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要約

マウス心臓移植モデルは、移植免疫学を研究するための貴重な研究ツールとなります。本プロトコルは、層流を可能にするためにレシピエントの総頸動脈およびドナーの肺動脈幹にカフを配置することを含むマウス異所性頸部心臓移植を詳述する。

要約

心臓移植のマウスモデルは、虚血再灌流損傷、移植後の自然免疫応答および適応免疫応答、および移植片拒絶反応に対する免疫調節療法の影響を研究するために頻繁に利用されています。マウスにおける異所性頸部心臓移植は、縫合吻合を用いて1991年に最初に記載され、その後、カフ技術を含むように改変された。この変更により成功率が向上し、それ以来、さらなる技術的改善を提案する複数の報告がありました。しかし、移植片の吻合に関連する技術的な困難のために、より広範な利用への変換は依然として制限されており、血管の吻合部のねじれや過度の張力を避けるためにカフの適切な長さと口径を達成するための精度が必要であり、移植片の損傷につながる可能性があります。本プロトコルは、血流の方向に沿ってレシピエントの共通頸動脈およびドナーの肺動脈上にカフ留置することを含む、マウスにおける異所性頸部心臓移植を行うための修正技術を記載する。

概要

Abbottらは、 1964年にラットにおける異所性腹部心臓移植の最初の説明を発表しました。これらの手術技術は、1969年に小野らによって洗練され、簡素化されました2。Corryらは、1973年にマウスにおける異所性腹部心臓移植の方法を最初に記述した。以前に報告されたラットモデルと同様に、これは、ドナーの肺動脈の末端から側への吻合による血行再建を伴う宿主の腹部への生着と、レシピエントの下大静脈および腹部大動脈への上行大動脈をそれぞれ伴いました3。ラットにおける異所性頸部心臓移植は、1971年にヘロンによって16 G(外径1.6 mm)の静脈内カテーテルから作られたテフロンカフを使用して説明されました4。Chen5 とMatsuuraら6 は、1991年にマウスにおける異所性頸部心臓移植を報告したが、その技術は主に再吻合の方法において異なっていた。Chenのアプローチには、ドナーの上行大動脈をレシピエントの頸動脈に縫合し、ドナーの肺動脈をレシピエントの外頸静脈に縫合することが含まれていました5。これらの顕微手術縫合吻に必要な高度な技術技術により、高い成功率を達成するにはかなりの時間と経験が必要でした。松浦らは、ヘロンが使用しているものと同様の非縫合カフ技術を利用する方法について説明し、カフの管腔外配置を使用したエンドツーエンドの吻合を含む。彼は、22 G(外径0.8 mm)と24 G(外径0.67 mm)の静脈内カテーテルからテフロンカフを作り、レシピエントの外頸静脈と総頸動脈の上にそれぞれ配置しました6。次に、これらのカフをドナーの肺動脈と大動脈の内側に配置し、接続の周りに縫合糸結紮糸を結ぶことによって固定しました。このアプローチは、成功率の向上につながりました。最も重要なことは、両方の頸部吻合を完了するのに必要な時間が短縮され、移植片の温虚血時間が腹部縫合法を利用した時間の3分の1未満に短縮されたことです。さらに、カフは血管の外面の周りに配置されているため、血管内腔に異物が露出することがなく、手術後の血栓症の可能性が大幅に減少します7。一方、カフ技術の利用は、縫合を必要とせずに吻合部位の血管周辺をサポートし、血行再建術後の出血のリスクを低減します6。

