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要約

本プロトコルは、ニューロンK-Cl共輸送体KCC2の機能と活性を研究するためのウェスタンブロッティング技術の適用を強調しています。このプロトコルは、ウェスタンブロッティング による キナーゼ調節部位Thr906/1007でのKCC2リン酸化の調査について説明しています。また、KCC2活性を確認するための追加の方法は、このテキストで簡単に強調されています。

要約

塩化カリウム共輸送体2(KCC2)は、ニューロンにのみ見られるカチオン塩化物共輸送体(CCC)の溶質キャリアファミリー12(SLC12)のメンバーであり、Cl- 恒常性の適切な機能とその結果としての機能的なGABA作動性阻害に不可欠です。KCC2の適切な調節の失敗は有害であり、てんかんを含むいくつかの神経疾患の有病率と関連しています。KCC2の調節に関与するメカニズムの理解に関してはかなりの進歩があり、研究者がその機能と活動を研究できるようにする技術の開発に認定されています。直接的(キナーゼ調節部位のリン酸化の評価)または間接的(GABA活性の観察およびモニタリング)調査 のいずれかを介して 。ここでは、キナーゼ調節部位(Thr906およびThr1007)でのKCC2リン酸化をウェスタンブロッティング技術を使用して調べる方法を強調しています。ルビジウムイオンやタリウムイオン取り込みアッセイなど、KCC2活性を直接測定するために使用される他の古典的な方法があります。パッチクランプ電気生理学などのさらなる技術を使用して、GABA活性を測定します。したがって、細胞内塩化物イオン恒常性の評価によって知らされた活性化および/または不活性化KCC2を間接的に反映します。これらの追加のテクニックのいくつかについては、この原稿で簡単に説明します。

概要

塩化カリウム共輸送体2(KCC2)は、ニューロンにのみ見られるカチオン塩化物共輸送体(CCC)の溶質キャリアファミリー12(SLC12)のメンバーであり、Cl-恒常性の適切な機能、およびその結果としての機能的なGABA作動性阻害に不可欠です1,2,3,4。KCC2による4-6 mMの低神経内Cl-濃度([Cl-]i)の維持は、脳および脊髄におけるγ-アミノ酪酸(GABA)/グリシンの過分極およびシナプス阻害を促進する5。KCC2の適切な調節の失敗は、てんかん4を含むいくつかの神経疾患の有病率と関連しています。さらに、KCC2を介したCl-押し出しの減少、および過分極GABAAおよび/またはグリシン受容体媒介電流の障害は、てんかん、神経因性疼痛、および痙縮に関係しています6,7。ニューロンKCC2は、リジンなし(WNK)-STE20/SPS1関連プロリン/アラニンリッチ(SPAK)/酸化ストレス応答性(OSR)キナーゼシグナル伝達複合体1によるC末端細胞内ドメイン内の主要な調節残基のリン酸化を介して負に調節され、未熟ニューロンにおける脱分極GABA活性の維持を促進します2,8,9.WNK-SPAK/OSR1は、スレオニン残基906および1007(Thr906/Thr1007)をリン酸化し、続いてKCC2のmRNA遺伝子発現を下方制御し、その結果、その生理学的機能を低下させます8,10。しかし、さらに重要なことに、WNK-SPAK/OSR1キナーゼ複合体がKCC2発現をリン酸化および阻害することが知られており1,2,4,11,12、およびThr906/Thr1007をリン酸化するキナーゼ複合体シグナル伝達経路の阻害がKCC2 mRNA遺伝子の発現増加と関連していることはすでに事実です13,14,15。.タンパク質リン酸化を介したニューロンKCC2およびNa+-K+-2Cl-共輸送体1(NKCC1)発現の調節は、同時に、逆のパターンで機能することに注意することが重要です1,4,16。

