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要約

ここでは、網膜静脈閉塞(RVO)の研究におけるフルオレセイン血管造影(FA)および光干渉断層撮影(OCT)画像の3つのデータ解析プロトコルを紹介します。

要約

眼科イメージングツールの進歩は、神経血管損傷の動物モデルを扱う研究者に前例のないレベルのアクセスを提供します。この優れた翻訳可能性を適切に活用するためには、これらの画像から定量的なデータを引き出す再現性のある方法を考案する必要があります。光干渉断層撮影(OCT)イメージングは、マイクロメートルの分解能で網膜組織像を解決し、血管血流の機能的差異を明らかにすることができます。ここでは、網膜静脈閉塞(RVO)の最適化されたマウスモデルにおける血管傷害後の病理学的損傷を特徴付けるために使用する非侵襲的血管読み出しについて説明します。これらの読み出しには、網膜形態のライブイメージング分析、毛細血管虚血の網膜内層の混乱(DRIL)測定、および網膜浮腫と血管密度のフルオレセイン血管造影測定が含まれます。これらの技術は、診療所で網膜疾患の患者を検査するために使用される技術に直接対応しています。これらの方法を標準化することで、動物モデルと眼科疾患の臨床表現型との直接かつ再現性のある比較が可能になり、血管損傷モデルの翻訳力が向上します。

概要

神経血管疾患は、死亡率と罹患率の主な原因である虚血性脳卒中、および視力喪失につながる網膜血管疾患の原因となる主要な医療問題です1,2。神経血管疾患をモデル化するために、網膜静脈閉塞(RVO)のマウスモデルを採用しています。このモデルは非侵襲的であり、臨床現場で網膜血管疾患のある人を検査するために使用されるものと同様のin vivoイメージング技術を利用しています。したがって、このモデルを使用すると、このモデルを利用した研究の翻訳の可能性が高まります。すべてのマウスモデルと同様に、モデルの再現性を最大化することが重要です。

網膜血管疾患は、70歳未満の人々の視力喪失の主な原因です。RVOは、糖尿病性網膜症に次いで2番目に多い網膜血管疾患です3。RVOに特徴的な臨床的特徴には、虚血性損傷、網膜浮腫、およびニューロン喪失の結果としての視力喪失が含まれる3,4。主要血管のレーザー光凝固を用いたRVOのマウスモデルが開発され、ヒトRVO 5,6,7で観察される主要な臨床病理を再現するために改良されています。眼科イメージングの進歩により、ヒトで使用される非侵襲的診断ツール、すなわちフルオレセイン血管造影(FA)および光干渉断層撮影(OCT)の複製も可能になりました6。フルオレセイン血管造影は、小さな蛍光色素であるフルオレセインの注射を使用して、血液網膜関門(BRB)の破壊による漏出、および閉塞部位を含む網膜の血流動態の観察を可能にします8,9。OCTイメージングは、網膜の高解像度断面画像の取得および網膜層の厚さおよび組織の研究を可能にする10。FA画像の分析は歴史的に主に定性的であり、研究間の直接的で再現性のある比較の可能性を制限しています。最近、OCTイメージングにおける層の厚さを定量化するための多くの方法が開発されましたが、現在標準化された分析プロトコルはなく、OCT画像取得のサイトはさまざまです11。これらのツールを適切に活用するためには、標準化された定量的で複製可能なデータ分析方法論が必要です。本論文では、RVO-フルオレセイン漏出、OCT層の厚さ、および網膜層の混乱のマウスモデルにおける病理学的損傷を評価するために使用される3つの血管読み出しを紹介します。

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プロトコル

このプロトコルは、眼科および視覚研究における動物の使用に関する視覚眼科研究協会(ARVO)の声明に従います。げっ歯類の実験は、コロンビア大学の施設動物管理使用委員会(IACUC)によって承認および監視されました。

