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要約

ここでは、エプスタインバーウイルスで内因的に発現するRYR1変異の機能的効果を研究するために用いられる方法について、ヒトBリンパ球および筋生検由来衛星細胞をミオチューブに分化した不死生のヒトリンパ球が説明されている。

要約

RYR1遺伝子の700以上の変異体は、悪性温熱療法感受性、コアミオパシーおよび中心核筋症を含む異なる神経筋障害を有する患者において同定されている。RYR1突然変異に関連する多様な型素型のために、将来の治療介入のために患者が運んだ変異体を分類し、非病原性変異体を同定するために、その機能的効果を特徴付けるのが基本である。多くの研究室では、患者の細胞に発現するRYR1変異を機能的に特徴付ける方法の開発に関心を持っています。このアプローチは、多くの利点を有する:変異が内因的に発現し、RyR1は過剰発現せず、異種のRyR1発現細胞の使用は避ける。しかし、患者はRYR1を除いて異なる遺伝子に変異を提示する可能性があるため、同じ突然変異を有する個体の生物学的物質の結果を、異なる遺伝的背景を有する場合に比較することが重要である。本稿は、(a)エプスタインバーウイルス不死化ヒトBリンパ球および(b)筋肉生検に由来する衛星細胞および筋管内に分化された、内因的に発現したRYR1変異体の機能的効果を研究するために開発された方法を説明する。次に、薬理学的なRyR1活性化剤の添加によって引き起こされる細胞内カルシウム濃度の変化をモニターする。選択した細胞タイプには、レシオメトリック蛍光カルシウム指標がロードされ、細胞内[Ca2+]変化は、蛍光顕微鏡検査によって単一細胞レベルまたは分光蛍光計を用いた細胞集団のいずれかで監視される。休息[Ca2+]では、アゴニスト用量応答曲線を、健康なコントロールからの細胞と、特定の変異体の機能的効果に関する洞察をもたらすRYR1変異体を有する患者との間で比較される。

概要

現在までに700以上のRYR1変異体がヒト集団で同定され、悪性温熱症感受性(MHS)、運動誘発横紋筋融解症、中核疾患(CCD)、マルチミニコア病(MmD)、心筋症(CNM)1、2、3を含む様々な神経筋疾患に関連している;しかし、その機能効果を特徴付ける研究は遅れており、突然変異の約10%だけが機能的にテストされている。異なる実験的アプローチを使用して、特定のRyR1バリアントの影響を評価することができます。 WTおよび変異体RYR1 cDNA4、5に対するプラスミドコードを有するヘクロスミドおよびCOS-7細胞などの異種細胞のトランスフェクションを含む、WTおよび変異型RYR1 cDNAをコードするプラスミドおよびベクターを用いた異端マウス線維芽細胞の導入、続いてmyo-DとのトランスダクションとmyoTubetubeへの分化、変異体RyR1s7、8、9を担持するトランスジェニック動物モデルの生成は、10、11、12の内在的にRYR1変異体を発現する患者からの細胞の特徴付けである。このような方法は、異なる突然変異が機能的にRyR1 Ca2+チャネルに与える影響を確立するのに役立っています。