KCC2の調節に関与するメカニズムの理解に関しては、研究者がその機能と活動を研究できるようにする技術の開発に認定された、一貫したかなりの進歩がありました。直接的(キナーゼ調節部位のリン酸化の評価)または間接的(GABA活性の観察およびモニタリング)調査 のいずれかを介して 。ここで紹介するプロトコルは、キナーゼ調節部位Thr906/1007での共輸送体のリン酸化を調べることにより、ニューロンK+-Cl- 共輸送体KCC2の機能と活性を研究するためのウェスタンブロッティング技術の応用を強調しています。

ウェスタンブロットは、組織または細胞のサンプルから目的の特定のタンパク質を検出するために使用される方法です。この方法では、まず電気泳動によってタンパク質をサイズ別に分離します。次に、タンパク質を固体支持体(通常はメンブレン)に電気泳動で転写してから、特異的抗体を使用して標的タンパク質をマーキングします。抗体は、比色法、化学発光法、または蛍光法のいずれかを使用して検出されるさまざまなタグまたは蛍光色素標識抗体に結合されます。これにより、タンパク質の混合物から特定の標的タンパク質を検出することができます。この技術は、KCC1 のリン酸化特異的部位を特徴付けるために使用されており、KCC3 Thr991/Thr1048リン酸化を阻害するキナーゼ阻害剤を同定するために使用されています17。このプロトコルに従うことにより、細胞/組織溶解物から総リン酸化KCC2を特異的に検出することができます。原理的には、本手法によるタンパク質結合抗体の検出は、KCC2のリン酸化部位における協同活性の理解に役立ち、その生理制御に関わる分子機構の解明に大いに役立ちます。全タンパク質発現の定量分析は、KCC2の機能と活性を代表するものです。KCC2活性を直接測定するために使用される他の古典的な方法、例えばルビジウムイオンおよびタリウムイオン取り込みアッセイがある。パッチクランプ電気生理学などのさらなる技術を使用して、GABA活性を測定します。したがって、細胞内塩化物イオン恒常性の評価によって知らされた活性化および/または不活性化KCC2を間接的に反映します。

プロトコル

注:このプロトコルでは、目的の特定のタンパク質を検出するためのウェスタンブロッティング法について説明しています。

1. 細胞培養とトランスフェクション

  1. 細胞培養手順の前に、すべての試薬をビーズバス(37°C)で温めます。10%ウシ胎児血清、各1%2mM L-グルタミン1%、非必須アミノ酸100x、ピルビン酸ナトリウム100 mM、およびペニシリン-ストレプトマイシン100単位を添加した培養培地、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)を準備します。
  2. ヒト胚性腎臓293細胞(HEK293rnKCC2b)18 をビーズバス(37°C)中で安定にトランスフェクトしたラットKCC2bを完全に解凍する。細胞をクライオバイアルチューブから5 mLの新鮮な培地を含む遠沈管に移します。セルを1200 ×gで3〜5分間回転させます。
  3. アスピレーターピペット(真空ポンプに固定)を使用して上清を吸引し、10 mLの新鮮な培地を加えて細胞を再懸濁します。細胞懸濁液を10cmのディッシュプレートに移す。
  4. 皿をインキュベーターに入れ、加湿した5%CO2 雰囲気中で37°Cで48時間増殖させます。健康な細胞増殖を確実にするために潜伏期間を監視します。インキュベーション期間後に90%以上のコンフルエントに達した細胞をさらに分割します。
  5. 細胞皿から古い培地を吸引し、2 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を穏やかに洗い流します。2 mLのトリプシンを加え、室温で約1〜2分間インキュベートします。
  6. 2 mLの完全培地を使用して、ディッシュ内のトリプシン処理細胞を穏やかに洗浄します。9 mLの新鮮な培地を新しい皿に加え、古い皿から1 mLの溶液を新しい皿のそれぞれに加えます。スプリットセルディッシュをインキュベーターに48時間戻し、90%のコンフルエンシーを達成≥。
  7. 細胞を溶解バッファーで回収する前に、コントロールとしてジメチルスルホキシド(DMSO)、8 μMスタウロスポリン、または0.5 mM N-エチルマレイミド(NEM)のいずれかで15分間処理します。

