臨床関連性とメカニズムを調べる研究のためのモデルを用いたラットの短期間低体温誘導

要約

この記事では、ラットにおける全身短い期間低体温症誘導の2つの方法について説明します。第1の、急速な誘導法は、温度の急激な低下のためにファンおよびエタノールスプレーを使用してアクティブ冷却を採用する。第2の方法は、徐々に冷却する方法である。これは、イオブルラン麻酔と家庭性ヒートマットの温度設定の低下の組み合わせを使用して達成されます。これは、任意の外部冷却装置を使用せずにコア体温の緩やかな低下をもたらします. 

要約

治療低体温症(TH)は、神経疾患の前臨床試験で神経保護のための堅牢な証拠を提供している強力な神経保護戦略です。強力な前臨床証拠にもかかわらず、THはほとんどの神経疾患の臨床試験で有効性を示していない。治療低体温症を採用した唯一の成功した試験は、成人の心停止および新生児における低酸素虚血性傷害に関連していた。その使用のパラメータに関するさらなる調査、および前臨床研究と臨床研究の間の研究設計比較が保証される。この記事では、短い期間の低体温誘導の2つの方法を示します。第1の方法は、エタノールスプレーおよびファンを使用してラットでの急速な低体温誘導を可能にする。この方法は、臨床試験ではあまり一般的に使用されておらず、異なる生理学的効果を有する可能性がある皮膚を冷却することによって機能する。冷却は、表面積と体積比の違いにより、ヒト患者で達成可能であるよりもはるかに迅速です。これに伴い、第2の方法も提示され、短期間低体温症の臨床的に達成可能な冷却速度を可能にする。この方法は、実装が容易で、再現性があり、アクティブな皮膚冷却を必要としません。

概要

THは、臓器/システム^1、2の生存率と機能を維持するために、身体または脳温度を冷却する練習です。神経保護における低体温症の役割は、脳卒中^3、くも膜下出血^4、外傷性脳損傷5などの神経疾患の前臨床モデルの範囲で利点を示^{している。}臨床応用の面では、THは心停止後および新生児低酸素虚血性傷害の患者に有効性^{を示している6。}

TH誘導は、表面または血管内冷却法のいずれかを使用して達成される。臨床前の低体温研究の大部分は、動物の毛皮に水またはエタノールを塗布するか、または冷却毛布を使用して目標温度¹を達成することによって表面冷却を行う。人間では、氷パックと冷却毛布^7、8を使用して、全身表面冷却を達成する。より迅速な冷却は、内科の方法を使用して患者で示されている, 静脈内または動脈内カテーテルを介して冷たい生理食類の誘導注入を結合する, 下の静脈内の血管冷却装置の配置^{と 9,10.}例えば、患者11の表面冷却を有する3-4時間と比較して、血管内冷却で3.5時間で中程度の目標温度^を1.5°Cに達することができる。また、この血管内アプローチは、震え^12,13などの全身表面冷却に見られる副作用の一部を低減することが報告されているため^、近年より一般的になっている。ヨーロッパの多施設、虚血性脳卒中の低体温症の無作為化第III相臨床試験(EUROHYP-1)は、主に表面冷却¹⁴を使用する。この試験から最近発表された結果は、震えが大きな合併症であり、目標温度¹⁰を達成する能力が限られている可能性があることを示した。震える反応は、主に皮膚温度によって駆動することが知られている。げっ歯類の血管内冷却方法¹⁵を開発するためにいくつかの努力がなされているが、ヒトで使用される技術と比較して技術の非常に侵襲的な性質は、そのモデルから得られた任意の結果を混乱させるリスクがある。

