褐色脂肪組織活性の変化を検出するための赤外線サーモグラフィ

要約

ここでは、ヒトおよび実験動物における食後の褐色脂肪組織活性を測定するためのプロトコルを提示する。

要約

食後または肥満または糖尿病患者における^18F-フルオロデオキシグルコース(FDG)の蓄積を介した陽電子放出断層撮影コンピュータ断層撮影(PET-CT)による褐色脂肪組織(BAT)活性の測定は、選択方法として失敗します。主な理由は、¹⁸F-FDGがBAT細胞の膜上の同じグルコーストランスポーターについて食後の高グルコース血漿濃度と競合するためです。さらに、BATは脂肪酸をエネルギー源としても使用していますが、これはPET-CTでは見えず、肥満や糖尿病患者のグルコース濃度とともに変化する可能性があります。そこで、動物およびヒトにおけるBATの生理的重要性を推定するために、最近の刊行物で用いられている新しい赤外線サーモグラフィ法が適用される。

一晩絶食後、BAT活性は、ヒトボランティアおよび雌野生型マウスにおける食餌の前後に赤外線サーモグラフィにより測定した。カメラソフトウェアは、物体からの距離、皮膚の放射率、反射室温、気温、相対湿度を使用して物体の温度を計算します。マウスでは、BATの上の剃毛領域は、平均温度と最高温度が測定された関心領域でした。雌マウスにおける発情周期の段階は、クレシルバイオレット(0.1%)染色溶液で染色された膣塗抹標本による実験後に決定された。健康なボランティアでは、首の2つの皮膚領域が選択されました:鎖骨上領域(鎖骨の上、BAT細胞が存在する場所)と鎖骨間領域(鎖骨の間、BAT組織が検出されない場所)。BATアクティビティは、これら2つの値を減算することによって決定されます。また、皮膚領域の平均温度と最高温度は、動物と人間の参加者で決定することができます。

非侵襲的でより感度の高い方法である赤外線サーモグラフィによって測定された食後のBAT活性の変化は、実験動物において性別、年齢、および発情周期の段階に依存することが示されました。食事誘発性熱発生の一環として、ヒトにおけるBAT活性化は、性別、年齢、およびボディマス指数に依存することも証明されました。食後のBAT活性の病態生理学的変化をさらに決定することは、高グルコース血漿濃度(肥満および真性糖尿病2型)を有する参加者、ならびに異なる実験動物(ノックアウトマウス)にとって非常に重要である。この方法は、BAT活性を若返らせる可能性のある活性化薬を決定するための可変ツールでもあります。

概要

褐色脂肪組織(BAT)は、白色脂肪組織(WAT)とは対照的に、エネルギーを蓄えるのではなく、消費します。交感神経刺激を受けると、BATは脂肪酸とグルコースを利用し、脱共役タンパク質1(UCP1)の活性化によって熱を発生させます。UCP1の機能は、2つのミトコンドリア膜間のH⁺勾配を使用して、ATPの代わりに熱を生成することです。BATの機能は、低温条件下での熱生成を増加させることであり、これはエネルギー消費の増加につながります¹。低温曝露後、皮膚からの感覚入力は、視床下部視索前野(POA)の正中視索前(MnPO)核の温感受性ニューロンを阻害し、吻側眼瞼球(rRPa)に対するPOAニューロンの阻害効果を低下させます。rRPaニューロンの活性化は交感神経活動を増加させ、続いてBAT活性が増加する^2,3。寒冷誘発性BAT活性化は、ヒトのインスリン感受性を改善し⁴、この活性は、ボディマス指数(BMI)および^{年齢が増加し}たヒトでは減少します^1,5,6,7。

