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要約

軸状昆虫を得るために、その卵表面を滅菌し、孵化した幼虫を引き続き軸葉を用いて飼育する。この方法は、抗生物質を投与したり、人工飼料を開発したりすることなく、他の葉を食べる昆虫にも適用することができる軸索昆虫調製のための効率的な方法を提供する。

要約

昆虫の腸は、宿主の生理学的特徴に深く影響を与える可能性のある多様な細菌によってコロニー形成されています。特定の細菌株を軸索昆虫に導入することは、腸内微生物の機能を検証し、腸内微生物と宿主の相互作用の根底にあるメカニズムを解明する強力な方法です。抗生物質を投与するか、卵の表面を殺菌することは、昆虫から腸内細菌を除去するために一般的に使用される2つの方法である。しかし、昆虫に対する抗生物質の潜在的な悪影響に加えて、以前の研究では、抗生物質を摂食することは腸内細菌を排除することができないことが示されていた。したがって、無菌の人工食は、一般的に、自然食品の栄養成分に完全には似ていない退屈で労働集約的なプロセスである軸状昆虫を維持するために使用されています。ここで説明されているのは、葉の甲虫(Plagiodera versicolora)の軸索幼虫を調製および維持するための効率的で簡単なプロトコルである。具体的には、カブトムシの卵の表面を殺菌し、続いて無菌ポプラ葉を用いて軸索幼虫を飼育した。昆虫の軸索状態は、培養依存性および培養非依存性アッセイによってさらに確認された。集合的に、卵の消毒と無菌栽培を組み合わせることによって、効率的で便利な方法が開発され、axenic P. versicoloraが得られ、他の葉を食べる昆虫にとって容易に移動可能なツールが提供された。

概要

哺乳類と同様に、昆虫消化管は食物の消化吸収のための空洞である。ほとんどの昆虫は、腸内で繁栄し、宿主1によって供給される栄養で生活する多様な共生細菌を保有しています。腸内共生コミュニティは、食物消化および解毒2,3,4、栄養および発達5,6,7、病原体および寄生虫に対する防御8,9,10,11、化学コミュニケーション12,13および行動14を含む、昆虫の複数の生理学的プロセスに深刻な影響を及ぼしている。,15.興味深いことに、いくつかの腸内微生物叢は通性に病原性であるか、または感染を悪化させるために侵入する病原体によって操作される可能性があり、腸内細菌が場合によっては有害であり得ることを示している16,17,18。腸内細菌は、バイオテクノロジーの応用や害虫管理のための微生物資源としても機能し得る。例えば、植物性貪食性および木狼性昆虫からのリグノセルロース消化細菌は、バイオ燃料を開発するための植物細胞を消化するために使用された19。生理活性分子を発現する操作された腸内共生生物の分散は、感染症19、20、21を媒介する農林業害虫および蚊を管理するための新規かつ有望な戦術であり、有益な昆虫22の適応度を改善するためにも使用することができる。したがって、腸内細菌がインビボでどのように振る舞うかを示すことは、その機能を十分に活用し、さまざまな用途にさらに活用するための優先事項と考えられています。

動物は腸内に1〜>1000種の共生微生物種を保有することができる1。その結果、個々の細菌分類群またはその集合体が動物内でどのように機能するか、および宿主またはその微生物パートナーが特定の機能を駆動するかどうかを正確に検証することは困難である。したがって、単種または多種のコロニー形成によってノットバイオティック昆虫を得るために軸索幼虫を調製することは、細菌機能および昆虫との相互作用を調べるために必要である23。現在、抗生物質カクテルを投与し、昆虫の卵の表面を殺菌することは、腸内細菌を除去するための一般的な方法である14、24、25、26。しかし、抗生物質の食事療法は腸内細菌を完全に排除することができず、宿主の昆虫生理機能に悪影響を及ぼす27,28。その結果、抗生物質処理された昆虫の使用は、いくつかの腸内細菌の真の能力を曖昧にする可能性がある。幸いなことに、卵の表面滅菌はこの問題23,29を否定することができ、実験昆虫にはまったくまたは無視できる影響しか及ぼさない。さらに、人工食は天然の昆虫食に完全には似ておらず、人工食を開発することは費用がかかり、労力のかかるプロセスです30,31。

