような一般的に確立された蚊集団制御ツールを使用してきたが、これらの方法は、種特異的ではなく、高価であり、殺虫剤に対する耐性が多くのC.キンケファシアトの集団6、7、8、9で高いため、限られた有効性を有する。ウォルバキア系集団制御戦略などの他の制御技術は近年10,11に開発されているが、ウォルバキア感染に伴うフィットネスコストは、このベクター12に対するこのアプローチの実現可能性を制限している。また、Aedes aegypti13、14、アノフェレスガンビア15、アノフェレス・ステファシ16などの他の蚊種で開発された遺伝子ベースの制御方法もあり、病原性蚊17、18、19の開発を含む、 C.quinquefaiatusのために開発される可能性があります。 この種のために開発されました。しかし、C.キンケファシアトゥス生物学は、このベクターで同様の遺伝技術の開発を困難にしている他のAedesおよびアノフェレス蚊ベクターとは大きく異なります。CRISPRベースのゲノム工学技術の出現により、精密なゲノム工学はますます些細で手頃な価格で適応可能になり、その結果、多種多様な種で新しい遺伝子ツールの開発につながっています。
CRISPRベースの技術で変異を生成するために、Cas9タンパク質と合成ガイドRNA(sgRNA)の混合物を、所望の遺伝子座と相補し、プレブラスタードドミルム期胚にマイクロインジェクションする。C.キンケファシアトゥスメスは、個々の卵子をオビジケートするのとは対照的に、浮遊いかだ構造(図1)に付着したグループで卵を産むので、この種では胚の微小注射がますます複雑になっている。カレックス幼虫は、水面に接触している各卵の前側からも出てくる(図1)ので、卵の向き後操作がこの種では重要である。ここでは、C.キンケファシアトゥス胚へのCas9タンパク質およびsgRNAのマイクロインジェクション用に設計された詳細なプロトコルについて説明する。このプロトコルは、タイムリーな卵の収集と卵の生存のための重要な特定のステップを通じて胚の生存率とゲノム突然変異率を改善するために、Culex生物学に特有の形質を収容するように設計されています。
1. C. クィケファシアトゥス コロニー飼育
2. C.キンケファシアトゥス プレブラコデドム期胚の収集
3. C.クムケファシアトゥスプレブラスターデドム期胚のアライメント
4. マイクロインジェクション用の針の準備
5. 注入混合物のロード
6. マイクロインジェクションのセットアップ
7. 胚マイクロインジェクション(図2G)
8. 胚の回復と孵化
9. ゲノム改変のスクリーニング
以前に公開された実験では、この方法は、暗い目の色素沈着の発達に重要な遺伝子の体細胞性および生殖細胞系列突然変異を正常に生成するために使用された、白色(CPIJ005542)30(表1)。CRISPR/Cas9は、注入された個体のプパルステージ目における色素沈着の喪失をスクリーニングすることによって採点した(G0)。体細胞変異は一般に、一部の細胞が変異表現型を有するが、その一部が変異型であるモザイク表現型として存在していた。例えば、白色遺伝子の体細胞変異は、色素沈着を欠く表現型を有するオマチディアと、野生型色素性表現型30との混合物をもたらした。しかし、白い遺伝子の生殖系列変異があった場合、次の世代(G1)は完全な白目表現型を受け継いだ。生殖細胞系列突然変異率は、モザイクG0個体を交交し、完全に白い目の子孫に対して得点することによって決定した(G1)。これらの実験結果は、胚生存率が64%から82%、ならびに37%〜57%の体細胞性突然変異誘発率および>61%の生殖細胞系変異生成率をもたらした(表1)。同じ遺伝子内の複数の遺伝子を標的とするsgRNAを多重化することにより、体細胞および生殖細胞系列突然変異誘発率は86%まで上方に増加した(表1)。さらに、多くの世代のために、白い突然変異体の実行可能なホモ接合株は、実験室で正常に保持されています。
図 1:C.キンケファシアトゥス 卵いかだと単一卵形態
D.D.Cキンケファシアトゥス卵いかだのドーサル(A)、横(B)、腹側(C)の眺め。C.キンケファシアトゥスメスは、より球根の前側が水面から離れて指差された後方に水面に触れて卵を産む(D)。A-前者;P-後部この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:マイクロインジェクションによる C.クィクケファシアトゥス 変異体の作成用のタイムライン
C.キンケファシアトゥスコロニー調製と微小注射のための胚コレクションの年表(A-D)。次いで、採取した卵が分離され(E)同じ向きに整列し、ハロカーボン油(F)で覆われる。卵を注入し(G)、ハロカーボンオイル(H)を除去する前に最低5分間休ませる。卵は、孵化のためにきれいな水源(I)に移され、突然変異型(K)のスクリーニングを受ける。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
生存 | 体的モザイク (G0) | 生殖細胞系突然変異誘発(G1) | ||||||
スグRNA | #injected | ♂ | ♀ | 合計 (%) | ♂ | ♀ | 合計 (%) | G1 変異体 (%) |
wsgRNA-1 | 50 | 15 | 20 | 35(70) | 7(47) | 13(65) | 20(57) | 128(69) |
