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要約

本プロトコルは、効率的な微粒子濃縮に使用できる空気圧マイクロ流体プラットフォームを記述している。

要約

本稿では、マイクロ流体プラットフォームを用いて粒子濃度を制御する空気圧バルブを製造・運用する方法を紹介する。このプラットフォームには、湾曲した流体チャネルと3つの空気圧バルブを備えた3次元(3D)ネットワークがあり、ポリジメチルシロキサン(PDMS)による二重複製を介してネットワーク、チャネル、および空間を作成します。このデバイスは、空気圧バルブによって制御される流体流量の過渡応答に基づいて、(1)サンプルローディング、(2)サンプルブロッキング、(3)サンプル濃度、および(4)サンプルリリースの順序で動作します。粒子は、ふるいバルブ(Vs)プレートの薄いダイヤフラム層変形によってブロックされ、湾曲したマイクロ流体チャネルに蓄積する。作動流体は、2つのオン/オフバルブの作動によって排出されます。操作の結果、様々な倍率のすべての粒子が首尾よく傍受され、噛み合わなくなった。この技術を適用する場合、動作圧力、濃縮に要する時間、および濃縮速度は、装置寸法および粒径倍率に応じて変化し得る。

概要

生物学的分析の重要性のために、マイクロ流体および生物医学的マイクロエレクトロメカニカルシステム(BioMEMS)技術1,2は、マイクロマテリアル2,3,4の精製および収集のための装置の開発および研究に使用される。パーティクル キャプチャは、アクティブまたはパッシブに分類されます。アクティブトラップは、独立した粒子に作用する外部誘電体5、磁束6、聴覚7、視覚8、または熱9の力に使用され、それらの動きの正確な制御を可能にした。ただし、粒子と外力の間の相互作用が必要です。したがって、スループットは低くなります。マイクロ流体システムでは、外力がターゲット粒子に伝達されるため、流量を制御することは非常に重要です。

一般に、受動マイクロ流体デバイスは、マイクロチャネル10、11内にマイクロピラーを有する。粒子は流れる流体との相互作用によって濾過され、これらの装置は設計が容易で製造が安価である。しかし、それらはマイクロピラーの粒子詰まりを引き起こすので、粒子の目詰まりを防ぐためにより複雑な装置が開発されている12。複雑な構造を有するマイクロ流体デバイスは、一般に、限られた数の粒子13、14、15、16、17、18を管理するのに適している。

この記事では、上記のように欠点18を克服する大きな粒子濃度のための空気圧駆動マイクロ流体プラットフォームを製作および操作する方法を説明する。このプラットフォームは、湾曲したマイクロ流体チャネルに蓄積するふるいバルブ(Vs)プレートの薄いダイヤフラム層の変形および作動によって粒子をブロックし、濃縮することができる。粒子は湾曲したマイクロ流体チャネルに蓄積し、濃縮粒子は、2つのPDMSシールオン/オフバルブ18の作動を介して作動流体を排出することによって分離することができる。この方法は、限られた数の粒子を処理するか、または多数の小さな粒子を濃縮することを可能にする。流量の大きさや圧縮空気圧などの動作条件は、不要なセルの損傷を防ぎ、セルトラップ効率を高めることができます。

プロトコル

1. 粒子濃縮のためのマイクロ流体プラットフォームの設計

  1. 3Dフローネットワーク内の流体フロー用の1つの空気圧バルブと、ふるい(Vs)、流体(Vf)、および粒子(Vp)バルブ操作用の3つの空気圧バルブで構成される空気圧マイクロ流体プラットフォームを設計します(図1)。
    注:Vsブロックは液体から粒子を濃縮し、VfおよびVpは濃縮後に流体および粒子放出を可能にする。3つの空気圧ポートは、流体/空気圧供給層(ノーマルオープン)と空気圧バルブライト出口から圧縮空気を供給し、バルブを作動させます。マイクロ流体チャネルネットワークは、CADプログラム18、19を用いて設計されている。
  2. チャンネルを空気圧供給層と3Dチャンネルネットワーク層として設計します(図2)。
    注:流体ネットワークは、前部の湾曲したチャネルおよび後部の長方形のチャンバと相互接続されている。Vsは入口を塞ぎ、粒子は湾曲した流体チャネルの収集領域に蓄積する。粒子を含まない流体(粒子を含まない液体)はQf出口を通って出され、濃縮粒子はQp出口を通って出ます(図3)。
  3. 上記条件に従って、4種類のSU-8金型を作製した。
    メモ:4つの金型には、空気圧でバルブを制御できる金型、流体チャネルを作成する2つの金型、形状のないクリーンな金型が含まれています(図4と表1)。上記の4種類のモールドは、標準的なフォトリソグラフィープロセスを使用して製造されています。この金型製作は、以前に発表されたレポート18,19に従って、シリコンウェーハ上のSU-8金型で構成されています。図5は、デバイスチップを示しています。