ヤナギの葉の甲虫、Plagiodera versicolora(ライチャーティング)(鞘翅目:Chrysomelidae)は、主にヤナギ(Salix)やポプラ(Populus L.)などのサリカ科の木を食べる広範な葉を食べる害虫です。32,33。ここで、ヤナギの葉の甲虫は、無菌の昆虫を調製し、飼育するためのプロトコルを開発するための代表的な葉を食べる昆虫として使用された。我々は、植物組織培養を利用して、滅菌卵からP. versicolora axenic幼虫を後方に無菌ポプラの葉を得た。P. versicolora幼虫の軸索状態を、培養依存性および培養非依存性アッセイによって検証した。このプロトコルは、人工食で飼育する昆虫よりも野生の状態をよりよく模倣する軸索昆虫を維持することができます。さらに重要なことに、この方法は非常に低コストで便利であり、将来の昆虫 - 腸内微生物叢相互作用研究、特によく発達した人工飼料のない非モデル昆虫のために軸状昆虫を得る実現可能性を高める。

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プロトコル

1. 昆虫飼育

  1. P. versicolora集団を成長チャンバー内で27°C、相対湿度70±5%の条件で維持し、明暗16時間/暗8時間の光周期にする。タイル張りの濡れた吸収紙で穴あいたプラスチック製の箱に入れ、新鮮なポプラの枝に餌をやる。吸湿紙にきれいな水をスプレーして水分を維持し、2日ごとに枝を変えます。
  2. 蛹化後の産卵のために成虫を隔離する。より多くの卵を得るために彼らに柔らかい葉を与えてください。
  3. 新しく産まれた卵を集める(24時間以内)。卵を湿った吸収紙の上に60時間置いて、軸索幼虫を調製する。
    注:新しく産まれた卵は〜72時間後に孵化します。卵の表面を殺菌するのに最適な時期は、孵化の前日です。さもなければ、うまく孵化した卵の数は減少するでしょう。

2. 無菌ポプラ養殖

  1. ムラシゲおよびスクーグ(MS)培地および1mg/mLのα-ナフタレン酢酸(NAA)ストック溶液を調製する( 材料表を参照)。
  2. バイオセーフティフード内で、500 mL の MS 培地に 50 μL の 1 mg/mL NAA ストック溶液を加え、よく混ぜるために振とうし、組織培養容器あたり約 50 mL を注ぎ、固化を待ちます。
  3. メスを準備します, アルコールランプ, 鉗子;メスと鉗子をバイオセーフティフード内のアルコールランプ炎で滅菌します。
  4. 成長の約1ヶ月でポプラの苗木から頂端芽または側芽で3〜4cmの茎セグメントを切断し(無菌組織培養苗)、それらを培養培地に挿入し、容器ごとに1つまたは2つの茎セグメント。
  5. これらの茎セグメントを、25°Cの成長チャンバー内で、50±10cd光強度で、16時間光/8時間暗所の光周期で約30日間インキュベートする。無菌の葉を使用して、斧状幼虫を養う。

3.卵表面殺菌およびアキセニック幼虫の飼育

  1. オートクレーブはシャーレ、絵筆、ろ紙、蒸留水、LB(Luria-Bertani)寒天培地を含むシャーレとした。
  2. 付着した卵の入った葉をペトリ皿に入れ、鉗子を使って葉から卵を慎重に取り除き、別のペトリ皿に移します。
    注:卵は葉に付着しているため、このステップは非常に慎重に行う必要があります。
  3. これらの卵を75%エタノールで8分間洗浄し、滅菌水で洗浄を4回繰り返す。
  4. 卵をLB寒天培地に移して、孵化のために水分を保存します。
    注:LB寒天培地を使用すると、消毒された卵が無菌であるかどうかを検証するのに役立ちます。
  5. ペトリ皿を成長室に入れ、卵が24時間以内に孵化するのを待つ。
  6. バイオセーフティフード内で、湿ったろ紙3枚をペトリ皿にタイル張りにし、無菌ポプラの葉を紙の上に置き、幼虫を集めて葉の上に置き、ペトリ皿をパラフィルムで密封し、27°C、相対湿度70±相対湿度5%、暗16時間光/暗8時間の光周期で成長チャンバー内でインキュベートする。
    注:組織培養された葉は繊細で、すぐに水分を失う可能性があります。したがって、葉をシャーレに移す際には、湿ったろ紙を使用する必要があります。
  7. 2日ごとに葉を交換してください。
  8. 従来飼育されていたグループでは、葉から湿ったろ紙を入れたペトリ皿に卵を移し、これらの幼虫に無菌ポプラの葉を与えます。

