脳からのアミロイド線維コアの生化学的浄化とプロテオミクス特性評価

要約

質量分析ベースのプロテオミクス分析によるこの生化学的精製方法は、アミロイド線維コアの堅牢な特性評価を容易にし、アルツハイマー病を予防するための標的の同定を加速させる可能性がある。

要約

タンパク質性原線維含有物は、複数の神経変性疾患の重要な病理学的特徴である。アルツハイマー病(AD)の初期段階では、アミロイドβペプチドは細胞外空間でプロトフィブリルを形成し、徐々に成長し、大きなアミロイドプラークに成熟する種子として作用する。この基本的な理解にもかかわらず、脳内のアミロイド線維構造、組成、および沈着パターンに関する現在の知識は限られている。1つの大きな障壁は、高度に精製されたアミロイド線維を脳抽出物から単離することができないことであった。アフィニティー精製およびレーザー捕捉マイクロダイセクションベースのアプローチは、以前はアミロイドを単離するために使用されてきましたが、回収できる少量の材料によって制限されています。この新規で堅牢なプロトコルは、スクロース密度勾配超遠心および超音波によるドデシル硫酸ナトリウム(SDS)可溶化を用いたアミロイドプラークコアの生化学的精製を記述し、AD患者およびADモデル脳組織から高純度の線維を生じる。精製された材料の質量分析(MS)ベースのボトムアッププロテオーム分析は、アミロイド線維のほぼすべての一次タンパク質成分を同定するための堅牢な戦略を表しています。アミロイドコロナエのタンパク質に関する以前のプロテオミクス研究は、予想外に大きく、機能的に多様なタンパク質の集合体を明らかにした。注目すべきことに、精製戦略を精緻化した後、共精製タンパク質の数は10倍以上減少し、単離されたSDS不溶性物質の高純度を示す。陰性染色および免疫金電子顕微鏡観察により、これらの調製物の純度の確認が可能となった。アミロイド封入物へのこれらのタンパク質の沈着に寄与する空間的および生物学的属性を理解するためには、さらなる研究が必要である。まとめると、この分析戦略はアミロイド生物学の理解を深めるのに良い位置にあります。

概要

アミロイドは、タンパク質の多様なパネルに見られる非常に安定した超分子配列であり、そのうちのいくつかは病理学的変化をもたらす¹。細胞内または細胞外のアミロイド凝集体の蓄積は、いくつかの神経変性疾患において観察^される2。アミロイド凝集体は不均一であり、多数のタンパク質および脂質で富化されている³。近年、アミロイドプロテオームへの関心は、基礎および翻訳神経科学者の間で大きな関心を生み出している。マウスおよび死後のヒト脳組織からアミロイド凝集体を抽出および精製するために、いくつかの方法が開発されている。レーザー捕捉マイクロダイセクション、免疫沈降、脱細胞化、およびアミロイド凝集体の生化学的単離は、アミロイドプラーク、線維、およびオリゴマー^を抽出および精製するために広く使用されている方法である^4,5,6,7。これらの研究の多くは、半定量的MSを使用して、これらの密に充填された線維性沈着物のタンパク質組成を決定することに焦点を当てている。しかし、利用可能な結果は一貫性がなく、以前に報告された驚くほど多数の共精製タンパク質は解釈が困難です。