2. 粒子濃縮用マイクロ流体プラットフォームの作製

注: 図6 は、粒子を濃縮するマイクロ流体プラットフォームの作製を示しています。

  1. バルブを空気圧制御するために準備された空気圧バルブチャネルSU-8金型(ステップ1.3)を使用してPDMS層を複製します。
    1. 10mLの液体PDMSおよび1mLの硬化剤( 材料表を参照)を調製した空気圧バルブチャネルモールドに注ぎ(ステップ1.3)、90°Cで30分間熱活性化する。
    2. PDMS構造が硬化したら、ステップ2.1.1のSU-8金型を分離します。
    3. 1.5 mm の穿刺を使用して、ステップ 2.1.2 に従って製造された空気圧バルブ チャネルに 3 つの 1.5 mm 空気圧ポート (Vs、Vf、および Vp) を打ち抜きます ( 材料表を参照)。
    4. ステップ1.3で調製したクリーンなSU-8モールドに液体PDMS10mLおよび硬化剤1mLを注ぎ、スピンコーターを用いて1,500rpmで15秒間スピンコートする( 材料表を参照)。その後、90°Cで30分間加熱活性化する。
    5. PDMS構造が硬化したら、ステップ2.1.4のSU-8金型を分離します。
      メモ:バルブダイヤフラム層は、空気圧に応じて流体の流れを制御します。
    6. 大気プラズマ( 材料表を参照)を、ステップ2.1.3および2.1.5で準備したPDMS構造に20秒間処理する。
    7. ステップ2.1.6からプラズマ処理したPDMS構造を、顕微鏡で確認して流路構造に合わせて直接整列させます。
    8. ステップ2.1.7で調製した整列PDMS構造体を90°Cで30分間加熱して結合させる。
    9. 1.5 mmの穿刺を使用して、薄いダイヤフラム層が接着されている空気圧チャネル部分内の流体チャネル入口(Qfp)および流体チャネル出口(QfおよびQp)に直径1.5mmの穴を開けます。
  2. 2つのSU-8金型を使用してPDMS層の両面を複製し、マイクロ流体チャネルを作成します。前面に湾曲した長方形のマイクロ流体チャネルモールドを使用し、背面にマイクロ流体相互接続チャネルモールドを使用します。
    1. 10 mL の液体 PDMS と 1 mL の硬化剤を湾曲した長方形のマイクロ流体流路モールドに注ぎ、1,200 rpm で 15 秒間スピンコートします。次に、90°Cで30分間熱活性化することにより、湾曲した流体チャンバおよび流体チャネル用の金型を作成します(図6A)。
    2. マイクロ流体流路が形成されたPDMS層を分離し、大気プラズマを20秒間処理してガラスウェハに貼り合わせて密閉された通気壁を覆う熱活性化型を作る(図6B)。
    3. 3 mL の液体 PDMS を SU-8 金型の相互接続チャネルに注ぎます (図 6C)。
    4. ステップ2.2.2で作製した構造体を液状PDMSで配線流路金型でマイクロ流体相互接続流路金型上に配置して、重ね合わせた構造体を130°Cで30分間乾燥させます(図6D)。
      注:背面構造を硬化させている間、ステップ2.2.2で作製したPDMSモールドは空気層の熱圧によって膨張し、変形したPDMS層は熱的に活性化される(図6E)16。
    5. 硬化後、マイクロ流体チャネル網層から前面SU-8金型を取り外し、背面PDMS金型を慎重に剥離します(図6F)。
      注:3D流体ネットワーク層は、前方湾曲した流体チャンバおよびマイクロ流体チャネルの作成を可能にする。
    6. 10 mL の液体 PDMS と 1 mL の硬化剤を清潔な SU-8 金型に注ぎます。その後、90°Cで30分間加熱活性化する。
    7. PDMS構造が硬化したら、SU-8金型を分離します。
      メモ: この手順では、追加のシーリング層を作成します。
    8. ステップ2.2.3および2.2.7で準備したPDMS構造に大気プラズマを20秒間処理する。
    9. プラズマ処理したPDMS構造をチャンネル構造に合わせて直接整列させ、顕微鏡で確認します。
    10. 整列したPDMS構造体を90°Cで30分間加熱して結合させる。
  3. ステップ2.1、2.2で作成したPDMS構造をチャネル構造に合わせて整列させ、大気プラズマを20秒間処理して接合します。