寒冷誘発性熱発生におけるその役割とは別に、食後、BATにおけるグルコース取り込みは除脂肪型男性集団で増加し、BAT陽性の男性被験者でより高い食事誘発性熱発生(DIT)に寄与する^8,9。BAT活性を測定するために使用される最先端の技術は、PET-CTとして知られる陽電子放出断層撮影コンピュータ断層撮影法です。この方法は、放射性トレーサーフルオロデオキシグルコース(^18F-FDG)の蓄積を測定することによってBAT活性を決定する。しかし、PET-CTは、食後のBATの活性化を検出するための選択方法として失敗します。その理由の1つは、食後、¹⁸F-FDGが同じグルコーストランスポーターについて食後高血糖と競合するため、特に健康な参加者と糖尿病の参加者のBAT活性を血糖値の違いと比較する場合、食後のBAT活性化を決定するのに不適切です。さらに、BATはPET-CTでは見えない熱生成のためのエネルギー源として脂肪酸を使用します。¹⁸名食後のBATにおけるF-FDG蓄積はほとんど見えない¹⁰ため、ほとんどの場合、否定的な結果として解釈されます。当然のことながら、最近、BATの活性化は、私たちが以前に考えていたよりもヒト集団においてより顕著であることが示唆されました。したがって、BAT活性とその代謝障害への関与を検出するための新しいアプローチが必要です⁷。この問題を解決する試みは、前糖尿病患者およびインスリン抵抗性を有する2型糖尿病(T2DM)患者における磁気共鳴画像法(MRI)によるBATの体積を測定することである¹¹。しかし、MRIで測定したBAT量は、BATによるグルコースや脂肪酸の日常機能や使用量を推定するための十分な指標ではありません。したがって、健康な患者と2型糖尿病患者のBAT活性の実際の差を推定するには、2型糖尿病患者のBAT機能不全の病理学的メカニズムを見つける可能性を提供する新しいアプローチが必要です。

BATの活性化を決定するために、赤外線(IR)サーモグラフィを使用して、食前後のBAT熱産生の測定を行いました(図1)^12,13。健康で肥満の個人または糖尿病患者の食後のBAT活性を測定するための選択方法としてIRサーモグラフィを確立することは、この分野に大きな影響を与えます。今日まで、IRサーモグラフィは^BAT13,14,15の低温誘発活性化の測定に使用されています。最近の人類の歴史では、寒さによるBAT活動はもはやあまり顕著ではありませんが(生息地の適切な加熱、適切な衣服のため)、食事後のBAT活性化は毎日発生します。さらに、視床下部を介したこれら2つのBAT機能の生理学的調節は完全に異なります。食後、視床下部弓状核(Arc)におけるプロオピオメラノコルチン(POMC)発現ニューロンの活性化は、rRPa16を介して交感神経活動の増加につながります。IRサーモグラフィまたはPET-CTによって測定されたBATの低温誘発活性化は、日常のBAT活動の尺度として使用すると不適切です。食後のBAT活性の増加に続いてグルコース利用が行われ、これはグルコース恒常性、インスリン感受性、およびグルコース濃度の毎日の調節を維持するために最終的に重要です。食後のBAT活性化は、食後のグルコース消費量の増加をもたらし、続いて熱産生および体温(DIT)の増加をもたらす。これは、性別、年齢、およびBMI依存であることが示されました¹²。食後のBAT活性化における同様の性差は、雄と雌の実験用マウスで観察されています¹⁷。これらの発見は、POMCニューロンの亜集団を介したBAT褐変の視床下部調節が雄と雌のマウスで異なることを示したBurkeらによって最近発見されたBATの調節の性差に対応しています¹⁸。BATの食後の活性化は、女性、高齢者、肥満の人では小さいです。食後のBAT活性化の欠如(グルコース利用率の低下)は、女性の耐糖能障害の有病率が高くなる可能性があります19,20,21,22。残念ながら、BAT活性化に関する研究の大部分は男性でのみ行われました。食後にBATを活性化することにより、痩せた男性集団のグルコース取り込みが増加します。BAT活性化後、BAT陽性の男性被験者でDITが高いことは驚くべきことではありません^8,9。さらに、雄マウスにおけるBAT移植は、耐糖能を改善し、インスリン感受性を増加させ、そして体重および脂肪量を減少させる²³。

PET-CTは、特に食後のBAT活性を測定するための選択方法として失敗します。したがって、非侵襲的でより感度の高い方法が開発されました。IRサーモグラフィは、性別、年齢、またはBAT活性に対するさまざまな病理学的状態の影響に関係なく、さまざまな実験動物(ノックアウトマウス)およびヒト参加者のBAT活性を推定することができます。この方法の追加の利点は、参加者と実験動物にとって単純であることであり、BATブースター療法の潜在的な利点を推定することができます。低温暴露または食事後のBATの生理学的挙動を決定するためのIRサーモグラフィを用いた最近の研究は、Brasilらの最近の出版物に記載されている²⁴。