ADおよびADマウスモデル脳におけるアミロイドコアプロテオームを記述する既存の文献の主な制限は、精製された材料が管理不能な数の共精製タンパク質を含むことである。この方法の全体的な目標は、この制限を克服し、アミロイド線維コアを単離するための堅牢な生化学的精製を開発することです。この戦略は、死後ADヒトおよびマウス脳組織からのSDS不溶性富化アミロイド画分の単離のために、先に記載したスクロース密度勾配超遠心ベースの生化学的方法を採用する^8、9。この方法は既存の文献に基づいていますが、超音波処理とSDS洗浄をさらに進めて、緩く結合したアミロイド関連タンパク質の大部分を除去し、高度に精製されたアミロイド線維の単離につながります(図1)。このプロトコールによって精製された線維は、脳抽出物から単離されたアミロイド線維の構造研究において頻繁に遭遇するいくつかの既存の課題を克服する。透過型電子顕微鏡(TEM)によるこれらのフィブリルの可視化は、精製された材料の完全性および純度を確認する(図2)。この研究では、単離されたフィブリルを可溶化し、トリプシンでペプチドに消化し、ラベルフリーMS分析により、フィブリルコアを形成するタンパク質の同一性を容易に明らかにすることができる。特に、これらのタンパク質のいくつかは、非膜結合細胞小器官において超分子集合体を形成する固有の傾向を有する。さらに、アミロイドβ(Aβ)線維の分析で同定されたタンパク質の多くは、他の神経変性疾患とも関連しており、これらのタンパク質が複数のプロテインオパチーにおいて重要な役割を果たしている可能性があることが示唆されている。

このSDS /超音波処理方法は、フィブリルコアの構造を変更または破壊する可能性は低いです。精製された材料は、幅広いトップダウンおよびボトムアッププロテオーム分析アプローチや、化学架橋や水素 - 重水素交換などの追加のMSベースの構造解析戦略にも適しています。この方法を用いた全体的な回収率は比較的高く、したがって、精製された材料のマイクログラム〜ミリグラムを必要とする詳細な構造研究に適している。精製された材料は、クライオEMおよび原子間力顕微鏡を用いた構造研究にも適している。このプロトコールは、哺乳動物の安定同位体標識と組み合わせて、アミロイド構造¹⁰の固体核磁気共鳴(NMR)研究を促進することができる。

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プロトコル

このプロトコルは、ヒトまたは脊椎動物の脳組織の使用を含む。すべての研究は、ノースウェスタン大学の承認された機関ガイドラインに準拠して実施されました。現在のワークフローは、APP−ノックイン(App NL−G−F^/NL−G−F)マウス脳皮質および海馬脳領域抽出物¹¹を用いて標準化されている。このプロトコルは、生後6〜9ヶ月のマウスからの脳抽出物に最適化されており、雄および雌の両方の動物からアミロイドを効果的に精製することができる。

注: 実験手順全体をよりよく理解するには、ワークフローの概略図について 図 1 を参照してください。

1. 組織採取とアミロイド精製

注:理想的には、アミロイド線維は、解剖したばかりの脳領域から単離されるべきである。しかし、この方法は、スナップまたはフラッシュ凍結した脳組織でもうまく機能します。以下は、後で使用するために保存するためのスナップ凍結脳組織の簡単な概要です。

1. 脳組織の採取と保存:マウスの脳を解剖し、アミロイドを含む領域(皮質と海馬)を素早く採取し、液体窒素またはドライアイスアルコール浴でスナップ凍結します。
   メモ:スナップ凍結は、組織の構成要素の構造的属性を保持するのに役立ちます。マウスをイソフルランおよび子宮頸部脱臼によって安楽死させる^12、13。CO2は脳プロテオームの完全性を損なう可能性があるため、使用を避けることをお勧めします。
2. 解剖後、アミロイド抽出前のより効率的な均質化を促進するため、新鮮な組織を小さなブロック(例えば、5mm x 5mm)に切断して保存します。組織を滅菌極低温バイアルに移し、キャップを締め、急速に水没させる。
3. 組織を超低温条件(すなわち、-80°Cまたは液体窒素)で凍結させてください。抽出を数日後に行う場合は、組織を-20°Cで保存し、凍結および融解サイクルを避けてください。抽出と精製の準備ができたら、凍結組織を湿氷で解凍します。
   注:組織と液体窒素を直接接触させると、組織やタンパク質に損傷を与える可能性があります。アルコール浴はチューブラベルから永久マーカーを除去することができることに注意してください。

2. SDS不溶性物質の濃縮

メモ:特に明記されていない限り、氷上ですべての手順を実行し、4°Cで遠心分離機してください。このプロトコルで使用されるすべてのバッファーおよびソリューションの詳細は、 補足ファイル 1 に記載されています。化学品および機器の製造業者およびカタログ番号は、 材料表に記載されています。