wsgRNA-2 | 50 | 9 | 32 | 41(82) | 3(33) | 12(38) | 15(37) | 51(61) |
wsgRNA-3 | 50 | 17 | 15 | 32(64) | 7(41) | 8(53) | 15(47) | 157(72) |
wsgRNA-1/wsgRNA-2 | 50 | 7 | 16 | 23(46) | 5(71) | 12(75) | 17(74) | 123(79) |
wsgRNA-1/wsgRNA-3 | 50 | 13 | 9 | 22(44) | 10(77) | 6(67) | 16(73) | 72(81) |
wsgRNA-2/wsgRNA-3 | 50 | 17 | 10 | 27(54) | 13(76) | 8(80) | 21(78) | 101(85) |
wsgRNA-1/wsgRNA-2/wsgRNA-3 | 50 | 11 | 10 | 21(42) | 9(82) | 9(90) | 18(86) | 149(86) |
表1:白を標的とする単一および多重化gRNAを注射した胚の生存率および突然変異率。テーブルは30からの許可を得て再印刷されます。
最近、蚊ベクター制御のための遺伝子操作ツールを生成する取り組みでは、一般的な蚊病ベクターの胚マイクロインジェクションプロトコルを開発し、最適化する必要があります。 Aedes と Anopheles 蚊のための方法が開発されていますが 、Culex のために特別に設計されたプロトコルは最小限に探索されています。一般に、蚊の胚の注入プロトコルは、3つの一般的なステップに分けることができます:1)胚の採取と準備、2)胚注射、および3)注射後の回復。突然変異体を正常に生成するには、3つのステップすべてをターゲット種に最適化する必要があります。胚マイクロインジェクションのためのこの改変されたプロトコルは 、Culex 蚊のゲノム工学に成功した場合に特異的である。
胚の採取を最大化することは、胚微小注入プロトコルにおける一般的なボトルネックである。短時間で採取される卵の数を増やすために、蚊は血液食後2〜3日間、卵子基質から制限された。 C.キンケファシアトゥス は、哺乳類の源や哺乳類の血液を供給する膜とは対照的に、鳥類の血液源を好む傾向があることに注意することが重要です。しかし、多くの研究者は、血液供給のための生きている鳥類や鳥類の血液の信頼性の高い供給源を取得することが困難であるため、実験室の在庫は、よりアクセスしやすい血液源を供給するために適応することができます。また 、C.キンケファシアトゥス および他のほとんどの Culex ベクターにオビポジションキューを提供するため、オビポジション基質に栄養豊富な水を使用することも重要です。栄養豊富な水を生成する多くの方法があり、マイクロインジェクションに適切な数の卵が利用可能であることを確認するために、ラボ間で最適化する必要があります。例えば、この方法は5日以上の脱イオン水で発酵したウサギの便で最も成功したが、他の研究者は、栄養源として草や魚の食物でより多くの成功を収めているが、蒸留水21でもいくつかある。
Culex蚊はいかだに卵のグループを産むので、卵を集めるのはかなり簡単です。卵は、ペイントブラシでいかだ全体をすくうことによって単に収集することができます。卵の分離はより複雑ですが、正常な注射には不可欠です。卵は、ペイントブラシや鉗子で卵の間に穏やかな下降圧力をかけることで、いかだから慎重に分離することができます。いくつかの練習では、複数のユーザーが確実に卵のいかだから単一卵を分離することができました。各卵を分離した後、卵は両面付き粘着テープ上で同じ向きに整列し、マイクロインジェクション中に卵を安定させる。卵は先細りの後端に注入され、ハロカーボンオイルの添加は、操作中に卵を湿らせた保ちます。
マイクロインジェクション中の胚の損傷を制限するには、注射針が適切な強度を持ち、適切な角度でベベブする必要があります。50°の角度で10秒間ベベにされたアルミノケイ酸針は最良の結果を得ましたが、ボロシリケート針とクォーツ針も機能しますが、耐久性が低く、より高価である可能性があります。さらに、適切な針のベベルはCas9およびsgRNA混合物のよりよい流れを促進し、胚へのより容易な浸透のためのより鋭いポイントを作成する。多くの場合、ベベルは詰まった針を交換するのに時間と労力を費やすのではなく、詰まった針を素早く固定する効率的な方法でもあります。
注射後、卵は少なくとも5分間邪魔されず、ハロカーボンオイルはきれいな絵筆で軽くブラッシングしてすぐに取り除かれます。ハロカーボン油の除去後、注入された卵は、通常、注射後3日以内に発生する孵化するために水に入れることができます。練習と卵の十分な数で、このプロトコルは 、C.キンケファシアトゥス で一貫した体細胞および生殖細胞系列突然変異を達成することができ、他の Culex 蚊に容易に適応可能であるべきであるほど汎用性があります。
何一つ
この作業の一部は、O.S.Aに向けられたUCSDスタートアップファンドによってサポートされました。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