注:イメージングは、体重約23gの生後2か月のC57BL / 6J雄マウスで行われました。

1. 網膜イメージング用試薬の調製

  1. 注射可能なフルオレセイン溶液の調製。
    注:フルオレセインは非常に光に敏感です。光から保護し、準備後すぐに使用してください。
    1. フルオレセインを滅菌生理食塩水中で1%の濃度に希釈する。
  2. ケタミン/キシラジンの調製
    1. ケタミンとキシラジンを滅菌生理食塩水で次の濃度に希釈します:ケタミン(80-100 mg / kg)とキシラジン(5-10 mg / kg)。.
  3. 滅菌生理食塩水
    1. 滅菌生理食塩水を入れた26 G針で5 mLシリンジを準備します。

2. OCTおよびフルオレセインイメージング

  1. 網膜イメージング顕微鏡のライトボックス、OCTマシン、および加熱されたマウスプラットフォームの電源を入れます。
  2. コンピュータの電源を入れ、イメージングプログラムを開きます。
  3. 各目にフェニレフリンとトロピカミドを1滴加えます。
  4. 150μLの麻酔(ケタミン(80-100 mg / kg)とキシラジン(5-10 mg / kg))を腹腔内(IP)に注射します。.つま先をつまんで麻酔の深さを決定し、動物が反応しなくなるまで待ちます。眼科用軟膏または人工涙液を両眼に塗ります。
  5. プラットフォームにマウスを合わせます。
  6. 網膜眼底の視界が明確で焦点が合うまで、プラットフォームの高さと角度を調整します。眼底の写真を撮ります。
  7. イメージングおよび OCT ソフトウェアを開きます。OCT プログラムで、微調整を 5 に調整します。
  8. 火傷から75μm離れた場所でOCT画像を撮影します。網膜の他の3つの象限についても繰り返します。
  9. 100 μLの1%フルオレセインIPを注入します。
  10. カメラを488nmフィルターに切り替えます。カメラゲインを5に増やします。
  11. フルオレセイン注射のちょうど5分後に眼底の写真を撮ります。
    注意: フルオレセインは網膜の光損傷を悪化させる可能性があるため、最大設定でカメラの光に目を長時間さらさないでください。5分の待機時間が経過し、マウスがイメージングの準備ができるまで、光源をオフのままにします。

3.アフターケア

  1. 1 mLの滅菌生理食塩水IPを注入します。潤滑剤点眼薬を両眼に塗ります。眼科用軟膏または人工涙液を両眼に塗ります。
  2. 麻酔から回復するマウスを観察します。完全に回復したとき、通常は約40分後にのみ、他の動物と一緒にケージに戻ります。