2. 細胞ライセートの調製とサンプルのローディング

  1. 培養皿上の培地を吸引します(トランスフェクション手順から)。細胞培養物を氷上に置き、氷冷したPBSで細胞を洗浄します。
  2. PBSを吸引し、50 mMトリス塩酸塩(pH 7.5)、1 mMエチレングリコールビス(β-アミノエチルエーテル)-N,N,N′,N′-四酢酸(EGTA)、1 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、50 mMフッ化ナトリウム、5 mMピロリン酸ナトリウム、10 mMナトリウム-β-グリセロリン酸、1 mMオルトバナジン酸ナトリウム、1%(w / v)トリトンX-100、0.27 Mスクロースを含む1 mLの氷冷溶解バッファーを加えます。 1 mMベンザミン、0.1%(v / v)2-メルカプトエタノール、および2 mMフェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)をディッシュに。
    注:細胞回収時の溶解バッファーの容量はディッシュのサイズによって異なりますが、例えば、1 x 107 セル/100 mmディッシュ/150 cm2 フラスコあたり1 mLの溶解バッファーが適しており、5 x 106 セル/60 mmディッシュ/75 cm2 フラスコあたり0.5 mLが適しています。
  3. 冷たいプラスチック製のセルスクレーパーを使用して皿の底から細胞をこすり落とし、次にピペットを静かに使用して、細胞懸濁液をすでに氷上にあるマイクロ遠心チューブに移します。チューブを4°Cで30分間絶えず攪拌します。
  4. 細胞溶解物を16,000 x g の冷たい遠心分離機(4°C)で20分間回転させ、チューブを遠心分離機からそっと取り出して氷上に置きます。上清を予冷した新鮮なチューブに集め、ペレットを廃棄します。
    注:細胞の種類によっては、遠心分離力と時間を変える必要がある場合があります。ただし、一般的なガイドラインでは、16,000 x g で20分間遠心分離することを推奨しています。ただし、これは実験ごとに決定する必要があります。たとえば、白血球のような繊細な細胞には、非常に軽い遠心分離速度が必要です。

3. 細胞溶解液からの免疫沈降剤の調製

  1. 300 μLのタンパク質-G-セファロースをマイクロ遠心チューブにピペットで入れます。溶液を500 x g で2分間回転させ、上清を廃棄します。
  2. 500 μLのPBSを加え、溶液をよくボルテックスします。溶液を500 x g で2分間回転させ、上清を廃棄します。この手順を繰り返します。
  3. 1 mgの抗KCC2 Thr906および抗KCC2 Thr1007抗体を200 μLのタンパク質G-セファロースビーズと混合し、PBSで500 μLの容量に構成します。振動プラットフォームまたは回転ホイールで4°Cで2時間振とうします。 PBSで2回洗浄します。
  4. 細胞ライセート全体に対してタンパク質定量を行い、洗浄したビーズに1 mgの細胞ライセートを加えます。エンドツーエンドのローテーターで4°Cで2時間穏やかにインキュベートします。 ビーズをスピンダウンし、150 mM塩化ナトリウム(NaCl)を含むPBSで3回洗浄します。
  5. 免疫沈降剤(ビーズ)を200 μLのPBSで3回洗浄します。最終ペレットを100 μLの1xドデシル硫酸リチウム(LDS)サンプルバッファーに再懸濁します。
  6. チューブをローターシェーカーで室温で5分間振とうし、75°Cの加熱ブロックで10分間インキュベートします。ローディングサンプルを11,000 x g で2分間遠心分離し、上清をゲルローディングに使用します。