4. 培養依存性アッセイによる軸索幼虫の検証

  1. 無菌で従来飼育されている群から3つの1齢、2期、3齢幼虫をランダムに選択する。
  2. 実体顕微鏡下で滅菌はさみと鉗子で3齢幼虫を解剖し、微量遠心チューブに腸を採取する。無傷の1齢幼虫および2齢幼虫をチューブに集める。
    注:1齢幼虫と2齢幼虫は小さすぎて解剖できないため、幼虫全体を収集し、腸をそのまま保ちます。
  3. 100 μL のリン酸緩衝生理食塩水と 3 つのスチールボールを 1.5 mL チューブに加え、ビーズ叩解ホモジナイザーを使用して組織をホモジネートに粉砕します。
  4. LB寒天培地に100 μLのホモジネートを加え、滅菌ガラス拡散ロッドを用いてプレートする。
  5. プレートを37°Cで24時間置き、細菌コロニーを観察した。

5. 培養非依存アッセイによる軸索個体の検証

  1. DNA抽出キットを用いて組織(セクション4で得られた)の全DNAを抽出する。
  2. 260nmで分光光度計を用いてDNA濃度を測定する。
  3. PCRでユニバーサル16S rRNAプライマーを用いて細菌の16S rRNA遺伝子を増幅する。18 μL の 1.1x PCR マスターミックス ( 材料表を参照)、0.5 μL の 27F プライマー (5'-ACGGATACCTTGTTACGAC-3')、0.5 μL の 1495R プライマー (5'-ACGGATACCTTGTTACGAC-3') および 100 ng の鋳型 DNA で反応系をセットアップしました。PCR条件を95°Cで3分間設定する;95°Cで30秒間、55°Cで1分間、72°Cで1分間を28サイクル;続いて72°Cで10分間。PCR産物をさらなる分析まで4°Cで保存する。
  4. PCR産物を核酸色素と混合し、1x TAEバッファー中の1%アガロースゲル上で電気泳動を使用して分析します。10 μL の DNA マーカーを参考にしてください。
  5. UVトランスイルミネーターでゲルを観察し、約1,500 bpのターゲットフラグメントを探します。

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結果

P. versicoloraのライフステージを図1に示す。成人男性は成人女性よりも小さい(図1A)。畑では、カブトムシは卵を葉に集めます。ここでは、4つの卵が葉から剥離した(図1B)。疥瘡昆虫飼育に用いたポプラ茎セグメントと苗木を図2に示す。3齢幼虫の腸を図3に示し、腸の?...

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ディスカッション

無菌幼虫の作製や、特定の細菌株の再導入によるノットバイオティクス幼虫の取得は、宿主-微生物相互作用の根底にあるメカニズムを解明する強力な方法である。新たに孵化した幼虫は、2つの主要な方法で腸内微生物叢を得る:母親から子孫への垂直伝達または兄弟姉妹および環境34からの水平取得。前者は、卵表面35の汚染を介して子孫への親の移送によ...