1. まず、解剖したばかりの脳組織領域またはスナップ凍結(氷上で解凍)を、6〜8個のセラミックビーズと新たに調製した氷冷均質化緩衝液(0.25〜1gの湿組織塊に対して1mL)を含む2mLチューブに入れた。
2. チューブをビーズミルホモジナイザーに移し、組織内容物を4000rpmで粉砕し、それぞれ30秒のサイクルを2サイクル、その間に30秒の間隔をあけます。
   注:あるいは、電動スターラーまたはホモジナイザーシステムを使用して、組織を粉砕および均質化することができます。
3. 15 mL チューブ内の脳全組織ホモジネート 1 mL に 9 mL の氷冷ホモジナイズバッファーを加え、実験室用ワックスフィルムストリップで密封し、4 °C で一晩エンドツーエンド回転させて、堅牢な可溶化を確保します。
   注:不要な大きな細胞破片や脂質を除去するには、翌朝、チューブを4°Cで800 x g で10分間回転させ、上清を新しいチューブに集めます。残りのペレットを2mLの氷冷ホモジナイズバッファーに再懸濁し、よく混合し、4°Cで10分間再びスピンし、2つの上清を結合する。
4. 固体スクロースを組織抽出物懸濁液に最終濃度1.2 Mになるようにゆっくりと加え、よく混合し、250,000 x g で4°Cで45分間遠心分離する。
5. ピペットを使用して上清を慎重に取り除き、廃棄します。粉砕することにより1.9 Mスクロースを含む2 mLのホモジナイズバッファーにペレットを再懸濁し、続いて4°Cで45分間125,000 x g で遠心分離した。
   メモ: バッファー容量は、前のステップから回収した材料の量に基づいて調整できます。一般に、このステップには10容量の均質化バッファー(V/V)が理想的です。
6. ピペットを使用して上部の白色固体層を集め、それを新鮮なチューブに移し、気泡を導入せずに数回上下にピペッティングすることによって1mLの氷冷洗浄バッファーに可溶化する。
7. 最上層とは別に、ペレットはまたアミロイド線維で富化されている。より高い収率を得るには、2つの分数を組み合わせて続行します。ピペットを使用して真ん中の水層を慎重に取り出し、廃棄する。
8. 合わせた画分を8000 x g で4°Cで20分間遠心分離する。 上清を捨てる。
9. 洗浄したペレットに氷冷消化バッファー1mLを加え、蘇生させ、室温(RT)で3時間インキュベートした。
10. 8000 x g で4°Cで20分間遠心分離し、ピペットを用いて上清を除去した。
11. 消化したペレットを1mLの氷冷トリス緩衝液に2回再懸濁して洗浄する(ステップ2.8と同じ)。
12. 洗浄したペレットを、上下にピペッティングすることにより、1% SDSおよび1.3 Mスクロースを含む1 mLの可溶化緩衝液に再懸濁する。200,000 x g で 4 °C で 60 分間素早く遠心分離します。
    注:アミロイド線維は洗剤および変性剤に対して高い耐性を有するが、洗剤に非常に長時間さらされると(1% SDS)、線維の完全性に影響を与えたり、強固に結合したタンパク質を除去したりして、その後の分析が損なわれる可能性がある。したがって、ペレットを再懸濁した直後に、遠心分離に進む。
13. ペレットを保存し、50mMのトリス緩衝液(比1:0.3)を加えてスクロース濃度を1.3から1Mに下げ、200,000 x g で4°Cで45分間遠心分離して、残りの上清の量を増やします。
14. 2つのペレットを0.5% SDSおよびアミロイド精製用プールを含む100μLのトリス緩衝液に溶解する。目に見えるペレットは小さく、不透明でオフホワイトに見えます( 図2A参照)。