ここでは、RYR1変異の機能的効果を評価するために開発された方法について説明する。細胞内カルシウム恒常性の様々なパラメータは、ヒト細胞において、ミオチューブやエプスタインバーウイルス(EBV)を含む、YR1カルシウムチャネルを内発的に発現し、Bリンパ球を不死化した。細胞は患者から得られ、培養中に拡大され、フラ-2またはインド-1などのレシオメトリック蛍光カルシウムインジクターを装填する。休養期[Ca2+]を含む病原性RYR1突然変異のために変化することが報告されているパラメータは、異なる薬理学的アゴニストに対する感受性および細胞内Ca2+ストアのサイズは、蛍光顕微鏡を用いて、または蛍光計を用いた細胞集団において、単一細胞レベルで測定される。突然変異担体から得られた細胞で得られた結果は、次いで、健康な対照ファミリーメンバーから得られたものと比較される。このアプローチは、(i)MHSに関連する多くの突然変異が休息[Ca2+]の増加につながり、4-クロロm-クレゾール10、11、12、13でKCl誘導脱分極または薬理学的RyR1活性化のいずれかに用量応答曲線の左へのシフトにつながることを実証した。(ii) CCDに関連する変異は、ライR1の薬理学的活性化によって放出されるピークの減少につながる [Ca2+] 細胞内Ca2+が12,13,14,15を格納する場合のサイズを減少させる;(iii) いくつかの変異体は、Ca2+ホメオスタシス13に影響を与えない。この実験的アプローチの利点は、RyR1タンパク質が過剰発現せず、生理学的レベルが存在し、細胞(筋肉細胞およびBリンパ球の両方)が変異を含む細胞株を提供することができる。いくつかの欠点は、患者がカルシウム恒常性および/または励起収縮結合(ECC)に関与するタンパク質をコードする複数の遺伝子に変異を運ぶ可能性があり、これは実験的結論を複雑にする可能性があるという事実に関連する。例えば、2つのJP-45変異体がMHSおよび対照集団において同定され、それらの存在は、ジヒドロピリジン受容体(DHPR)の感受性に影響を与える16を活性化する。患者は利用可能である必要があり、生物学的材料は新たに収集される必要があり、倫理的許可は地元の倫理委員会から取得する必要があります。

プロトコル

以下に説明するプロトコルは、エティッコムミッションノルトウェスト・ウント・ツェントラルシュヴァイツEKNZの倫理ガイドラインに準拠しています。

エプスタインバー不死化Bリンパ球細胞株の調製11

  1. インフォームド・コンセントの後、RYR1突然変異を運ぶプロビンから、および変異のない健康な家族からEDTA処理された無菌管に全血の30 mLを集める。
    注:すべてのソリューションを無菌に保ち、組織培養フードで作業してください。
  2. 密度勾配遠心分離媒体(例えば、フィコール・ヒパック、.077 g/L)によって全血から単核細胞を単離する。
    1. 50 mLの円錐形のチューブに30 mLの無菌血液を入れる。
    2. 密度勾配遠心分離培地を含むパスツールピペットの先端をチューブの底に置き、血液の下にゆっくりと密度勾配遠心分離培地溶液の無菌の20 mL無菌を置きます。
    3. 18°-20°Cで900 x g で30分間の遠心分離機、中断なし。
      注:単核細胞層は、密度勾配遠心媒体層と血小板濃縮プラズマを含む最上層との間相で白濁リングとして現れます。
  3. 滅菌ピペットを使用して、単核細胞(約3〜5 mL)を含む相間層を静かに取り除き、溶液をクリーンな50 mLの滅菌結腸管に移します。
  4. リン酸緩衝塩水(PBS)を20mL加えて細胞をすすいだし、遠心分離機を室温で600xgで10分間、PBSでペレットを再懸濁させた。合計 3 回繰り返します。これにより、すべてのメディアが確実に削除されます。
  5. 最後の洗浄後、細胞を組織培養培地(RPMI培地に10%の胎児子牛血清、2 mM L-グルタミン、ペニシリンおよびストレプトマイシン100単位を補充)に再懸濁させる。20 mLの組織培養培地を含むT125組織培養フラスコに単核細胞(約1 x106 細胞)を入れる。
  6. エプスタインバーウイルスで単核細胞に感染する。
    1. EBVの供給源としてB95.8細胞株培養物(-80°Cでストックされた102-103変換単位/mLを含む)の上清を使用してください。
    2. 20mLの組織培養培地中のステップ1.5から1 x106個 の単核細胞を再懸濁し、感染のためのシクロスポリンA(0.2 μg/mL最終濃度)の存在下でB95.8細胞株から2mLの上清に曝露する。
  7. フラスコを37°Cの細胞培養インキュベーターに入れ、細胞を増殖させます。1週間後に培地を変更する。
    注:B細胞が増殖し始めると、認識可能な塊を形成し、培養物を拡大して凍結できるように急速に成長します。
  8. EBV不死化Bリンパ球細胞株11 からゲノムDNAを抽出し、与えられた変異の有無を確認する。