温度は体内の生物学的プロセスの主要な変調器であり、恒常性によって厳しく調節される。したがって、体温の操作は、関連するリスクを持つことができます。冷却期間は、低体温臨床試験の成功を制限している可能性がある要因です。これらの試験は、24-72 h¹¹から低体温を維持する多くの時間の冷却方法を使用します。この延長期間は、冷却プロトコル中に感染のリスクをもたらします.肺炎は低体温症の最も一般的な合併症であり、処置¹³を受ける患者の40〜50%の間に影響を及ぼす。これは、短い期間のパラダイムが使用される低体温症の動物実験で通常見られるものとは対照的である(1-6 h)³.これらの前臨床試験の成功は、臨床試験での使用のための短期間低体温症の適応をもたらす可能性が高い.その結果、将来の臨床試験の冷却速度に似た短期間低体温症の動物モデルを持つ必要があります。他の温度パラメータに関する詳細と短期間低体温症の有効性は、いくつかのレビュー記事^{1、16、17、18}で議論されています。

ここで実証されている冷却の緩やかなモデルは、現在の実験的低体温モデルよりも臨床的に達成可能です。この新しい方法は、冷却速度がはるかに遅いため、目標温度までの時間は低体温¹¹の臨床試験で見られる範囲に近い。また、直接表面冷却を回避し、これは特定の生理学的効果を有し、したがって、臨床試験^9、12において最も一般的に使用されている冷却方法である血管内冷却に匹敵する可能性がある。このモデルは動物が2時間にわたって徐々に冷却され、その後、目標温度での維持の短い期間を続けることを可能にする。また、急速冷却短期間低体温法¹⁹も実証されている。急速冷却法により、低体温発症後に目標温度を迅速に達成することができます。このアプローチは徐々に冷却する方法ほど臨床的に関連していませんが、低体温症の神経保護のメカニズムを探求し、薬理学的に強力な神経保護効果を模倣することを目的とした研究に有用です。この方法はまた、神経科学の外で潜在的な用途を有し、任意の数の前臨床試験に適応することができる。他のアプローチと比較して両方の方法のもう一つの利点は、彼らが安価であり、専門の機器を必要としないことです。最後に、このプロトコルはまた、温度データロガーの移植を示し、術後の温暖化とそのモニタリングは不注意な術後低体温症を防ぐために重要であり、研究結果²⁰を混乱させる可能性を有する。

プロトコル

すべての実験手順は、科学的目的のための動物のケアと使用のためのオーストラリアの実践規範に従い、ニューカッスル大学の動物ケアと倫理委員会(A-2013-343およびA-2020-003)によって承認されました。以下に説明する低体温誘導法に加えて、以下のプロトコルは、低体温症と併せて日常的に行われる:血圧および心拍数²¹を監視する大腿線カンヌレーション、および実験的なストローク^22。

1. データロガーの移植

注:このプロトコルで使用されるデータロガーデバイスは、体温のリアルタイムの読み取り値を提供することはできませんでした。データロガーは、動物から削除され、コンピュータに接続されている後に読み出しが可能です.その結果、直腸温度プローブは、冷却および再ウォーミングプロセス中にリアルタイムの情報を提供するために使用されます。さらに、処置の間に動物が置かれる外科ヒートマットは直腸の調査システムによって調節されるので、直腸の調査はこの方法にも不可欠である。データロガーはまた、自由に動く、目を覚ますラットで温度データを提供する貴重な目的を提供し、再温暖化後に正常な体温が維持されることを保証するために重要です。したがって、このプロトコルでは、両方の温度監視デバイスが重要です。