3. アミロイド精製

注:2つのペレットを結合し、均一な溶液が得られるまでピペッティングによって可溶化し、アミロイド精製の以下のステップを続行する。

1. ペレット中に存在するアミロイドに富む材料の完全な可溶化のために、チューブを、20サイクルの間、中距離周波数で30秒ONおよび30秒OFFのために走る浴中超音波処理装置中の超音波によって生成される機械的剪断に晒す。
2. 直ちに材料を20,000 x g で4°Cで30分間遠心分離し、ペレットを500μLの0.5%SDS Tris緩衝液に再懸濁する。
3. 手順 3.1 を繰り返します。ステップ 3.2.合計5回の洗浄で4回。洗浄回数を増やして純度を向上させることができます。
   注:超音波処理および洗浄ステップは、より高い濃度がフィブリルの構造、完全性、またはタンパク質組成に影響を与える可能性があるため、0.5% SDSで最適化されています。このステップでSDS濃度を上げることは推奨されません。
4. 最終遠心分離工程の後、ペレットを200μLの超純水で洗浄し、20,000 x g で4°Cで30分間遠心分離して、残りの洗剤を除去した。精製アミロイド線維を含む洗浄ペレットは、色が半透明に見え、時には見えにくい。
5. 精製アミロイド線維を含む最終ペレットを100μLの超純水に溶解する。下流処理のために直ちに次のステップに進むか、さらなる分析のためにフィブリル懸濁液を-20°Cで保存する。凍った場合は、沈殿を開始する前に氷上で解凍してください。

4. メタノールクロロホルム沈殿

注:最終目標がタンパク質分析を実行することである場合は、脱塩して追加の非タンパク質性不純物を除去することをお勧めします。

1. 精製した100 μLのアミロイド線維に400 μLのメタノールを1.5 mLチューブとボルテックスウェルに加える。
2. チューブに100μLのクロロホルムを加え、よくボルテックスする。
3. 300μLの超純水とボルテックスを徹底的に加える。これにより、タンパク質沈殿のために混合物が曇ります。
4. 遠心分離機を 12,000 x g で RT で 2 分間。
5. タンパク質フレークを含む界面層を乱すことなく、水層(すなわち、上部)を注意深く除去する。
6. 同じ量のメタノールを再度加え、RTで12,000 x g で2分間遠心分離します。
7. ピペットを使用して上清を捨て、RTでペレットを風乾します。アミロイド画分は、過乾燥すると再溶解しにくい。

5. トリプシン消化

1. ペレットを50 μLの塩酸グアニジン(GuHCl)バッファーに溶解する。氷冷水浴中で超音波処理し、必要に応じて95°Cで5分間加熱する。
2. RTで45分から1時間かけてボルテックスを完全に溶かします。このステップの後、ペレットは見えなくなり、溶液は外観がはっきりと見えます。
3. 同じ量の0.2%界面活性剤溶液を加える。RTで60分間ボルテックスで可溶化する。このステップは、トリプシン酵素活性を増強する。
4. 500 mMのストック溶液から1 μLのトリス-2-カルボキシエチルホスフィン(TCEP)を加える。60分間インキュベートする。
5. 2 μLの500 mMヨードアセトアミド(IAA)を加え、暗所で20分間インキュベートする。
6. 5 μL の TCEP 溶液で IAA を 15 分間クエンチします。
7. 必要な量の50 mM重炭酸アンモニウム溶液をチューブに加え、グアニジン濃度を1.5 Mに下げます。
8. チューブに1%界面活性剤溶液(1 μL/50 μgのタンパク質)を加えます。
9. トリプシン(1 μg/100 μgのタンパク質)を加え、チューブ混合を37°Cで一晩放置する。

6. ペプチドのクリーンアップ

1. 翌朝、ギ酸を加えてpHを2.0に下げて消化ペプチド液を酸性化する。
2. 200 μL の 50% メタノール溶液を加えて 2 mL レシーバーチューブ内の C18 (n-オクタデシル) スピンカラムを活性化し、RT で 1500 x g で 2 分間スピンします。活性化ステップを繰り返します。
3. C18カラム樹脂床に200 μLの平衡化バッファーを加えて平衡化し、同条件で2分間紡糸した。この手順を繰り返します。
4. 酸性化ペプチド溶液を C18 カラムにロードし、RT で 1500 x g で 2 分間遠心分離します。フロースルーを収集し、もう一度リロードします。2 番目のフロースルーを破棄します。
5. ステップ6.3で行ったように、C18樹脂に結合したペプチドを洗浄バッファー2xで洗浄します。カラムの洗浄に同じ平衡化バッファーを使用します。
6. 溶出バッファーを 40 μL 加えてペプチドを溶出し、その後 RT で 1500 x g で 2 分間遠心分離します。溶出工程を 3 回繰り返して、回収したペプチドの収率を高めます。
7. 水溶液を蒸発させることにより速度真空濃縮器でペプチドを乾燥させる。乾燥ペレットは、MS分析の前に数週間-20°Cで保存することができます。