2. 細胞内Ca2+ 測定

注:EBV形質転換Bリンパ球細胞株の細胞内カルシウム濃度の変化は、磁気スターラーとキュベットホルダーを搭載した分光器数計を37°Cに設定して、細胞集団で監視することができます。 あるいは、Ca2+の変化は、蛍光顕微鏡法により単一細胞でモニターすることができる。いずれの場合も細胞は、組織培養フラスコから除去され、クレブスリンガー溶液(140mM NaCl、5 mM KCl、1 mM MgCl2、20mM HEPES、1 mM NaHPO 4、5.5mMグルコース、pH7.41mM CaCl2を含む)で2回洗浄した。

  1. 分光フルオロメーター11,13,14を用いた細胞集団の実験
    1. クレブスリンガー溶液中の1 x 107 細胞/mLの最終濃度で細胞を再懸濁し、37°Cで30分間、最終濃度5 μM Fura-2/AMでインキュベートします。
    2. 遠心分離細胞は900 x g で10分間、2 x 106 細胞/mLの濃度でクレブスリンガー溶液中で再懸濁します。
    3. 最大速度で設定した磁気撹拌機を搭載した分光蛍光計を用いて蛍光変化(340/380nm)を測定し、37°Cに設定します。
    4. 実験の直前に、実験はマイクロ遠心分離機で5分間900 x g で細胞を回転させ、0.5 mM EGTAでクレブスリンガーの溶液の1.5 mLでペレットを素早く再懸濁したが、Ca2+は添加しなかった。
    5. 細胞を3mLガラス分光蛍光計キュベットに入れ、蛍光比(340 nm/380 nm励起、510 nmの発光)を記録します。
    6. 安定した基線(約30秒)を達成し、選択したRyR1アゴニスト(4-クロロm-クレゾール、または4-cmc)の濃度を加え、カルシウム過渡性を記録します。
      注:DMSOで作られた4-cmcの300 mMストック溶液は、開始試薬として使用されます。このソリューションは、事前に作ることができ、数ヶ月間-20°Cで保存します。
    7. 異なる4-cmc濃度の実験を行います。
      注:75 μM、150 μM、300 μM、450 μM、600 μM、750 μM ~ 1 mM を含め、[Ca2+]のアゴニストとの間の変化の線量応答曲線を生成します。異なる4-cmc濃度は、フルラ-2を装填した細胞を含むキュベットに、ストック溶液から4-cmcの適切な体積を加えることによって得られる。例えば、300 μM 4-cmc の最終濃度の場合、1.5 μL のストック溶液が、クレブスリンガーの溶液中の細胞の 1.5 mL を含むキュベットに添加されます。低アゴニスト濃度の場合、300 mMストック溶液はDMSOで75mMに希釈し、適切な容積はクレブスリンガー溶液中の細胞の1.5 mLを含むキュベットに加える必要があります。
    8. 細胞に400 nMのタプシガジンを加えて、細胞内店舗に存在するCa2+ の総量を計算する。ピーク Ca2+を記録します。
    9. 100%と考えられるタプシガルギンによって誘発されるピークカルシウムに対して、与えられた4-cmc濃度によって誘導されるピークカルシウムをプロットし、確率と健康な相対からの細胞を比較する4-cmc用量応答曲線を構築する
  2. 単一細胞の実験用13
    1. ポリL-リジンを滅菌H2Oで1:10希釈し、ガラスカバーリップを30分間前処理します。無菌組織培養フードの下で空気乾燥を可能にする。
    2. EBV形質転換Bリンパ球を1 mMCaCl2を含むクレブスリンガーの溶液中の1 x 106細胞/mLの最終濃度に再中断し、5 μMフラ2/AMの最終濃度を加える。
    3. ポリL-リジン処理カバースリップに1 mLの細胞を置き、37°Cで37°Cで加湿した細胞培養器を30分間インキュベートし、EBV細胞がロード中にガラスカバースリップにくっつくようにします。
    4. 灌流チャンバにカバースリップを置き、1 mM Ca2+を含むクレブスリンガーの溶液で(2 mL /分の速度で)灌流を開始します。
    5. 反転蛍光顕微鏡(40x油浸し物(0.17個の開口)を装備)、フィルタ(BP 340/380、FT 425、BP 500/530)を使用して、ソフトウェア制御電荷結合装置(CCD)カメラ取り付け具付きのオンライン測定を記録します。
    6. 一定の露光時間(340-nm励起波長の両方で100ミリ秒)で1秒間隔で画像を取得します。イメージングソフトウェアを使用して蛍光の変化を分析します。励起波長340および380 nm13の各セルの平均ピクセル値を測定する。
    7. 細胞刺激を達成するために、12バルブの細胞灌流刺激剤を使用し、4-cmcの異なる濃度を追加します。フラッシュバルブには、Ca2+ に加えて100 μM La3+ を加えたクレブスリンガーの溶液が含まれ、細胞内店舗からのカルシウム放出のみを監視します。
    8. 上記のように[Ca2+]における4-cmc対変化の用量応答曲線を構築する。