1. イソフルラン(誘導の場合は5%、メンテナンス用に2〜2.5%)と10-12週齢の雄の繁殖ウィスターラットを50%N2および50%O2混合物で麻酔する。
2. 誘導後、ラットを手術用ヒートマットの上に置く。
3. 鼻が鼻コーンに座るようにラットを置きます。ガスが逃げないように、外科用テープで鼻を固定します。
4. 右下腹部から毛皮を剃り、局所麻酔薬、ブピバカイン0.2mL、0.05%で皮下注射する。
5. 剃りたての地域に消毒液を塗布します。
6. 滅菌された外科用具を使用して右腹部領域に沿って2cmの縦切開を行い、右太ももの近位にする。切開部を腹側大腿折り目の空間を露出させるのに十分な深さにします。
7. 止まりと鉗子を使用して、デバイスを保持するのに十分な大きさの皮膚の下に「ポケット」を作成します。
8. 温度監視データロガーデバイスをポケットに挿入し、5-0シルク縫合糸を使用して筋肉と皮膚を閉じます。ここで説明する皮下法は、侵襲性が低く、処置後のより良い回復を可能にするので、腹腔内法に好ましい。
9. データロガーと直腸プローブが温度監視のために交差較正されていることを確認します(説明を参照)。
10. データロガーは、温度の測定値に影響を与えるため、挿入後に動物のヒートマットに対して休んでいないことを確認します。

図1:データロガー装置の移植(A)左から右へのパネルは、ラットの下腹部の右側に約2cmの切開が行われていることを示す。(B)温度監視データロガーを、ポケット切開部に皮下に挿入した。(C)切開はナイロン縫合糸で閉じた。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

2. 能動性(速い)低体温症の誘発

1. 低体温症の設定 ( 図 2を参照)。ラットの体の両側にクランプ付きの2つのレトルトスタンドを置きます。
2. 各レトルトスタンドに60mm 12 v/130 mAファンを取り付け、ファンがラットの腰に向かっていることを確認します。クランプとラットの間の距離は約20cmです。使用するファンの速度は4,000 rpmである必要があります。
3. 動物のヒートランプを側面または第3のレトルトスタンドで準備してください。
4. 所望の目標温度に動物のヒートマットを調節することによって低体温を開始します。この例では、32.5 °Cが目標温度(温度制御部の3.75)です。
5. 両方のファンをオンにし、ラットの腰部に70%エタノール(標準プラスチックスプレーボトル)の4つのスプレーに3を適用します。より速い冷却誘導のためにスプレーするときのフリル動物の毛皮。
   注:エタノールは、蒸発速度が速いため、より迅速な低体温誘導をもたらすため、水よりも好ましい溶液として使用されます。
6. これは、目標温度のオーバーシュートに寄与することができるので、毛皮を過飽和にしないように注意してください。
   注:ファンはエタノールの蒸発と冷却プロセスを加速します。
7. ラットの直腸温度を注意深く見ながらエタノール塗布の間に短い間隔をとおします。
8. 直腸温度が目標温度の1°C以内に達したら、エタノールのそれ以上の適用を中止してください。
9. 目標温度(この場合は33°C)の0.5°C以内に到達したら、両方のファンをオフにします。
   注:目標温度に達する前にファンをオフにすると、ラットが必要な温度を超えて過剰に冷却するのを防ぐことができます。
10. 温度を32.5 °Cに下げる。
    1. 過度に冷却が発生した場合は、動物のヒートランプを使用して、動物をターゲットに戻して軽度に温めます。1 つのファンの支援を使用して、オーバーシュートの再ウォーミングを防ぐことができます。
11. 目標温度に達して安定したら、温度を監視し続けます。温度は通常、スプレー、ファンの使用やヒートランプの使用を必要とせずに低体温期間の残りの部分のために非常に安定したままになります。
12. 低体温の終わりに動物を再暖めるために、ヒートマット温度を37°C(この例で使用されている温度制御ユニットの6)に戻し、動物が30分にわたって熱調節できるようにします。
    注: 温度制御装置の温度設定は異なる場合があり、したがって、個々のデバイス上の目標低体温およびノルテルミアの設定を決定するために必要な場合があります。