4.除外基準の評価

  1. 処置後24時間で撮影した眼底画像を開き、除外基準を評価します。次の基準のいずれかが特定されている場合は、目を除外します。
  2. 画像のオクルージョンがゼロかどうかを評価する
    1. 閉塞した血管の数について画像を評価します。
      注:閉塞が成功すると、通常、火傷の上または周囲に紫色の色素沈着、火傷を通る非常に薄いまたは不連続な血管、火傷領域の外側のかすかなまたは存在しない血管の外観、および低酸素症による網膜の変色があります。レーザーによる白い火傷を通して血管全体が見える場合、容器は閉塞に失敗しました。血管が部分的に塞がれているように見えることもありますが、火傷の外で途切れていないように見える場合は、血管が閉塞していない可能性があります。
    2. あいまいな場合は、FAイメージングを同時に使用してオクルージョンを評価します。これらの画像では、オクルージョンは血管の連続性の切れ目として表示され、多くの場合、周囲の血管が先細りになっています。
    3. オクルージョンがゼロの場合は、RVOが無効と見なされるため、分析から目を除外します。
      注:オクルージョンは通常、RVOの48〜72時間後に解決され、オクルージョンの存在はこれらの時点で除外基準として使用しないでください。
  3. 眼底とOCTの画像を評価して、網膜剥離が過剰になるかどうかを調べます
    注:網膜下液の蓄積はRVOの誘導後に一般的であり、RPEからの神経網膜の分離を引き起こします。過度の網膜剥離の除外基準は次のように定義されます:OCTは完全に表示できないか、一部のレイヤーが非常に歪んで表示されます。画質が悪く、外側の網状およびRPE層の解像度が低下します。神経網膜と脈絡膜の間の分離は、OCT視野が許容するものよりも大きい。眼底画像では、網膜のトーンはほぼ完全に白くなり、紫色のしみがあります。網膜の一部が歪んで焦点が合っていないように見えることがあります。これは、網膜が剥離しており、網膜の他の部分とは異なる焦点距離にあるためです。
    1. 眼からの画像の評価が網膜の末梢または完全な剥離を決定する場合は、分析から眼を除外します。
  4. 角膜白内障の証拠がある画像を除外する
    注:角膜白内障は、マウスの角膜に不透明な白い点として表示されます。白内障は通常、動物が麻酔をかけられている間の目の潤滑が不十分なために発生し、目の軟膏をたっぷりと塗るように注意することで大幅に回避できます。白内障は、一般に、動物を検査することによって画像化する前に識別することができる。白内障を発症したマウスは、イメージングプロセスを経ることなくデータセットから除外する必要があります。イメージングでは、白内障はカメラから網膜を覆い隠し、OCTは歪んで見えます。
  5. 過度の出血がないか画像を評価する
    注:過度の出血は、画像内の赤い液体の量として識別でき、通常は網膜の背景、血管、および火傷を覆い隠します。赤い液体のこれらの領域は、成功したRVOで通常の紫色の斑点よりも明るく不透明な赤になります。出血はOCTイメージングで神経節細胞層に現れ、出血の下の他の網膜層を視覚化する能力を妨げます。
    1. 画像に過度の出血があると判断された場合は、分析から目を除外します。

5. フルオレセイン画像処理

  1. フルオレセイン画像を画像処理ソフトウェアで開きます。
  2. 画像を複製する
  3. 選択ツールを使用して、主要な血管を注意深くトレースします。
    1. 主な血管は、視神経乳頭から放射状に広がる太い静脈と動脈です。これらの船舶から分岐している船舶は無視してください。
    2. 漏れによって血管の輪郭が閉塞部位の近くに見られない場合は、血管のおおよその位置で漏れを追跡します(厚さを維持し、最後に見える点を次の可視点に接続します)。
  4. 最初の画像では、背景のみを残して選択範囲を削除します。このマスクされた画像を保存します。
  5. 選択範囲を2番目の画像に移動し、選択範囲を反転して削除し、血管を分離します。このマスクされた画像を保存します。
  6. ImageJ で 2 つの画像を開きます。背景画像を開き、積分密度を測定します。
  7. 船舶の画像を開き、船舶の輪郭を選択して、平均強度を測定します。
  8. 背景の積分密度を血管の平均強度で割り、眼の漏れ率を生成します。
  9. 実験コホートの各眼のこの漏れ率を記録します。
  10. バックグラウンドをさらに制御するには、実験眼を無傷の対照眼の平均漏出率に正規化します。
    注:FA画像中のフルオレセイン漏れの標準化された定量化を作成するために、この計算では、バックグラウンド密度(漏れが存在する場所)と主要な血管の明るさの比率を使用して、画像ごとの明るさの変化を制御し、確実に定量化できる結果を作成します。損傷を受けていない目は漏れがなく、理論的には比率がゼロである必要があります。したがって、これらの損傷を受けていないコントロールアイから計算された比率はバックグラウンドノイズを表し、この値は実験値をさらに正規化するために使用されます。