この手法の多数の改訂が提案されています。マウスの総頸動脈の長さ(約5mm)に対応するために、冨田ら8は、縫合糸の保持を省略し、代わりに細い鉗子でカフを通して動脈を直接引っ張りながら、より小さな動脈カフ(外径0.6mm)でこの技術の修正を開発しました。Wangらは、ドナーの右肺動脈とレシピエントの右総頸動脈にそれぞれ22Gと24Gのカフを配置することにより、このアプローチをさらに簡素化しました9。特殊なカフ、顕微手術クランプ、血管拡張器、および心臓麻痺の使用を含む、これらのアプローチに対するさまざまな報告が説明されています10、11、12。特に、これらの方法はすべて、血液がレシピエントの総頸動脈からドナー大動脈、冠状動脈、冠状静脈洞に流れ、次に右心房に空になり、肺動脈からレシピエントの外頸静脈に流れ込む、心臓を通る血液の逆行性循環を伴う。

腹部の生着と比較して、頸部心臓移植には複数の利点があります。前述のように、子宮頸部曝露により、より迅速な血行再建術とより短い温虚血時間が可能になります6。子宮頸部法も侵襲性が低く、開腹術を回避するため、術後の回復時間が短くなります6。重要なことに、端から側への吻合の代わりに、カフによる端から端までの吻合を行うことができ、吻合出血などの合併症のリスクが減少します。腹部アプローチはまた、腹部大動脈または下大静脈に血栓性合併症を発症するリスクを高め、脊髄虚血および後肢麻痺を引き起こす。移植の表在子宮頸部の位置は、触診、心電図、および侵襲的または非侵襲的イメージングによる移植片生存率評価への容易なアクセスを可能にする。子宮頸部移植片は再灌流後に自発的な心臓活動を再開しますが、レシピエントの収縮期および拡張期のパラメーターに大きな影響を与えません。このモデルは、虚血再灌流障害や移植片拒絶反応など、移植後の細胞応答を研究するための貴重な洞察を提供します。さらに、このモデルは、生体内2光子顕微鏡や陽電子放出断層撮影(PET)イメージングなどの移植後のイメージングを可能にする理想的なアプローチを提供します。この目的のために、私たちの研究室は、虚血再灌流損傷時およびアテローム硬化性プラーク内の白血球輸送をそれぞれ可視化するために、異所性子宮頸部移植後のマウス心臓および大動脈弓移植片を含む、マウスの移動組織および臓器を画像化する方法を以前に報告しています13,14,15。.さらに、その表面的な位置と曝露の容易さのために、このモデルは心臓再移植に適しています16。

この報告では、血流が発生する血管に血管カフを外部に配置することで層流血流を可能にする技術について説明します。これにより、ある血管から次の血管への血流のスムーズな移行が可能になり、遠位血管端が血管内腔に露出するのを回避できます。さらに、この技術は、ドナーの肺動脈に、以前に使用されていた22Gカフの代わりに、より大きな20Gカフを利用して、レシピエントへの血流の十分な戻りを保証します。

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プロトコル

すべての動物の取り扱い手順は、NIHの実験動物のケアと使用のガイドラインに準拠して実施され、ワシントン大学医学部の動物研究委員会によって承認されました。C57BL/6(B6)およびBALB/cマウス(体重20-25g)の心臓を、性別を一致させたB6レシピエント(6-8週齢)に移植した。マウスは市販の供給源から入手した( 材料表参照)。虚血再灌流障害に関連する細胞応答を評価するために同系移植を行い、移植片耐性と拒絶反応に関与する免疫メカニズムを調べるために同種異系移植を実施しました。B6リゾチームM-green蛍光タンパク質(LysM-GFP)レポーターマウス17は、もともとカリフォルニア州ラホーヤのラホーヤアレルギー免疫学研究所のクラウスレイから入手し、その後私たちの施設で飼育し、心臓移植片への好中球浸潤を視覚化するための選択された実験のレシピエントとして使用されました。生存手術は無菌処置を用いて行われた。