4. ウェスタンブロットの実行

  1. キャスティング装置を組み立て、新しく調製した8%分離ゲル(レシピ/準備については 表1 を参照)を注ぎ、キャスティンググラスの上部から約2cmのスペースを確保してゲルをキャストします。200 μLの無水イソプロパノールをセットアップに加え、室温で60分間放置します。
    注:ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)のポリアクリルアミドゲルレシピは、目的のタンパク質のサイズによって異なります(表2)。したがって、目的のゲルパーセンテージを決定する前に、タンパク質のサイズをメモしてください。
  2. ピペットを使用してイソプロパノールを除去し、約200μLの蒸留水でゲルを注意深くすすぎます。新しく準備した6%スタッキングジェル(レシピ/準備については 表1 を参照)を追加して、キャスティングセットアップの約2cmのスペースを埋めます。ウェルコームにそっとはめ込み、室温で30分間放置します。
  3. キャストしたゲルを電気泳動タンクに固定します。
  4. トリス塩基30.3 g、グリシン144.1 g、SDS10 gを蒸留水1000 mLに溶解し、10xトランスファーバッファーを調製します。10 mLの10%SDSと100 mLの10xトランスファーバッファーを890 mLの蒸留水に加えて、1xランニングバッファーを調製します。
  5. 1xランニングバッファーをタンクに注ぎます。5 μLの分子量マーカーを最初のウェルにロードし、等量のタンパク質をSDS-PAGEゲルの各ウェルにロードします(使用するコームサイズに応じて18〜30 μL)。空のウェルを1x LDSで満たし、120 Vで約90〜120分間ゲルを実行します。
  6. 58.2 gのトリス塩基と29.3 gのグリシンを1000 mLの蒸留水に溶解し、10xトランスファーバッファーを調製します。20%メタノールを含む1xトランスファーバッファーでニトロセルロースメンブレンを活性化します。ゲルとメンブレンをトランスファーバッファーですすぎ、準備スタックに静かに広げます。
    注:ランニングバッファーとトランスファーバッファーのpHは、必要な最適なpHにする必要があるため、調整する必要はありません。また、時間を節約するために、実験の前にこれらのバッファーを準備して室温で保存することをお勧めします。
  7. 転写するサンドイッチを、負極(黒枠/端)-サンドイッチフォーム-ろ紙-すすぎSDS-PAGEゲル-すすぎニトロセルロースメンブレン-ろ紙-サンドイッチフォーム-正極(赤枠)の順に並べます。組み立てたサンドイッチをトランスファータンクに積み重ね、90Vで90分間、または30Vで360分間運転します。

5. 抗体染色と画像現像

  1. 膜を取り外して乾かします。0.1%の1x Tween 20(1x TBS-T)を含むトリス緩衝生理食塩水中の5%スキムミルクから作られたブロッキングバッファーを使用して、室温で1時間メンブレンをブロックします。
  2. 一次抗体8,15,19およびβ-アクチン(ローディングコントロール)の適切な希釈液を用いてメンブレンをブロッキングバッファー中で室温で1時間、または4°Cで一晩インキュベートします。 1x TBS-Tの3回の洗浄でメンブレンをそれぞれ5分間洗浄します。
    注:β-アクチン、α-チューブリン、またはグリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ抗体などのローディングコントロールを使用した個別のメンブレンのインキュベーションは、その後の定量中に他のウェスタンブロッティング結果を正規化することです。各一次抗体の推奨希釈率は、メーカーのマニュアルに記載されています。
  3. 洗浄したメンブレンをブロッキングバッファーで5000倍に希釈した二次抗体とともに室温で60分間インキュベートします。再度、メンブレンを1x TBS-Tでそれぞれ5分間3回洗浄します。
    注:二次抗体は、一次抗体が産生される種に対して産生させることを強くお勧めします。例えば、総KCC2の一次抗体がマウス抗KCC2である場合、抗マウスの二次抗体を使用する必要があります。
  4. 洗浄したメンブレンをイメージングボードに置きます。各増強化学発光(ECL)試薬を等量混合し、混合溶液をメンブレン上に穏やかに広げてシグナルを発生させます。