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開示事項

著者らは、開示する利益相反はありません。

謝辞

この研究は、中国国家自然科学財団(31971663)とCASTによる若手エリート科学者スポンサーシッププログラム(2020QNRC001)から資金提供を受けました。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 µm syringe filtersMilliporeSLGP033RB
1 mg/mL NAA stock solutiona. Prepare 0.1 M NaOH solution (dissolve 0.8 g NaOH in 200 mL of distilled water).
b. Add 0.2 g NAA in a 250 mL beaker, add little 0.1 M NaOH solution until NAA dissolved, and adjust the final volume to 200 mL with distilled water.
c. Filter the solution to remove bacteria with a 0.22 µm syringe filter and a 50 mL sterile syringe, subpackage the solution in 1.5 mL centrifuge tubes and restore at -20 °C.
1.5 mL microcentrifuge tubesSangon BiotechF600620
10x PBS stock solutionBiosharp Life SciencesBL302A
2 M KOH solutionDissolve 22.44 g KOH (molecular weight: 56.1) in 200 mL of distilled water and autoclave it for 20 min at 121 °C.
250 mL and 2,000 mL beakersShubosb16455
50 mL sterile syringesJintaJT0125789
500 mL measuring cylinderShubosb1601
50x TAE stock solutiona. Dissolve 242 g Tris and 18.612 g EDTA in 700 mL of distilled water.
b. Adjust pH to 7.8 with about 57.1 mL of acetic acid.
c. Adjust the final volume to 1,000 mL.
d. The stock solution was diluted to 1x TAE buffer when used.
75% ethanolXingheda trade
α-naphthalene acetic acid (NAA)Solarbio Life Sciences86-87-3
Absorbing paper22.3 cm x 15.3 cm x 9 cm
Acetic acidSinopharm Chemical Reagent Co. Ltd
AgarCoolaber9002-18-0
AgaroseBiowest111860
AutoclavePanasonicMLS-3781L-PC
Bead-beating homogenizerJing XinXM-GTL64
DNA extraction kitMP Biomedicals116560200
EDTASaiguo Biotech1340
Filter paperJiaojie70 mm diameter
Gel electrophoresis unitBio-rad164-5052
Gel Signal Green nucleic acid dyeTsingKeTSJ003
Germ-free poplar seedlingsShan Xin poplar from Ludong University in Shandong Province
Golden Star Super PCR Master Mix (1.1×)TsingKeTSE101
Growth chamberRuihuaHP400GS-C
LB agar mediuma. Dissolve 5 g tryptone, 5 g NaCl, 2.5 g yeast extract in 300 mL of distilled water.
b. Adjust the final volume to 500 mL, transfer the solution to a 1,000 mL conical flask, and add 7.5 g agar.
c. Autoclave the medium for 20 min at 121 °C.
Mini centrifugeDRAGONLABD1008
MS basic mediumCoolaberPM1121-50LM0245
MS solid medium for germ-free poplar seedling culturea. Dissolve 4.43 g MS basic medium powder and 30 g sucrose in 800 mL of distilled water.
b. Adjust the pH to about 5.8 with 2 M KOH by a pH meter.
c. Adjust the final volume to 1,000 mL, separate into two parts, transfer into two 1,000 mL conical flasks, and add 2.6 g agar per 500 mL.
d. Autoclave for 20 min at 121 °C.
NanoDrop 1000 spectrophotometerThermo Fisher Scientific
Paintbrush1 cm width, used to collect the eggs
ParafilmBemisPM-996
PCR Thermal CyclersEppendorf6331000076
Petri dishesSupin90 mm diameter
pH meterMETTLER TOLEDOFE20
Pipettes 0.2-2 µLGilsonECS000699
Pipettes 100-1,000 µLEppendorf3120000267
Pipettes 20-200 µLEppendorf3120000259
Pipettes 2-20 µLEppendorf3120000232
Plant tissue culture containerChembaseZP21240 mL
Plastic box2.35 L
Potassium hydroxide (KOH)Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd
Primers for amplifying the bacterial 16S rRNA geneSangon Biotech27-F: 5’-ACGGATACCTTGTTACGAC-3’, 1492R: 5’-ACGGATACCTTGTTACGAC-3’
Sodium chloride (NaCl)Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd
Sodium hydroxide (NaOH)Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd
Steel balls0.25 mmused to grind tissues
StereomicroscopeOLYMPUSSZ61
SucroseSinopharm Chemical Reagent Co. Ltd
Trans2K plus II DNA markerTransgene BiotechBM121-01
Tris baseBiosharp Life Sciences1115
TryptoneThermo Fisher Scientific LP0037
UV transilluminatorMonad BiotechQuickGel 6100
VortexerScilogexMX-S
Willow branchesSha Lake Park, Wuhan, China
Willow leaf beetleHuazhong Agricultural University, Wuhan, China
Yeast extractThermo Fisher ScientificLP0021

参考文献

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