1. 寄付者の手続き

  1. ケタミン(80-100 mg / kg)とキシラジン(8-10 mg / kg)( 材料の表を参照)をドナーマウスに腹腔内注射してマウスを麻酔します。.つま先と尾のつまみで麻酔の手術面を確認します。
  2. 電気かみそりを使用して胸と腹部から髪を剃ることによって手術領域を準備します。
  3. 100単位のヘパリン( 材料の表を参照)を陰茎静脈(男性)または外頸静脈(男性または女性)に静脈内投与します。.
  4. マウスを前肢を頭上にして仰臥位に置きます。前肢と後肢をサージカルテープで固定し、0.75%ヨウ素と70%エタノールの3つの交互のスクラブで皮膚を消毒します。
  5. 臍から胸骨角(3〜4 cm)までの切開、正中開腹腔切開術を行い、続いて各肋骨縁(両側に2 cm)に沿って両側開胸術を行います。縦隔を完全に露出させるために、前胸壁を首の上に折ります。
  6. 胸腺を切除し、胸腔内下大静脈を露出させる。
  7. 放血のために腹部大動脈の幅を横切って横断する。
  8. 逆行性灌流の場合は、前述のように、1.5 mLの4°C生理食塩水を胸腔内下大静脈に注入し、針を移植片に向けて上向きにします13。
  9. 8-0を使用して上大静脈を結紮する絹の縫合糸と遠位に分けます。
  10. 下大静脈を介して別の1.5 mLの4°C生理食塩水を注入することにより、逆行性灌流を繰り返します。
  11. 8-0を使用して下大静脈を結紮する絹の縫合糸と遠位に分けます。
  12. 移植片採取のために大動脈弓と肺動脈幹を解剖し、両方を遠位に横断します。6-0シルク縫合糸を使用して心臓の後面の肺静脈を結睭化し、遠位に分割します。
  13. 胸腔からドナー心臓を摘出して移植片の準備を行います。切除した心臓を4°Cのヘパリン化生理食塩水で満たされたプラスチック容器に1〜2分間入れます。カフを配置するために、氷で満たされた滅菌プラスチックフラスコに移植片を移します(図1A)。
    注意: ドナーの肺動脈カフを配置するには、心臓移植片をフラスコに約5分間置いておく必要があります。
  14. 長さ1mmの20G血管カテーテル( 材料の表を参照)カフをドナーカフの肺動脈の上に置きます。細かい鉗子を使用して、動脈の端をカフの上にそっと折り返します。前述のように、折りたたまれた容器を10-0ナイロンタイを使用してカフに固定します18 (図1B、C)。
  15. ドナー心臓をヘパリン化生理食塩水または別の保存液に4°Cで保存します。
    注:虚血の長期保存のために特定の保存溶液(ウィスコンシン大学の溶液など)を好む人もいますが、費用がかかる可能性があります19。生理食塩水は、短期間の虚血(<1時間)20に適した代替手段である可能性があります。最終的に、保存溶液の選択は実験計画21に依存する。