6. イメージングシステムによる画像取得とデータ定量化

  1. イメージングボードをイメージングシステムの適切なコンパートメントに移してイメージングします。画像処理のためにコンピュータ上のイメージングソフトウェアを開きます。
  2. ツール バーで、[新しいプロトコル] をクリックし、[シングル チャネル] を選択します。ゲルイメージング/アプリケーションダイアログボックスで選択をクリックし、ブロットまでスクロールして、ケミハイ感度またはケミハイ解像度のいずれかを選択します。次に、[信号蓄積設定]をクリックして、取得する画像の持続時間と数を設定します。
  3. プロトコル設定の下にある Position Gel をクリックし、必要に応じてイメージングシステムでゲルを調整します。[ プロトコルの実行 ] をクリックしてイメージを取得します。
  4. イメージングカタログボックスの下にある集録画像の1つを右クリックして、画像をコンピュータに保存します。目的の画像に移動し、[実行]ダイアログボックスの[ 画像の選択と続行 ]をクリックします。
  5. 画像変換アイコンをクリックして、画像のコントラストとピクセル彩度を調整します。一般ツールバーのスクリーンショットアイコンをクリックして、目的の画像形式に応じて画像をコンピューターに保存します。
  6. ImageJソフトウェアを使用してバンド密度を測定し、適切な統計ツールを使用して分析します。

結果

ここでは、図1に示す代表的な結果を、ウェスタンブロッティング技術を用いて、KCC2b(HEK rnKCC2b)18を安定発現するHEK293細胞株におけるWNK-SPAK/OSR1を介したKCC2およびNKCC1のリン酸化に対するスタウロスポリンおよびNEMの影響を調査した。代表的な結果に関する包括的な詳細は、Zhang et al.15で議論されている。NEMと同様に、ス?...

ディスカッション

KCC2を含むニューロンで発現されるCCCのSLC12の活性を測定するために多くの方法が用いられてきた。これらの技術の多くは、これらのトランスポーターの機能的関連性と、さまざまな疾患関連変異におけるそれらの構造機能パターンの分析に関する科学的知識を強化することが証明されています。重要なことに、さまざまな方法21には利点と注意点があります。しかし、上記?...