プロトコル

実験動物に関するすべての実験手順は、国家倫理委員会と農業省によって承認されました(EP 185/2018)。実験は、クロアチア実験動物科学協会の倫理コーデックスおよびARRIVEガイドラインに従って実施されました。ヒト参加者を対象とした研究で実施されたすべての手順は、ヘルシンキ宣言に従い、ザグレブ大学医学部倫理委員会(UP/I-322-01/18-01/56)によって承認された。本研究では,3名の女性参加者(BMI:29kg/^m2 ±5kg/^m2)の結果を提示する。インフォームドコンセントは、研究への参加とデータの提示について、すべての人間のボランティアから得られました。

1.ヒトの食後の褐色脂肪組織の活性化の測定

注:基礎BAT活性をできるだけ低く保つために、毎日の気温が22°Cを下回らない夏の間に実験を実行してください。

1. BAT活性は性別、年齢、BMI、さらには発情周期の段階に依存するため、対照の健康な参加者を慎重に選択してください(BAT活性が病理学的条件下で推定される場合)。
   1. 女性参加者の月経周期の段階を推定するには、平均月経周期の長さと最後の月経の初日の日付について質問します。実験の日付をマークすることを忘れないでください。
      注:健康な対照と病理学的状態の参加者は可能な限り類似している必要があり、調査対象の疾患のみが異なるため、一致する対照被験者の適切な選択は臨床試験の最も難しい部分です。
2. 参加者に、朝食をとらず(絶食-カロリー摂取なし)、実験のために朝の時間に集まり、交感神経活性化 による 筋肉活動中のBAT活性化の可能性を回避するために、少なくとも30分間休むように依頼します。
3. ベースラインBAT活性を決定しながら、皮膚表面を温めることの可能性のある影響(衣服の熱効果)を回避するために、測定の15分前に上着を脱ぐように参加者に依頼します。適切な室温(22〜27°C)で測定を実行します。
4. 赤外線測定を実行します。
   1. 参加者が休んでいる間に、サーマルカメラ(検出器タイプ:非冷却マイクロボロメータ、検出器ピッチ:17μm、カメラスペクトル範囲:7.5〜14.0μm、熱感度:30°Cで20mK、レンズ:36mm、解像度:1024ピクセルx768ピクセル、瞬時視野[IFOV]:0.47mRad)を三脚に取り付け、参加者が着席する場所から1m離して配置します。
      注意: 測定が寒い天候(湿度15%で外気温が50°C未満)で実行する場合は、測定を実行する前に、カメラを室温に置き、少なくとも1時間電源を入れてください。冷たい機器は、自動キャリブレーションにより室温までウォームアップした後、異なる結果をもたらす可能性があります。
   2. メーカーの指示に従って、赤外線カメラをコンピューターとソフトウェアに接続します。アルミホイル(しわくちゃにしてから伸ばしたアルミホイル)を焦点距離1 mで記録し、部屋の反射温度を決定し、測定温度として表示します。カメラソフトに距離0m、放射率1を入力します。
      注意: 反射見かけ温度は、カメラの放射率を1.0、距離を0 mに設定し、しわくちゃにしてから伸ばしたアルミホイルで測定を行ったときに得られるパラメータです。反射見込み温度は、環境から検出器に入射する赤外線の総放射の近似値を表します。
   3. 測定を開始する直前に、室温と湿度を決定します(後の分析に必要)。1つの熱画像を撮影する代わりに、ムービーを録画します。ムービーから、後で分析に最適な画像フレームを選択して、貴重なデータが失われる可能性を減らします。
   4. 録画を開始する前に、次のパラメータを設定します:10〜15秒(またはその他の希望する値)でのビデオ録画の継続時間、5 fps(フレーム/秒)またはその他の値でのフレームレート(私たちの手では、5 fpsが必要です)、および以下で説明するように、ムービーが保存されるディスク上の場所。
      1. メインカメラウィンドウの上にあるソフトウェアで、左から3番目のアイコンを選択します。ポップアップメニューで「 レコード設定を編集」を選択すると、新しいウィンドウが開きます。
      2. 記録モードで、[ ディスクに記録]を選択し、その下で[ この期間の記録 ]を目的の時間に設定します。同じウィンドウの録音オプションで、録音レートを5(Hz)に制限し、録音を保存する場所を選択します。
      3. フレームレートを設定するには、既存のウィンドウを閉じ、メインメニューの[ 編集 ]を開いて、[ 設定]を選択します。開いたウィンドウの右側で、[ ターゲットフレームレート]に5と入力します。下の同じウィンドウで、[ ホットキー/リモートスタートで記録を停止できます]を選択し、ドロップダウンメニューから[ 開始/停止モード]を選択します。
         注:メモリを消費するため、可能な限り低いフレームレートで可能な限り短いムービーを作成してみてください。これらの設定では、1 つのレコードに約 100 MB が割り当てられます。
5. BATが位置する鎖骨の上の首の鎖骨上領域(図1)が焦点距離1 mになるように参加者を配置し、F5キーを押して5 fpsのフレームレートでショートムービー(10〜 15 秒)を記録します。録音は指定された時間に停止します。
6. 測定時の部屋には、参加者と測定を実行している人だけがいることを確認してください。空気の動きや通風(エアコンなど)を避けてください。参加者が冷たい通風、日光(直接または間接)、または電球などの熱源から離れていることを確認してください。
7. 適切な場合は、指先から毛細血管血中の血糖値を標準の血糖値計で測定し、腋窩温度計を使用して体温を測定します。
8. すべての参加者が同じ食事をするようにします。被験者の食事制限と要件(たとえば、糖尿病患者の食事)に注意してください。対照(健康な)人々と代謝障害のある参加者を含むすべての参加者は、同じ食事を食べるべきです。
   注:糖尿病患者が摂取できる食事の詳細については、地元の内分泌科医に連絡するか、糖尿病を患っている参加者と話し合ってください。
9. 食後の希望の時間に、同じ設定値を使用して F5 を押して新しい録音を行います。録音用に設定されたプロトコルを繰り返さないでください。食事後30分、1時間、2時間、および3時間で測定を繰り返します¹²。特定の研究デザインでは、食後の時間は短くても長くてもかまいませんが、少なくとも最初の3つの時点をお勧めします。
   注:測定は高速ですが、参加者数の制限は4〜6人です。参加者の数が多いと、一部の遅延時間は長すぎます。