2. 受取手続

  1. ケタミン(80-100 mg / kg)とキシラジン(8-10 mg / kg)を麻酔のためにレシピエントマウスに腹腔内注射します。.鎮痛のために徐放性ブプレノルフィン(0.5-1.0 mg / kg)を皮下注射します。.つま先と尾のつまみで麻酔の手術面を確認します。
  2. 電気かみそりを使用して頸部から髪を剃ることによって手術領域を準備します。角膜の乾燥を防ぐために、滅菌済みの薬用ではない眼科用軟膏を目に塗ります。
  3. 前肢を体に隣接させ、頭をわずかに左に向け、動物を仰臥位に置きます。前肢と後肢をサージカルテープで固定します。0.75%ヨウ素と70%エタノールの3つの交互のスクラブで皮膚を消毒します。
  4. 下顎骨から胸骨まで正中線頸部切開を行います。
  5. 右胸鎖乳突筋を横断します。顎下腺の右葉を切除して、移植片移植のためのスペースを作ります。
  6. 6-0シルク縫合糸を使用して、近位外頸静脈の上にスリップノットを結びます。遠位外頸静脈と隣接する枝を8-0を使用して結睭化しますシルク縫合糸。外頸静脈の前壁を横切開します。
  7. 10-0ナイロン縫合糸を近位外頸静脈とその下にある組織のエッジに通して、カフ挿入中に静脈を固定します(図1D)。
  8. 8-0を用いて右総頸動脈遠位位を結紮する絹縫合糸は頸動脈分岐部よりちょうど劣っている。6-0シルク縫合糸を使用して、近位総頸動脈にスリップノットを結びます。縫合糸の間で動脈を遠位に横断します。
  9. ドナーカフと同様に、長さ0.6mmの24G血管カテーテルカフをレシピエントの右総頸動脈の上に置きます。細かい鉗子を使用して、動脈の端をカフの上にそっと折り返します。10-0ナイロンタイを使用して、折りたたまれた容器を袖口に固定します。
  10. ドナーの心臓を右頸部より上に置きます。
  11. 移植中は数分ごとに冷たい生理食塩水を心臓移植片に滴下します。
  12. 10-0ナイロン縫合糸をドナー大動脈の端と下にある組織の表面的な咬傷を通して配置して、移植片を所定の位置に固定します(図1E)。
  13. ドナー大動脈を0.5 mLの0.9%ヘパリン化生理食塩水で洗い流します。.
  14. レシピエントの総頸動脈カフをドナー大動脈に挿入します。8-0で吻合を確保シルクネクタイ(図1F)。大動脈アンカー縫合糸を取り外します。
  15. レシピエントの外頸静脈を0.5 mLの0.9%ヘパリン化生理食塩水で洗い流して、外頸静脈の空気抜きを行います。.
  16. ドナー肺動脈カフをレシピエントの外頸静脈に挿入して肺動脈吻合を行い、8-0で固定しますシルクネクタイ(図1G)。外頸静脈アンカー縫合糸を取り除き、外頸静脈の残りの後壁を横断して、移植片を下にある組織から解放します。吻合部がねじれたりねじれたりすることなく、移植片が適切に配置されていることを確認してください。
  17. レシピエントの外頸静脈のスリップノットを解放し、続いて総頸動脈を解放して、心臓移植片の再灌流を開始します(図1H)。
  18. 中断された6-0ナイロン縫合糸を使用して頸部皮膚切開を閉じます。

3.術後ケア

  1. 手術直後にレシピエントを温かい回復室に入れ、麻酔から完全に回復するまで注意深く監視します(約1時間)。
  2. 手術後少なくとも72時間、動物を注意深く監視し続け、嗜眠、震え、急速な呼吸、食欲不振などの異常な行動の兆候がないか確認します。.
  3. 疼痛管理のために、カルプロフェン(5 mg / kg)を8〜12時間ごとに皮下注射して鎮痛し、さらに皮下ブプレノルフィン(0.05 mg / kg)を8〜12時間ごとに24〜48時間注射します手術終了時から。.

4. 心臓移植片における白血球輸送の生体内二光子イメージング

  1. 麻酔のための移植片再灌流の17 2時間後に、ケタミン(80-100 mg / kg)とキシラジン(8-10 mg / kg)をB6 LysM-GFPレシピエントマウスに腹腔内に注射します。.
  2. 前述のように、20G血管カテーテルを使用して口腔気管挿管を行います18。
  3. 血管カテーテルをマウスの人工呼吸器からのチューブに接続し、120呼吸/分の速度で室内空気と0.5mLの一回換気量で換気します18。
  4. 前述のように、12 μLの655 nm非標的量子ドット(材料の表を参照)を注入し、50 μLのPBSに静脈内投与します。
  5. 首の切開を再開して、心臓移植片を露出させます。マウスを安定化チャンバーに入れます。
  6. 組織接着剤の薄いリング( 材料の表を参照)を使用して左心室の自由壁の一部を固定し、上部チャンバープレートに取り付けられたガラスカバーガラスに適用します。
  7. チャンバーを2光子顕微鏡対物レンズの下に置き、前述のように画像とビデオを取得します(前述の13)。

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結果

このマウス子宮頸部異所性心臓移植モデルは、当研究室で1,000件以上の移植を行うために利用されており、生存率は約97%です。成功率は、マウスにおける他の子宮頸部異所性心臓移植技術を用いた以前の報告よりもわずかに高い10、11、20である。これは、レシピエントへの血流の十分な戻りを確保するためにドナー肺動脈?...

