インビトロで心臓虚血/再灌流を模倣する細胞共培養モデルの開発

要約

空間距離は、別々の内皮細胞層と心筋細胞層の共培養モデルにおける低酸素/再酸素化傷害を評価する際の重要なパラメータであり、心筋細胞保護における内皮細胞の役割を試験するための好ましい in vitro モデルを提供するためには、共培養空間環境を最適化する必要があることを初めて示唆する。

要約

虚血性心疾患は、世界中の主要な死因および障害である。再灌流は虚血を超えてさらなる傷害を引き起こす。内皮細胞(EC)は、細胞間相互作用を介して心筋細胞(CM)を再灌流傷害から保護することができる。共培養は、細胞間相互作用の役割を調査するのに役立ちます。混合共培養は最も単純なアプローチですが、単一細胞型の単離処理および下流分析は実現不可能であるため、制限されています。ECがCM細胞損傷を用量依存的に減弱させることができるかどうか、およびこの保護が2つの細胞株間の接触距離を変えることによってさらに最適化され得るかどうかを調べるために、我々はマウス原発性冠状動脈内皮細胞および成体マウス心筋細胞を使用して、細胞間層間距離が0.5で変化した3種類の細胞培養インサートを試験した。 それぞれ1.0、および2.0mm。CMsのみでは、乳酸脱水素酵素(LDH)放出によって評価された細胞傷害は、低酸素状態の間、およびさらに再酸素化時に、距離が0.5および1.0mmと比較して2.0mmであったときに有意に増加した。ECとCMがほぼ直接接触していたとき(0.5mm)、低酸素症後のCMの再酸素化傷害の軽度の減衰しかなかった。この減衰は、空間距離が1.0mmのときに有意に増加した。2.0mmの距離では、ECは低酸素および低酸素/再酸素化の両方でCM傷害を減衰させ、ECがCMとクロストークするために十分な培養距離が必要であることを示し、分泌されたシグナル分子が循環し、保護経路を完全に刺激することができる。我々の知見は、EC/CM共培養空間環境を最適化することが、模擬虚血/再灌流傷害に対するCM保護におけるECの役割を試験するための好ましい in vitro モデルを提供するために必要であることを初めて示唆する。このレポートの目標は、研究者がこの重要なモデルを有利に活用するための段階的なアプローチを提供することです。

概要

虚血性心疾患は、世界中の死因および障害の主要な原因である^1,2。しかし、再灌流の治療プロセスは、それ自体が心筋虚血/再灌流(IR)傷害として知られる心筋細胞死を引き起こす可能性があり、有効な治療法はまだない³。内皮細胞(EC)は、パラクリンシグナルの分泌、ならびに細胞間相互作用を通じて心筋細胞(CM)を保護することが示唆されている⁴。

細胞共培養モデルは、細胞機能および分化に対するオートクリンおよび/またはパラクリン細胞間相互作用の役割を調査するために広く使用されてきた。共培養モデルの中で、混合共培養が最も単純であり、2つの異なるタイプの細胞が所望の^細胞比5で単一の培養区画内で直接接触している。しかし、細胞型間の別々の処理と単一の細胞型の下流分析は、混合集団を考えると容易には実現不可能である。

以前の研究では、低酸素および虚血性の侮辱が、乳酸脱水素酵素(LDH)の放出によって測定される細胞膜の完全性に重大な損傷を引き起こすことが示された。この傷害は、再酸素化時に悪化し、再灌流傷害を模倣^する6、^7、8。現在のプロトコルの目的は、ECの存在が低酸素および再酸素化(HR)によって引き起こされるCMの細胞膜漏出を用量依存的に減弱させることができ、ECの保護効果は2つの細胞株間の接触距離を変えることによって最適化できるという仮説を検証することであった。そこで、マウス初代冠動脈内皮細胞と成体マウス心筋細胞の3種類の細胞培養インサートを採用した。コーニング、メルクミリポア、グライナーバイオワンによってブランド化されたインサートは、細胞間ライン間距離がそれぞれ0.5、1.0、および2.0mmの3つの異なる細胞培養クロストーク条件を作成することができました。各ケースでインサートあたり100,000個のECがメッキされました。