3. 活性皮膚冷却を伴わない臨床的に達成可能な徐々発症低体温の誘導

1. コア温度調節家庭温マットの温度を必要な目標温度まで少しずつ下げることにより低体温を達成。図示例(図3B)では、30分ごとに1°C増分が使用された。
2. 所望の期間にわたって目標温度に動物を冷却する(記載した例では2時間)。冷却したら、目的の間隔でターゲットを維持します。通常、所望の目標温度に設定された家庭温マット上に維持される場合、それ以上の介入は必要ありません。
3. 麻酔は、コア体温の正常な調節を防ぐので、このプロトコルで外部冷却は必要ありません。
   注:イオブルランの要件は低体温症で減少します。ほとんどの動物では、2%の開始イソフルラン濃度を0.1%単位で0.1%ずつ1.5%に減少させ、安定した呼吸数(>50呼吸/分)、心拍数および血圧を維持し、反射応答の抑制を維持することができます。
4. 低体温後に動物を再温するには、ヒートマットを調整して、動物が所望の間隔で再ウォームできるようにします。例では、37°C(例で使用したFHC温度制御部の6)に単一の調整で再温暖化が30分の期間にわたって達成された。
   1. 動物の回復を必要とする長期的な研究では、動物が熱調節し、不注意な術後低体温症を避けるために、熱マットの上に半分置かれたケージに動物を保管してください。
   2. 直腸パラセタモール(250mg/kg)は、回復および排卵夜の痛みの軽減のために投与することができる。皮下生理食液注射(2 x 1.5 mL)も、麻酔や手術による脱水症状を防ぐために与えることができる。

結果

図3A は、急速冷却アプローチを用いて、Wistarラットが低体温症にどのように反応するかを表す図である。低体温誘発はファンおよび70%エタノールスプレーの使用によって達成される。32.5°Cの目標に対する低体温は15分で達成される。目標温度を維持するために、ファン/ヒートランプとエタノールスプレーの使用との間で繊細な相互作用を確実にするために注意が必要です。 図3Aからわかるように、わずかな温度オーバーシュートが観察され、冷却が目標温度より約0.5°C以上で停止しない場合に発生する可能性があります。目標は維持され、30分の印で安定し、1.5時間で再暖めが開始される。

図3B は、目標温度を2時間で33°Cに到達し、2.5時間で再ウォーミングする前に30分間維持する段階的なプロトコルを示しています。ここでは、温度が昇温に達するために必要な持続時間を延長する増分で調整される。両方のグラフの垂直点線は、冷却の持続時間を表します。

図3A および 図3B は、データロガー装置から取得される。実験の開始時に、データロガーは、移植前に記録を開始するようにプログラムされています。実験の最後に、データロガーは動物から取り除かれ、USBポートを介して提供された温度リーダーに接続されます。ソフトウェア(例えば、e温度)は、データを読み取って生成し、スプレッドシートソフトウェアにエクスポートすることができます。

図2:急速冷却プロトコルのセットアップ(A)2つのファン(黒い矢印)がラットの下部の背部領域の上に位置していた。低体温症の開始時に、両方のファンをオンにし、エタノールスプレーを腰に塗布した。エタノールとファンの組み合わせは、目標温度を迅速に達成するために低体温を促進し、加速します。(B)低体温症のオーバーシュートを防ぐために、ヒートランプ(白矢印)を使用した。目標温度に達すると、熱灯を使用して、ラットのコア温度が低くなるのを防いだ。目標が安定したら、ヒートランプや残りのファンがオフになりました。

図3:活性(A)及び緩やかな(B)法を用いた低体温誘導法(A)活性冷却プロセスを用いて15分間に目標温度に達し、動物を再温する前に上記の例では60分間維持した。(B)徐々に冷却法を用いて2時間で目標温度に達し、動物を再温する前に30分間維持した。両方のグラフのシェーディング領域は、目標温度が維持された時点を表します。両方のグラフの点線の垂線は、全体の冷却時間を表します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