2.実験動物における食後の褐色脂肪組織の活性化の測定

注:動物は、室温が調整され、昼/夜サイクルが12時間/ 12時間の動物施設に収容されているため、実験はどの季節でも実行できます。実験中の室温は22°Cから27°Cの間である必要があります。 本研究では、発情期の雌動物6匹と野生型(WT)C57Bl/6NCrlの雄6匹を調べた。

1. 施設の倫理ガイドラインに従って動物を麻酔します。この研究では、ケタミン/キシラジン(それぞれ80-100 mg / kgと6-8 mg / kg)のi.p.注射を使用して麻酔が行われました。アイジェルを両目に塗布し、麻酔中の角膜の乾燥を防ぎます。実験の前日に実験動物の肩甲骨間領域(肩甲骨の間の皮膚の領域)を小動物トリマーを用いて剃る。
2. 実験の前日に、雌動物の発情周期の段階も決定します。
   注: 発情周期の段階は膣塗抹標本によって決定されます。
   1. 綿先綿棒を室温の滅菌生理食塩水(0.9%NaCl)に浸し、膣に挿入します。綿棒で膣壁をそっとこすり、付着した細胞をスライドガラスに広げ、風乾させます。
   2. 動物をケージに戻します。細胞を500μLの0.1%クレジルバイオレットアセテートで1分間染色し、その後水で3回すすぐ。
   3. 100倍の倍率と明視野照明を備えた光学顕微鏡で細胞を表示します。塗抹標本²⁵において観察された白血球ならびに有核化および角化上皮細胞の数に基づいて発情周期の相を決定する。
3. 実験の前夜(一晩絶食)に水を 自由にして動物の餌を取り除きます。最善の方法は、ケージ内の食物の残りを避けるために、動物を新しいきれいなケージに移すことです。
4. 実験日の朝、人間の参加者をテストするために行われたように、赤外線カメラと録画設定を準備します。
5. IR測定を行う前に、動物を邪魔したり、ストレスを与えたりしないでください。動物を清潔なケージに慎重に置きます(他の動物の香りが動物の交感神経系に影響を与えないようにしてください)。ケージを赤外線カメラの下に焦点距離1 mで置きます。 F5 キーを押してムービーを録画します。
6. 食物摂取量を計算できるように、各動物に与える前に食物ペレットの重量を量ります。動物をケージで30分間食べさせ、食事の後に再び食物ペレットの重さを量ります。この研究では、雌の動物は0.038±0.004gの食物/体重を食べました。
   注意: 血糖値を測定する場合は、食事の前とIR測定後に測定を実行して、交感神経系によるBAT活性化につながらないようにしてください。
7. 食事開始後の希望の時間(通常は食事の30分後、1時間、2時間後)にIR測定を繰り返します^17,26。
8. すべての実験が完了した後、上記のように雌動物において発情周期の段階を再度試験する(雌動物は、予想よりも早く発情周期の所望の段階を終了し得る)。