さらに、このモデルにおいて、共培養中のECの密度がHR傷害減弱に寄与するかどうかを決定するために、我々は、EC濃度とCMによるLDH放出との間の用量反応関係を研究した。

このレポートは、研究者がこの重要なモデルを有利に利用するための段階的なアプローチを提供します。

プロトコル

1. 実験準備・めっき

1. CM および EC は、製造元の指示に従って保守してください。
   1. 両方の細胞株がベンダーから到着したら解凍します。新鮮な培地で洗浄した後にT25フラスコにプレートする。各細胞培養培地は、細胞が購入したのと同じベンダーから購入することをお勧めします。翌日、培地で細胞をリフレッシュし、コンフルエントなときに使用します。
   2. 細胞培養インキュベーターを21%O2、5%CO2、74%_N2で37°Cに_維持し、加湿しておく。
      注:このプロトコルで使用されるマウス初代冠状動脈内皮細胞はC57BL/6マウスの冠状動脈から単離され、成体マウス心筋細胞は成体C57BL/6Jマウス心臓から単離され、商業的に入手可能である( 材料表を参照)。
2. CMを滅菌条件下で24ウェルプレートの底部(下層)にプレートする。24時間後、ECを共培養ウェルのインサート(または上位部分)にプレートする。ECめっきの24時間後、ECインサートをCMプレートベース上に置き、共培養期間を開始した。使用前に細胞を少なくとも12〜24時間共培養させる。これらの手順については、以下で詳しく説明します。
   1. CM細胞株コンフルエント性を光学顕微鏡下で推定する。細胞が培養フラスコ内で90%〜100%コンフルエントであるように見える場合、実験的なプレーティングを続行する。
   2. コンフルエントな細胞培養物を含むフラスコから培地を取り出し、T25フラスコ用に3〜5mLのトリプシン/エチレンジアミン四酢酸(EDTA)でトリプシン処理する。フラスコを穏やかに攪拌し、37°Cで2〜5分間インキュベートし、次いで光学顕微鏡下で酵素進行を評価した。セルが切り上げられ始めたら、セルスクレーパーを使用してセルを表面から取り外します。
   3. 剥離後、T25フラスコ用の培地10mLを含む50mLチューブにトリプシン/細胞溶液を加えてトリプシン溶液を不活性化する。細胞懸濁液を120 x g で2分間遠心分離し、軟質細胞ペレットを得た。上清を除去し、ペレットを5mLの培地に再懸濁する。
   4. 細胞計数を行い、細胞生存率を確認するには、10 μLの再懸濁細胞と10 μLのトリパンブルー色素のアリコートを混合します。細胞カウンターを用いて生細胞を計数する。所望の播種密度を達成するために、新鮮な規則的な培地で細胞を希釈する。体積は、所望の種子密度およびストック溶液の細胞濃度に応じて計算される。すべてのめっきは無菌条件下で行う必要があります。
   5. 細胞外マトリックスで予めコーティングされた24ウェルプレートの底部に、1ウェルあたり300,000の密度のプレートCMを播種する。細胞を21%O2および5%_CO2 で一晩37°C_に 維持する。
   6. 24時間後、ECをインサートあたり100,000の最適なプレーティング密度でインサートにプレートします(培養面積は33.6mm2です)(図1)。ECめっきの24時間後、ECインサートをCMウェル内に置き、共培養を開始する。実験を行う前に、細胞を12〜24時間共培養する。
   7. 実験が実行されるまでに、CM と EC の両方が 80% ~ 90% のコンフルエントに達していることを確認します。