3. 筋肉生検10、12、15からのヒト筋管の調製

注:衛星細胞由来の筋芽細胞と筋管を得るために、さまざまな実験室で異なる方法が使用されています。以下はバーゼルで使用される方法の説明です。

  1. 無菌PBSで筋肉生検をすすぎ、余分な血液を除去し、約0.5〜1mmの小さな断片に切断する。
  2. インサートで6井戸組織培養料理を準備します。各井戸にヒトの筋肉成長培地の1.5 mLと各挿入物に人間の筋肉の成長培地の0.5 mLを追加します。
    注:成長培地は、高グルコースを有するダルベッコの修飾イーグル培地の500mL、または10%の馬血清、5 ng/mLインスリン、3mMグルタミン、600ng/mLペニシリンGおよびストレプトマイシン、および7mHEPES、p.7.4.p.4.p.p.4.p.4.p.4.p.4.p.4.4を含む。市販の骨格筋成長培地も使用できる。
  3. 各インサート(図1A)に2〜3個の小さな筋肉片を入れ、培養器を培養インキュベーター(5%CO2、37°C)に入れる。約8〜10日後に、人工衛星細胞が筋肉生検の外に成長し、挿入物(図1、BおよびC、矢印)に取り付けられているのが見える。
  4. 十分な数の細胞を生検から放出(約10〜14日後)、トリプシン化するには以下のようにします。
    1. すべての培養培地を取り出し、1 mLのPBSで細胞を1回リンスし、0.5 mLのトリプシン/EDTA溶液(0.025%トリプシンおよび0.01%EDTA)を加え、37°Cで5分間インキュベートします。
    2. 細胞に1 mLの増殖培地を加えてトリプシンの効果を中和し、衛星細胞を新しいT25細胞培養フラスコに移す。3 mLの増殖培地を加え、細胞を細胞培養インキュベーター(5%CO2、37°C)に入れる。
    3. 次の日に成長培地を変更してEDTAを削除し、その後週に1回培地を変更します。
  5. 筋芽細胞が約75%コンフルエントである場合、トリプシン化し、ラミニン処理ガラスカバースリップに移します。
    注:1つのT25フラスコで成長する細胞は、直径43mmのラミニン処理ガラスカバースリップに移す必要があります。ガラスカバースリップは、3 mLの成長培地を含む直径60mmの組織培養プレート内に配置する必要があります。
  6. 培養インキュベーター(5%CO2、37°C)でガラスカバースリップ上の細胞を培養培養器(5%CO2、37°C)で増殖させ、培地を週1回変化させる。90%の合流度で、次のように構成される分化培地に切り替える:高グルコースDMEM(4.5mg/mL)、0.5%ウシ血清アルブミン、 10 ng/mL 表皮成長因子、0.15 mg/mL クレアチン、5 ng/mLインスリン、200 mM グルタミン、600 ng/mL ペニシリン Gおよびストレプトマイシン、および 7 mM HEPES、pH 7.4)。市販の分化培地も使用することができる。分化媒体を週に1回変更します。
  7. 分化培地で7〜10日後、多核化ミオチューブが見える。以下に説明するとおり、1週間以内に[Ca2+]の変更を評価します。