9 oz clear plastic pet cup | Karat | C-KC9 | Insect Rearing and Egg Collection |
Aluminosilicate glass capillary tubing 1mm(outside diameter) X 0.58mm (inner diameter) | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Microinjection, borosilicate and quartz needles could also be used but we prefered aluminosilicate |
Blood | Colorado Serum Company | 31025 | The colony took multiple generations to adapt to this blood source. Other blood sources are likely just as appropriate. See protocol notes on blood source selection. |
Bugdorm | Bugdorm | 4F2222 | Insect Rearing Cage |
Cas9 Protein with NLS | PNABio | CP01 | Microinjection |
Compound Microscope | Olympus BX41 | Microinjection, for embryo injection | |
Diamond abrasive plate (0.7u to 2.0u tip sizes) | Sutter Instruments | 104E | Microinjection, to be used with beveler |
DNase/RNase-Free distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | Microinjection |
Double-sided Tape | Scotch | B084NVQGXD | Microinjection, embryo alignment |
Femtojet 4x or 4i programmable microinjector | Eppendorf | Microinjection | |
Femtotips Microloader tips | Fisher Scientific | E5242956003 | Microinjection |
Filter Paper | Whatman | 1001-090 | Microinjection, embryo collection |
Fine-tip paintbrush | ZEM | 2595 | Microinjection, embryo alignment |
Halocarbon oil 27 | Sigma-Aldrich | H8773 | Microinjection, embryo alignment |
Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | Microinjection, embryo alignment |
Hemotek | Hemotek | PS5 | Line Maintenance |
Microelectrode Beveler | Sutter Instruments | BV10 | Microinjection, needle beveling |
Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 or P-2000 | Microinjection, needle pulling |
Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-A3 | Microinjection, embryo alignment |
Non-Drying Modeling Clay | Jovi | B0025Z71IM | Microinjection, needle storage |
Stereo Microscope | Olympus | SZ51 | Microinjection, for embryo alignment |
Sugar | Domino | 20% sugar solution for adult sugar source. | |
T7 Endonuclease I | NEB | M0302 | Preparation of microinjection materials |
TOPO TA Cloning Kit | ThermoFischer Scientific | K451020 | Preparation of microinjection materials |
Ultra-fine tip forceps | Fisher Scientific | 16-100-121 | Microinjection, embryo alignment |
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