6.網膜層の厚さ

  1. OCT画像を画像処理ソフトウェアで開きます。
  2. 神経節細胞層、内網状層、内顆粒層、外網状層、感光体層、RPE層の境界をトレースします。各層の平均厚さを測定します。
  3. 網膜の他の3つの象限からのOCT画像についても繰り返します。4つの象限にわたる平均層の厚さを平均して、眼の各網膜層の平均厚さを求めた。
  4. 実験コホートの各眼について繰り返します。

7.網膜内層の混乱(DRIL)

  1. OCT イメージを ImageJ で開きます。
  2. ラインツールを使用して、外側の網状層の上部の境界が不明瞭になる距離を測定します。
    メモ: DRIL と、イメージングアーティファクトが原因でレイヤーの視認性が悪い領域を区別することが重要です。OCTの画質が悪いと、十分な画像解像度が得られない場合、DRIL分析の目が無効になる場合があります。DRILを含む画像には、通常、明確に解像度および整理された他の領域または網膜層があり、十分な画質の良い指標となる可能性があります。
    1. もしあれば、混乱が始まる緯度から外側の網状層の上部境界が再び見えるようになる緯度まで水平に測定します。外側の網状層が垂直方向に上下にシフトしても、完全に水平に測定します。
    2. 混乱のない領域で区切られた複数の混乱領域が存在する場合があります。これらを個別に測定し、距離の合計を計算します。
  3. 解体の長さを各OCT画像に見える網膜の全長で割って、画像に対する解体の比率を求めます。
  4. 網膜の他の3つの象限からのOCT画像の測定と計算を繰り返します。
  5. 4つのOCT画像から混乱の比率の平均を取ります。この数値は、網膜全体の平均的な混乱を表します。実験コホートの各眼について繰り返します。

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結果

これらの分析方法により、FAおよびOCTイメージングによってキャプチャされた網膜病理の定量化が可能になります。代表的なデータが抽出される実験では、無傷の対照として機能するか、RVO手順を受け、Pen1-XBir3治療点眼薬またはPen1-生理食塩水ビヒクル点眼薬のいずれかを投与されたC57BL / 6J雄マウスを使用しました。RVO損傷モデルでは、光活性化色素12であるローズベンガ?...

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ディスカッション

非侵襲的なげっ歯類網膜イメージングは、病理学を研究し、介入を開発するための道を提示します。以前の研究では、RVOのマウスモデルが開発および最適化されており、変動性を制限し、マウス網膜の一般的な臨床病理の信頼性の高い翻訳を可能にしています5,7,13。眼科イメージング技術の開発により、実験動物における...

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開示事項

著者は、競合する経済的利益はないと宣言しています。

謝辞

この研究は、国立科学財団大学院研究フェローシッププログラム(NSF-GRFP)助成金DGE - 1644869(CKCOへ)、国立眼研究所(NEI)5T32EY013933(AMPへ)、国立神経障害・脳卒中研究所(RO1 NS081333、R03 NS099920からCMT)、および国防総省陸軍/空軍(DURIPからCMT)の支援を受けました。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
AK-Fluor 10%AkornNDC: 17478-253-10light-sensitive
CarprofenRimadylNADA #141-199keep at 4 °C
GenTealAlcon00658 06401
Image JNIH
InSight 2DPhoenix Technology GroupOCT analysis software
Ketamine HydrochlorideHenry ScheinNDC: 11695-0702-1
PhenylephrineAkornNDCL174478-201-15
Phoenix Micron IVPhoenix Technology GroupRetinal imaging microscope
Phoenix Micron Meridian ModulePhoenix Technology GroupLaser photocoagulator software
Phoenix Micron Optical Coherence Tomography ModulePhoenix Technology GroupOCT imaging software
Phoenix Micron StreamPix ModulePhoenix Technology GroupFundus imaging and acquisition targeting
PhotoshopAdobe
RefreshAllergan94170
TropicamideAkornNDC: 174478-102-12
XylazineAkornNDCL 59399-110-20

参考文献

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