4. [Ca2+]I比測定は、Fura-2で測定

  1. DMEMで37°Cで30分間希釈したFura-2/AM(最終濃度5μM)で、ガラスカバースリップを成長させたミオチューブをロードしました。 簡単に言えば、ガラスカバースリップ成長細胞から分化培地を取り出し、2 mL新鮮な分化培地を加える。1 mMのストック溶液から10 μLの相良い-2 AMを加え、培養インキュベーター(5%CO2、37°C)で30分間インキュベートします。
  2. ガラスカバースリップを灌流チャンバーに移し、2 mM CaCl 2を含むクレブスリンガーの溶液で細胞をすすい込みます。
  3. 20x水浸水のFLUAR目標(0.17数値開口)を使用して、EBV単細胞セクションで上述したとおりに、オンライン[Ca2+]測定を行います。

結果

[Ca2+] EBV不死化Bリンパ球の集団におけるi測定
原発性Bリンパ球は、B細胞抗原受容体刺激シグナル伝達プロセス中にCa2+放出チャネルとして機能するRyR1アイソフォームを発現する。EBVを用いたB細胞の不死化は、遺伝学者が患者のゲノム情報を含む細胞株を得るために日常的に使用される...

ディスカッション

本論文に記載されているプロトコルは、いくつかの研究所で、カルシウム恒常性に対するRYR1変異の影響を研究するために有効に活用されている。この論文で概説されているアプローチの重要なステップは、生物材料の無菌性、細胞培養技術および技術および入手可能性を扱う。原則として、EBV不死化Bリンパ球の使用は、より簡単であり、変異型RyR1チャネルを含む細胞株を生成することを可?...

開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この原稿に記載されている研究は、スイス国立科学財団(SNF)とスイスマッスル財団からの助成金によって支えられました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
4-chloro-m-cresolFluka24940
Blood collection tubesSarstedt172202
Bovine serum albumin (BSA)Sigma-AldrichA7906
caffeineMerk102584
Cascade 125+ CCD cameraPhotometrics
Cascade 128+ CCDPhotometrics
CreatineSigma-AldrichC-3630
DMEMThermoFisher Scientific11965092
DMSOSigma41639
EGTAFluka3778
Epidermal Growth Factor (EGF)Sigma-AldrichE9644
Ficoll PaqueCytiva17144002
Foetal calf serumThermoFisher Scientific26140079
Fura-2/AMInvitrogen Life SciencesF1201
GlutamaxThermo Fisher Scientific35050061
HEPESThermoFisher Scientific15630049
Horse serumThermo Fisher Scientific16050122
InsulinThermoFisher ScientificA11382II
IonomycinSigmaI0634
KClSigma-AldrichP9333
LamininThermoFisher Scientific23017015
LanthanumFluka61490
Microperfusion systemALA-ScientificDAD VM 12 valve manifold
Origin SoftwareOriginLab CorpSoftware
Pennicillin/StreptomycinGibco Life Sciences15140-122
Perfusion chamber POC-RPecon000000-1116-079
poly-L-lysineSigma-AldrichP8920
RPMIThermoFisher Scientific21875091
SpectrofluorimeterPerkin ElmerLS50
ThapsigarginCalbiochem586005
Tissue culture dishesFalcon353046
Tissue culture flaskFalcon353107
Tissue culture insertsFalcon353090
Trypsin/EDTA solutionThermoFisher Scientific25300054
VisiviewVisitron Systems GmbHSoftware
Zeiss Axiovert S100 TV microscopeCarl Zeiss AG
Zeiss glass coverslipsCarl Zeiss AG0727-016

参考文献

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