3. デバイスのセットアップ

注: 図7は 、粒子を濃縮するマイクロ流体プラットフォームの作製を示しています。

  1. マイクロ流体流路に、10mLシリンジを使用して気泡のない脱塩水を手動で充填する。
  2. マイクロビードの流れを制御するP_Qfpと3つの空気圧バルブ(P_Vs、P_Vf、およびP_Vp)を制御するには、作動流体(Qfp)用の4つ以上の出力チャネル( 材料表を参照)を備えた精密圧力コントローラをマイクロ流体プラットフォームに挿入します。
    メモ:4つの出力チャンネルを備えた精密圧力コントローラは、複数の高精度圧力コントローラと交換できます。本実験では、P_Qfpの運転圧力は10kPa、P_Vsは15kPa、P_Vf及びP_Vpは共に18kPaであった(図8 及び 表2)。 図8 は、15kPaのP_Vsを有するマイクロ流体プラットフォームによって粒子が濃縮されるときの経時的な作動流体流量を示し、 表2 は空気圧バルブによる作動結果を示す。
  3. 蒸留水中で様々なサイズのカルボキシルポリスチレン試験粒子を調製する( 材料表参照)。
    注:この実験で使用された粒子サイズは、24.9、8.49、および4.16μmであった。P_Vsの圧力に応じて様々なサイズの粒子を使用することができる。
  4. 作動流体の流量を制御するには、ガラス瓶に水(作動流体)を半分充填し、ガラス瓶キャップをコントローラ出力チャネルとマイクロバルブに接続します。
    メモ: 一方のチューブをマイクロバルブに接続してコントローラから圧縮空気を受け取り、もう一方のチューブを接続して水を注入します。
  5. すべてのプラットフォーム操作について倒立顕微鏡でプラットフォームの動作を観察し、液体流量計で出口での経時的な動作流量を測定します( 材料表を参照)。

4. 装置の動作

  1. 粒子/流体混合物をVpで注入口(Qfp)に圧力下で注入します(図9A)。
    メモ:相互接続されたチャネルを通る出口からの粒子および清浄な流体の流れは、それぞれVpおよびVf を介して 制御される(表2)。
  2. Vs に 15 kPa で、Vp に 18 kPa で圧力を加えてバルブを作動させます。
    注:このとき、ダイヤフラムが変形し、流体Qfpの粒子が湾曲流体チャネルと湾曲流体カンチレバーとの間の接触空間で遮断され、不要なQfp流体が開放Qfを介して放出される(図9B、C)。
  3. 粒子が濃縮されたら、Vfにのみ圧力をかけます。
    注:この時点で、Vfにのみ圧力が加えられると、詰まった粒子はQpを介して放出されます(図9D)。

結果

図8 は、 表2で述べたように、4段階のプラットフォーム動作のための流体速度の流量を示す。第1段階は、ローディング状態(状態)である。プラットフォームには、すべてのバルブを開いた状態で流体が供給され、作動流体(Qf)と粒子(Qp)は、マイクロ流体チャネルネットワークが構造対称性を示すのとほぼ同じです。2段目(b状態)では、圧縮空気をVsに輸送して?...

ディスカッション

このプラットフォームは、さまざまなサイズの粒子を精製および濃縮する簡単な方法を提供します。空気圧バルブ制御により粒子が蓄積・放出され、パッシブ構造がないため目詰まりは観察されません。この装置を用いて、3つのサイズの粒子の濃度が提示される。しかしながら、動作圧力、濃縮に要する時間、および速度は、装置寸法、粒径倍率、およびVs18、20

開示事項

著者らは、開示する利益相反はありません。

謝辞

この研究は、韓国政府(科学情報通信部)の資金提供を受けた韓国国立研究財団(NRF)の助成金によって支援されました。(いいえ。NRF-2021R1A2C1011380)。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mm punctureSelf procductionSelf procductionThis puncture was made by requesting a mold maker based on the Miltex® Biopsy Punch with Plunger (15110-15) product.
4 inch Silicon Wafer/SU-8 mold4science29-03573-014 inch (100) Ptype silicon wafer/SU-8 mold
Carboxyl Polystyrene Crosslinked Particle(24.9 μm)SpherotechCPX-200-10Concentrated bead sample1
Flow meterSensirionSLI-1000Flow measurement
High-speed cameraPhotronFASTCAM MiniObservation of concentration
Hot plateAs oneHI-1000heating plate for curing of liquid PDMS
KOVAX-SYRINGE 10 mL/SyringeKoreavaccine22G-10MLFill the microfluidic channel with bubble-free demineralized water.
Laboratory Conona treater/Atmospheric plasmaElectro-TechnicBD-20ACChip bonding/atmospheric plasma
Liquid polydimethylsiloxane, PDMSDow Corning Inc.Sylgard 184Components of chip
MicroscopeOlympusIX-81Observation of concentration
PEEK TubesSAINT-GOBAIN PPL CORP.AAD04103Inject or collect particles
Polystyrene Particle(4.16 μm)SpherotechPP-40-10Concentrated bead sample3
Polystyrene Particle(8.49 μm)SpherotechPP-100-10Concentrated bead sample2
Pressure controller/μfluconAMEDμfluconControl of air pressure
Spin coateriNexusACE-200spread the liquid PDMS on SU-8 mold

参考文献

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