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ディスカッション

この技術を利用することで、マウスの異所性子宮頸部心臓移植は、経験豊富なマイクロ外科医が40分未満、エントリーレベルのマイクロ外科医が約60分で行うことができます。子宮頸部心臓移植は多くの動物モデルで研究されてきましたが、マウスモデルは、複数の明確に定義された遺伝的株、遺伝子改変能力、およびモノクローナル抗体を含む多数の試薬の入手可能性により、依然としてゴ...

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開示事項

著者は開示するものは何もありません。

謝辞

DKは、国立衛生研究所の助成金1P01AI116501、R01HL094601、R01HL151078、退役軍人管理メリットレビュー助成金1I01BX002730、およびバーンズユダヤ病院財団によってサポートされています。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
6-0 braided silk tiesHenry Schein Inc7718729
0.75% Providone iosine scrubPriority Care IncNDC 57319-327-0
10-0 nylon sutureSurgical Specialties CorporationAK-0106
655-nm nontargeted Q-dotsInvitrogenQ21021MP
70% EthanolPharmco Products Inc111000140
8-0 braided silk tiesHenry Schein Inc1005597
Adson forcepsFine Science Tools Inc91127-12
BALB/c and C57BL/6 mice (6-8 weeks)Jackson Laboratories
Bipolar coagulatorValleylab IncSurgII-20, E6008/E6008B
Carprofen (Rimadyl) injectionTranspharm35844
Carprofen (Rimadyl) oral chewable tabletTranspharm38995/37919
Custom-built 2P microscope running ImageWarp acquisition softwareA&B Software
Dumont no. 5 forcepsFine Science Tools Inc11251-20
Fine vannas style spring scissorsFine Science Tools Inc15000-03
GraphPad Prism 5.0Sun Microsystems Inc.
Halsey needle holderFine Science Tools Inc91201-13
Halsted-Mosquito clamp curved tipFine Science Tools Inc91309-12
Harvard Apparatus mouse ventilator model 687Harvard ApparatusMA1 55-0001
Heparin solution (100 U/mL)Abraxis Pharmaceutical Products504031
ImarisBitplane
Ketamine (50 mg/kg)Wyeth206205-01
Microscope—Leica Wild M651 × 6–40 magnificationLeica Microsystems
Moria extra fine spring scissorsFine Science Tools Inc15396-00
Ohio isoflurane vaporizerParkland ScientificV3000i
QdotsThermoFisher1604036
S&T SuperGrip Forceps angled tipFine Science Tools Inc00649-11
S&T SuperGrip Forceps straight tipFine Science Tools Inc00632-11
Sterile normal saline (0.9% (wt/vol) sodium chlorideHospira IncNDC 0409-4888-20
Sterile Q-tips (tapered mini cotton tipped 3-inch applicators)Puritan Medical Company LLC823-WC
Surflow 20 gauge 1/4-inch Teflon angiocatheterTerumo Medical CorporationSR-OX2032CA
Surflow 24 gauge 3/4-inch Teflon angiocatheterTerumo Medical CorporationR-OX2419CA
ThermoCare Small Animal ICU System (recovery settings 3 L/min O2, 80 °C, 40% humidity)Thermocare Inc
VetBondSanta Cruz Biotechnology SC361931NC0846393
Xylazine (10 mg/kg)Lloyd Laboratories139-236

参考文献

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