2. 虚血/再灌流傷害をインビトロでシミュレートするための低酸素/再酸素化

メモ: 次の手順は説明どおりに実行する必要があります。その間に一時停止しないでください。

1. 50 mLの円錐管に約25 mLの培地を注ぐことによって低酸素培地を調製する。上部をシリコーン膜でエアシールし、滅菌ピペットを使用して穴を開けます。別の穴を作り、今度はピペットをメディアに約2/3沈めたままにします。
2. 培地を低酸素ガス(0.0125% O2、5%_CO2、94.99% N₂)で30 L/minの流量で5分間洗い流します。これにより、低酸素状態の開始時に媒体中に溶解する_O2が最小限に抑えられます(ステップ2.5)。
3. 付着細胞を含む24穴プレートまたは培養インサートの培地を捨て、100 μL/ウェルの10%リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で非常に穏やかに洗浄する。その後、新たに調製した低酸素培地500μLをプレートまたはインサートの各ウェルに加える。
   注: このステップでは、培地中の低酸素症ができるだけ短時間中断され、その後、ステップ 2.5 で細胞およびメディアの真の低酸素状態が開始されます。
   1. 正常酸素対照群では、元の培地をグルコースおよび血清を含む新鮮な正常培地と交換する。
4. チャンバー内に滅菌水で満たされたペトリ皿を置くことによって低酸素チャンバーを加湿する。次に、低酸素基を含むプレートをチャンバー内に配置します。
5. 低酸素チャンバーを低酸素ガス(0.0125%O2、5%CO2、94.99%_N2)で30L/minの流量で5分間フラッシュします。チャンバーを37°Cのインキュベーター内に24時間置く。
6. 低酸素状態の後、通常の条件下でCMおよびECを栽培する。これを行うには、プレート/インサートの古い培地を捨て、通常の培地(グルコースと血清を含む;各ウェル/インサートの500μLを含む)と交換し、通常の培養条件(21%O2、5%_CO2、74%_N2、37°C)下でインキュベーターに2時間保存して再灌流を模倣する。
7. 培地置換の任意の効果について制御するために、低酸素培地が変化すると同時に正常酸素細胞の培地を変更する。
   メモ: 図 2 に、このプロトコルの概略概要を示します。

3. エンドポイント評価

1. 細胞培養培地を24ウェルプレートから96ウェルプレートに移す。24ウェルプレートの各ウェルから200μLの培地を使用し、それに応じて96ウェルプレートの4ウェルに均等に分配する。正常酸素症対低酸素症対HRのためにそれぞれ1つのプレートを使用してください。
2. 細胞傷害の程度は、例えば、製造業者の指示に従って細胞傷害性アッセイキットを用いてLDHの吸光度を測定することによって決定する。アッセイプロトコールで指示されたように96ウェルプレートでアッセイを行う。

4. 統計

1. パラメトリック データを平均/標準偏差として表示し、ノンパラメトリック データを中央値/四分位範囲を持つ箱ひげ図として表示します。タイプ1エラーの可能性を減らすために、許容可能なポストホック検定を使用した適切なパラメトリック検定と非パラメトリック多重比較検定を実行する必要があります。有意性は通常、アルファ 0.05 (両側) に設定されます。
2. 現在の研究で実施されたすべての実験について、1回の実験内で少なくとも3つのウェル反復を実行します。統計分析に使用した各実験の繰り返しは3~6回であった。

結果

この実験で使用した3種類のインサート(A、B、C)はすべて、同じ孔径0.4μmです。両者の唯一の違いは、挿入からベースまでの高さで、2つの共培養細胞層間の距離をそれぞれ0.5、1.0、2.0mmにすることができ(図3)、異なるベンダーからのものである(詳細については 材料表を参照)。

IR損傷をシミュレートするためにHRを受ける2つの細胞株の別?...