ここで説明する手順は、簡単に実装され、非侵襲的であり、望ましい目標温度にコア体温の信頼性と再現性の低下を提供します。

急速冷却法には、以下のようないくつかの重要なステップがあります。エタノールスプレーを過飽和にしないでください - これは結果を妨げるので、エタノールに動物を浸さないように注意する必要があります。低体温の誘導中に動物を監視する - 急速な低体温誘導に対する動物の反応を注意深く監視するために注意する必要があります。直腸温度の注意深い監視は、温度が望ましい目標を下回らないようにするために重要です - これが起こった場合、ファンをオフにし、ヒートランプが必要なターゲットに戻って動物を穏やかに再暖めることができるようにします。

いずれの方法においても、生理学的モニタリングは、麻酔薬の用量の適切な調整を確実に行うことが重要である。長時間の冷却のために、不十分な麻酔用量は、冷却の持続時間を延長する可能性があります。この場合、イオブルラン濃度は、適切な冷却速度が達成されるまで増加させることができる。もう一つの重要なステップは、温度デバイスのクロスキャリブレーションです。温度プローブ調整ヒートマットとデータロガーを同じ実験で使用する場合、2つのデバイスの記録された温度にわずかな変動がある可能性があるため、直腸プローブでデータロガーをクロスキャリブレーションすることがベストプラクティスです。

これらの方法は、神経疾患の潜在的な治療法として低体温症の使用を探求したい研究に適しています。研究の具体的な目的は、どの方法が使用されているかを決定する必要があります。どちらの方法も、全身的な表面冷却として分類できますが、2 番目の方法ではアクティブな冷却は必要ありません。上述の緩やかな冷却モデルは虚血性脳卒中治療における低体温症の使用に重要な潜在的な用途を有する。長期低体温症およびそれに伴う合併症は、高齢の脳卒中患者に課題をもたらす。さらに、震え応答は、一部の患者¹⁰において目標温度を達成することが困難になる。抗震薬は震える反応を減らすのに役立ちますが、短い期間の徐々に冷却すると、問題をより効果的に改善することができます。より短い冷却期間を有することも、試験でしばしば報告される肺炎の発生率を減少させる可能性がある。この短い期間の方法のもう 1 つの潜在的な利点は、長い期間の冷却と比較して、再温暖化の速度がそれほど重要ではない可能性があることです。梗塞が大きい脳卒中患者の長時間冷却の非常に初期の臨床試験では、速い再温暖化が頭蓋内圧(ICP)の大きな上昇につながり、結果が悪化し、しばしば致命的であることがわかりました。これにより、徐々に再温暖化パラダイムが開発され、冷却の全体的な期間がさらに延長されました。短い期間の冷却は、短期間だけ目標温度を維持し、リバウンドICPをもたらす可能性が低い可能性があります。ICP上昇に対する低体温処理を調査した以前の研究は、ここで説明したものと同様の急速な冷却および再温暖化プロトコルを用いて^、23,24を再温暖化した後のリバウンドICP上昇を示していない。

虚血性脳卒中治療のための低体温症の臨床試験は、実験的研究で報告されている低体温症の利点を翻訳することができていない.実験モデルと患者の間の冷却速度と持続時間の不一致は、この不一致を説明する重要な変数である。より良い冷却の臨床率に似ている低体温症の実験的モデルを持つことは、脳卒中患者のための治療手段として低体温症の利点に関するより多くの情報に基づいた調査を可能にする。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absolute ethanol	ThermoFisher Scientific/ Ajax Finechem	AJA214-20LPL	Diluted with deionized water to give 70 % ethanol
Antiseptic solution (Chlorhexidine)	David Craig	A2957
Anaesthetic (Marcain)	Aspen	PS13977
Brushless fan motor	Sirocco	YX2505	2 x 12 V/130 mA
Heat lamp	Reptile One	AC220	240 V 50/60 Hz
Heat pad	FHC, Inc	40-90-2
Rectal probe	FHC, Inc	40-90-5D-02
Temperature controller	FHC, Inc	40-90-8D
Temperature Datalogger	Maxim	DS1922L-F5