開示事項

著者は開示するものは何もありません。

謝辞

この研究は、英国王立協会(助成金番号IEC\NSFC\201094)、および連邦博士号奨学金によってサポートされました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
40% acrylamideSigma-AldrichA2917Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
Ammonium Per SulfateSigma-Aldrich248614Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
anti pSPAKDundee UniversityS670BUsed as primary antibody for western blotting
anti-KCC2Dundee UniversityS700CUsed as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pSer940Thermo Fisher ScientificPA5-95678Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pThr1007Dundee UniversityS961CUsed as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pThr906Dundee UniversityS959CUsed as primary antibody for western blotting
anti-mouseCell Signalling technology66002Used as secondary antibody for western blotting
anti-NKCC1Dundee UniversityS841BUsed as primary antibody for western blotting
anti-NKCC1 pThr203/207/212Dundee UniversityS763BUsed as primary antibody for western blotting
anti-rabbitCell Signalling technologyC29F4Used as secondary antibody for western blotting
anti-sheepabcamab6900Used as secondary antibody for western blotting
anti-SPAKDundee UniversityS669DUsed as primary antibody for western blotting
anti-β-Tubulin IIISigma-AldrichT8578Used as primary antibody for western blotting
BenzamineMerck UK135828Used as component of lysis buffer
Beta-mercaptoethanolSigma-AldrichM3148Used as component of loading buffer and lysis buffer
Bradford CoomasieThermo Scientific1856209Used for lysate protein quantification
Casting apparatusAtto WSE-1165WUsed to run SDS-page electrophoresis
CentrifugeEppendorf5804Used in lysate preparation
CentrifugeVWRMicroStar 17RUsed for spinning samples
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD2650-100MLUsed for cell culture experiment
Dried Skimmed MilkMarvelN/AUsed to make blocking buffer
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucoseSigma-AldrichD6429Used for cell culture
ECL reagentPerkin ElmerORTT755/2655Used to develop image for western blotting
EDTAFisher ScientificD/0700/53Used as component of lysis buffer
EGTASigma-Aldriche4378Used as component of lysis buffer
Electrophoresis Power SupplyBioRadPowerPAC HCTo supply power to run SDS-page electrophoresis
EthanolThermoFisherE/0650DF/17Used for preparing sterilized equipments and environment
Fetal Bovine Serum -  heat inactivatedMerck Life Sciences UKF9665Used for cell culture
FumehoodWalkerA7277Used for cell culture
Gel Blotting - WhatmanGE Healthcare 10426981Used in western blotting to make transfer sandwich
GlycineSigma-Aldrich15527Used to make buffers
GraphPad Prism SoftwareGraphPad Software, Inc., USAVersion 6.0Used for plotting graphs and analysing data for  western blotting
HClAcros Organics10647282Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
Heating blockGrantQBT1Used to heat WB loading samples
HEK293 cellsMerck UK12022001-1VLCell line for culture experiment
ImageJ SoftwareWayne Rasband and Contributors; NIH, USA ImageJ 1.53eUsed to measure band intensities from western blotting images
Imaging systemBioRadChemiDoc MPUsed to take western blotting images
IncubatorLEECLEEC precision 190DUsed for cell culture
IsopropanolHoneywell24137Used in casting gel for electrophoresis
L-glutamine solutionSigma-AldrichG7513Used for cell culture
Lithium dodecyl sulfate (LDS)NovexNP0008Used as loading buffer for western blotting
MEM Non-essential amino acid Merck Life Sciences UKM7145Used for cell culture
MicrocentrifugeEppendorf5418Used for preparing lysates for WB
Microplate readerBioRadiMarkUsed for lysate protein concentration readout
Microsoft PowerpointMicrosoft, USAPowerPoint2016Used to edit western blotting images
Molecular Weight MarkerBioRad1610373Used for western blotting
N-ethylmaleimideThermo Fisher Scientific23030Used for cell culture experiment
Nitrocellulose membraneFisher Scientific45004091Used for western blotting
Penicillin-StreptomycinGibco15140122Used for cell culture
pH MeterMettler ToledoSeven compact s210Used to monitor pH of buffer solutions
Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF)Sigma-AldrichP7626Used as component of lysis buffer
Phosphate Buffer SalineSigma-AldrichD8537Used for cell culture
PKCδ pThr505Cell Signalling technology9374Used as primary antibody for western blotting
Sepharose Protein GGeneronPG50-00-0002Used for immunoprecipitation
Sodium chlorideSigma-AldrichS7653Used as component of wash buffer
Sodium ChlorideSigma-AldrichS7653Used to prepare TBS-T buffer
Sodium Dodecyl SulfateSigma-AldrichL5750Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
sodium orthovanadateSigma-AldrichS6508Used as component of lysis buffer
Sodium PyruvateSigma-AldrichS8636Used for cell culture
sodium-β-glycerophosphateMerck UKG9422Used as component of lysis buffer
Staurosporine (from Streptomyces sp.)Scientific Laboratory Supplies, UKS4400-1MGUsed for cell culture experiment
SucroseScientifc Laboratory SuppliesS0389Used as component of lysis buffer
TEMEDSigma-AldrichT7024Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
Transfer ChamberBioRad1658005EDUUsed in western blotting to transfer protein on membrane
TrisSigma-AldrichT6066Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
Triton-X100Sigma-AldrichT8787Used as component of lysis buffer
Trypsin-EDTA SolutionMerck Life Sciences UKT4049Used for cell culture
Tween-20Sigma-AldrichP3179Used as make TBS-T buffer
Vacuum pumpCharles AustenDymax 5Used for cell culture
VortexScientific IndustriesK-550-GEUsed in sample preparation
Vortex mixerScientific Industries LtdVortex-Genie  K-550-GEUsed of mixing resolved sample
Water bathGrant Instruments Ltd. (JB Academy)JBA5Used to incubate solutions

参考文献

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