3.熱記録の分析

注意: サーマルカメラソフトウェアは、5つの変数を使用してオブジェクトの温度を計算します。

1. 分析前にソフトウェアで次の変数を設定します:皮膚の放射率、e = 0.98^15,27、反射室温(アルミホイルの画像から計算)、気温、相対湿度、オブジェクトまでの距離= 1 m。これらの値を持つソフトウェアを使用して解析を実行します。
   注:推奨されるカラーパレットは、鎖骨の上のBATの検出を容易にするより多くの色相を使用するため、レインボーです。
2. ムービーごとに、リストされた変数をメインウィンドウの右側にあるカメラソフトウェアに入力します。画面下部の再生ヘッドを動かすか、 一時停止 ボタンを押して、ムービーから適切なフレーム(画像)を選択します。
3. メインウィンドウの左側にある目的の領域の形状を選択して、関心領域(ROI)を選択します。鎖骨の上または間の皮膚の領域に最も適した形状を選択してください。
4. ROIを選択すると、ROIの最小温度、最高温度、および平均温度が右側に表示されます。画像では、赤い三角形は記録された最高温度のポイントを表し、青い三角形は記録された最低温度を表します。この手順を数フレーム繰り返して、記録の数秒間に測定温度が安定していることを確認します。
5. 食後の最高温度から食前のBATより上の皮膚領域の最高温度を差し引いて、実験動物の食後のBAT活性の増加を決定します。

結果

BAT活性を決定する最も簡単な方法は、ヒト被験者の食事の前後にBATを超える最大皮膚温度を差し引くことです。BAT活性を計算するより良い方法は、鎖骨上領域に位置するBATの上の皮膚領域と、参照領域として指定されたヒトにBAT組織が見られない皮膚の鎖骨間領域の2つの関心領域を選択することです(PET-CT;図1)。BAT活性は、これら2つの温度を差し引くことによって容易?...

ディスカッション

最近の研究では、肥満および糖尿病の発症における成人のヒトおよび動物におけるBAT活性の生理学的調節および重要性に関する証拠が増えています。さらに、外因性活性化剤によるBAT活性化の可能性は、製薬会社のターゲットになりつつあります。非常に厄介な疾患におけるBATの生理学的調節と病態生理学的重要性を推定し、潜在的な治療アプローチを発見するために、赤外線サーモグラフ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1% cresyl violet acetate	Commonly used chemical
Device for measuring air temperature and humidity	Kesterl	Kestrel 4200	Certificat of conformity
External data storage	Hard Drive with at least 1 TB
Glass microscopic slides	Commonly used
Small cotton tip swab	Urethral swabs
Software for analysis	FLIR Systems, Wilsonville, OR, USA	FLIR Tools
Software for meassurements	FLIR Systems, Wilsonville, OR, USA	ResearchIR software	FLIR ResearchIR Max, version 4.40.12.38 (64-bit)
Thermac Camera	FLIR Systems, Wilsonville, OR, USA	FLIR T-1020