7. ペプチド分析用の質量分析計の設置

メモ: MS パラメータについては、 補足ファイル 1 (ラボの以前の出版物から採用)¹⁴ を参照してください。

1. MS分析のためにペプチドサンプルをロードする前に、乾燥ペプチドペレットを20μLのサンプルローディングバッファーに溶解し、マイクロBCAを実行して回収ペプチドの濃度を定量する。
2. 溶解したペプチドをガラスバイアルに移し、3μg(マイクロBCAから定量)のペプチドをUPLCシステムオートサンプラーに負荷します。
3. サンプルを通気トラップカラム(C18 HPLCカラム、0.075 mm x 20 mm)に流速250 nL/minでロードします。
4. トラップカラムを分析カラム(0.075 μm x 500 mm)に沿って配置し、2000 Vのスプレー電圧をかけてエレクトロスプレーイオン化(ESI)源にエミッタチップを組み立てます。
   注:この研究では、移動相が気相への高電圧イオン化を受けるESIが行われます。これにより作成されたスプレーは、加熱されたキャピラリーを介してMSの真空チャンバに送られます。真空下では、液滴の脱溶媒和およびイオンの放出は、熱および電圧の存在下で起こる。その後、イオンは、高電圧環境の存在下で質量分析器に向かって加速される。
5. 2時間の集録実行でサンプルを分析します。この研究は、最も強力なトップ20前駆体イオン選択パラダイムを有するデータ依存集録を用いて実施される。
   注:データ依存の取得では、限られた数の前駆体ペプチドがMS1スキャンで検出され、MS2分析のために断片化が行われます。しかし、非常に豊富なAβペプチドは断片化のために省略され、それらの量の過小評価をもたらすため、動的排除はここで問題となる。
6. Aβペプチドの絶対定量を行うには、標的MS/MS法を使用して同じサンプルをもう一度実行します。この研究のために、APPノックインマウスモデルのための様々な可能なトリプシンAβペプチドについてのすべてのm / z比の網羅的なリストが準備される( 補足表1を参照)。他の群は、利用可能なマウスモデルおよび目的のタンパク質から生成された可能性のあるペプチド(例えば、ADに対するAβ)に従って同様のリストを調製すべきである。
   注:非常に豊富なペプチドの排除に対処するには、Aβトリプシンペプチドに対応する選択されたm / z値のリストを提供することによって、標的化アプローチを使用する。このアプローチは、Aβペプチドのデータ依存的な排除の問題に対処し、異なるモノマー(Aβ38、40、および42ペプチド)の絶対量を高分解能で定量することができる。
7. 質量分析計は、ペプチドサンプルのMSスペクトルを生成し、生データファイルをターゲットディレクトリに保存します。このファイルを使用して、確立された統計およびバイオインフォマティクスツールを使用してスペクトルマッチングを実行します。複数のオンラインおよびオフラインのデータベース検索および分析ツールが利用可能です。