ディスカッション

プロトコルの重要なステップ
細胞共培養モデルは、心臓保護の細胞機構を研究するために使用されてきた。したがって、それらの間に意味のある距離を持つ2つの別々のレイヤーを作成する方法は、適切な共同文化モデルの開発にとって非常に重要です。シミュレートされたIR、すなわちHR、傷害を研究する際の課題は、虚血(低酸素症)自体だけでなく、再灌流(再酸素化)も細胞?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adult Mouse Cardiomyocytes (CMs)	Celprogen Inc	11041-14	Isolated from adult C57BL/6J mouse cardiac tissue
Automated Cell Counter Countess II	Invitrogen	A27977	Cell counting for calculating cell numbers
Bio-Safety Cabinet	Nuaire	NU425400	Cell culture sterile hood
Cell Culture Freezing Medium	Cell Biologics Inc	6916	Used for cell freezing for long term cell line storage
Cell Culture Incubator	Nuaire	Nu-5500	To provide normal cell living condition (21%O2, 5%CO2, 74%N2, 37°C, humidified)
Cell Culture Incubator Gas Tank	A-L Compressed Gases	UN1013	Gas needed for cell culture incubator
Cell Culture Inserts A (0.5 mm)	Corning Inc	353095	Used for EC-CM co-culture
Cell Culture Inserts B (1.0 mm)	Millicell Millipore	PIHP01250	Used for EC-CM co-culture
Cell Culture Inserts C (2.0 mm)	Greiner Bio-One	662640	Used for EC-CM co-culture
Centrifuge	Anstel Enterprises Inc	4235	For cell culture plating and passaging
CMs Cell Culture Flasks T25	Celprogen Inc	E11041-14	Used for CMs regular culture, coated by manufacturer
CMs Cell Culture Medium Complete	Celprogen Inc	M11041-14S	CMs culture complete medium
CMs Cell Culture Medium Complete Phenol free	Celprogen Inc	M11041-14PN	CMs culture medium without phenol red used during LDH measurement
CMs Cell Culture Plates 96 well	Celprogen Inc	E11041-14-96well	Used for experiments of LDH measurement, coated by manufacturer
CMs Hypoxia Cell Culture Medium	Celprogen Inc	M11041-14GFPN	CMs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free)
Countess cell counting chamber slides	Invitrogen	C10283	Counting slides used for cell counter
Cyquant LDH Cytotoxicity Kit	Thermo Scientific	C20301	LDH measurement kit
ECs Cell Culture Flasks T25	Fisher Scientific	FB012935	Used for ECs regular culture
ECs Cell Culture Medium Complete	Cell Biologics Inc	M1168	ECs culture complete medium
ECs Cell Culture Medium Complete Phenol free	Cell Biologics Inc	M1168PF	ECs culture medium without phenol red used during LDH measurement
ECs Cell Culture Plates 96 well	Fisher Scientific (Costar)	3370	Used for experiments of LDH measurement
ECs Culture Gelatin-Based Coating Solution	Cell Biologics Inc	6950	Used for coating flasks and plates for ECs
ECs Hypoxia Cell Culture Medium	Cell Biologics Inc	GPF1168	ECs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free)
Fetal Bovine Serum (FBS)	Fisher Scientific	MT35011CV	FBS-HI USDA-approved for cell culture and maintenance
Hypoxia Chamber	StemCell Technologies	27310	To create a hypoxic condition with 0.01%O2 environment
Hypoxia Chamber Flow Meter	StemCell Technologies	27311	To connect with hypoxic gas tank for a consistent gas flow speed
Hypoxic Gas Tank (0.01%O2 Cylinder)	A-L Compressed Gases	UN1956	Used to flush hypoxic medium and chamber (0.01%O2/5%CO2/94.99N2)
Microscope	Nikon	TMS	To observe cell condition
Mouse Primary Coronary Artery Endothelial Cells (ECs)	Cell Biologics Inc	C57-6093	Isolated from coronary artery of C57BL/6 mice
NUNC 15ML CONICL Tubes	Fisher Scientific	12565269	For cell culture process, experiments, solution preparation etc.
NUNC 50ML CONICL Tubes	Fisher Scientific	12565271	For cell culture process, experiments, solution preparation etc.
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8662	Used for cell washing during culture or experiments
Plate Reader	BioTek Instrument	11120533	Colorimetric or fluorometric plate reading
Reaction 96 Well Palte (clear no lid)	Fisher Scientific	12565226	Used for LDH measurement plate reading
Trypsin/EDTA for CMs	Celprogen Inc	T1509-014	1 x sterile filtered and tissue culture tested
Trypsin/EDTA for ECs	Cell Biologics Inc	6914/0619	0.25%, cell cuture-tested