8. MSデータ解析

1. オフラインのRawconverterツール(http://www.fields.scripps.edu/rawconv/)を使用してMS1ファイルとMS2ファイルを抽出します。
2. WebベースのMSデータ検索エンジンでデータの識別、定量化、および詳細な分析を実行します。本研究では、統合プロテオミクスパイプライン-IP2(ブルカー:http://www.integratedproteomics.com/)を用いた。
   メモ:MaxQuant(https://www.maxquant.org/)など、他のいくつかのオンラインおよびオフラインMSデータ分析ツールが利用可能であり、使用することもできます。
3. MS1 および MS2 ファイルをアップロードした後、更新されたマウスプロテオームデータベースを選択します。ここでは、ProLuCIdおよびSEQUESTアルゴリズム¹¹を使用してペプチドを同定するために、追加のアプリノックイン特異的変異を含む更新されたマウスデータベースが選択される。
4. IP2分析システムで、デフォルトのパラメータを選択し、実験要件に従って変更します。この研究では、前駆体について50ppm、断片について600ppmのペプチド質量耐性が使用されている(IP2で使用される他のパラメータについては 、補足ファイル1 を参照のこと)。
   注:研究者は、実験目的に従って検索パラメータを変更することができます。例えば、翻訳後修飾を同定するために、種々のPTMについて差次修飾値(例えば、ユビキチン化、SUMOyl化、リン酸化)を加える。

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結果

ここで、改変スクロース密度勾配超遠心精製法を用いたアミロイド線維の単離精製の詳細な方法をまとめた( 図1参照)。この方法の革新は、非常に緻密で清潔な線維と共精製するアミロイド線維から多くの緩やかに関連するタンパク質を除去するSDS可溶化が続く水浴超音波処理システムを使用した超音波ベースの洗浄のステップを含めることです。超音波処理ステップは...

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ディスカッション

アミロイド構造と組成の明確な理解を発展させることは、AD脳組織から精製された線維を抽出する際の生物学的複雑さと実験上の制限のために、構造生物学者および生化学者にとって挑戦的である^16,17。アミロイド線維は分子レベルで多型であり、様々な長さおよび複雑さの不均一な集団を示す^18、19。そ?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acclaim PepMap 100 C18 HPLC column 0.075 mm x 20 mm	Thermo Scientific	164535	Alternative instruments, chemicals and antibodies from other manufacturers can be used
Ammonium bicarbonate	Sigma-Aldrich	9830
anti-amyloid beta (1-16) 6E10 antibody	Biolegend	803001
anti-amyloid beta (17-24) 4G8 antibody	Biolegend	800701
anti-amyloid beta (N terminus 82E1) antibody	IBL America	10323
anti-amyloid fibril LOC antibody	EMD Millipore	AB2287
BCA kit	Thermo Fisher Scientific	23225
Bioruptor Pico Plus	Diagenode	B01020001
Calcium Chloride	Sigma-Aldrich	C1016
Collagenase	Sigma-Aldrich	C0130
Complete  Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	11697498001
Dnase I	Thermo Fisher Scientific	EN0521
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS
Guanidine hydrochloride	Sigma-Aldrich	G4505
HyperSep C18 Cartridges	Thermo Fisher Scientific	60108-302
Integrated Proteomics Pipeline - IP2	http://www.integratedproteomics.com/
Iodoacetamide (IAA)	Sigma-Aldrich	I1149
K54 Tissue Homogenizing System Motor	Cole Parmer	Glas-Col 099C
MaxQuant	https://www.maxquant.org/
Micro BCA kit	Thermo Fisher Scientific	23235
Nanoviper 75 μm x 50 cm	Thermo Scientific	164942
Optima L-90K Ultracentrifuge	Beckman Coulter	BR-8101P-E
Orbitrap Fusion TribridMass Spectrometer	Thermo Scientific	IQLAAEGAAPFADBMBCX
Pierce C18 Spin Columns	Thermo Fisher Scientific	89870
Precellys 24 tissue homogenizer	Bertin Instruments	P000062-PEVO0-A
ProteaseMAX(TM) Surfactant Trypsin Enhancer	Promega	V2072
RawConverter	http://www.fields.scripps.edu/rawconv/
Sodium azide	VWR	97064-646
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	74255
Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002446
Speed Vaccum Concentrator	Labconco	7315021
Tris-2-carboxyethylphosphine (TCEP)	Sigma-Aldrich	C4706-2G
Tris-HCl	Thermo Fisher Scientific	15568025
Trypsin Gold-Mass spec grade	Promega	V5280
UltiMate 3000 RSLCnano System	Thermo Scientific	ULTIM3000RSLCNANO