ゼブラフィッシュの免疫細胞機能に対するバイオトキシンの影響の評価

要約

このプロトコルは、ゼブラフィッシュ白血球のさまざまな亜集団のエンドサイトーシス機能に対する毒素曝露の影響を評価できるフローサイトメトリーアッセイを説明しています。アッセイに特異的な機能阻害剤を使用することで、変化したエンドサイトーシスメカニズムの鑑別が可能になります。

要約

さまざまな生物学的毒素が水生環境に有害なレベルで存在する可能性があります。シアノバクテリアは、水生環境でシアノトキシンを産生する原核微生物の多様なグループです。これらのバイオトキシンは、肝毒素、皮膚毒、または神経毒であり、魚や哺乳類に影響を与える可能性があります。高レベルでは、これらの化合物は致命的です。非致死レベルでは、それらは潜行性に作用し、免疫細胞機能に影響を与えます。藻類が産生するバイオトキシンは、ミクロシスチンとアナトキシンA.水生動物は、 ボツリヌス菌が産生するボツリヌス神経毒E(BoNT/E)で汚染された物質を摂取することもでき、死滅や免疫機能の低下につながります。ゼブラフィッシュは、毒素が免疫細胞の機能にどのように影響するかを研究するために使用できます。これらの研究では、毒素曝露は in vivo または in vitroで行うことができます。 In vivo での研究では、ゼブラフィッシュを毒素にさらし、その後、細胞を単離します。この方法は、組織環境が白血球の機能にどのように影響するかを示しています。 in vitro 研究では、最初に細胞を単離し、次に培養ウェルで毒素にさらします。白血球は、腎臓骨髄抽出とそれに続く密度勾配遠心分離によって得られます。白血球が病原体をどのように取り込むかは、エンドサイトーシスメカニズムによって決定されます。フローサイトメトリー食作用アッセイは、毒素曝露によってエンドサイトーシスメカニズムが変化したかどうかを示します。単離された白血球を用いて毒素がどのように免疫機能障害を引き起こすかを明らかにする研究は不足しています。この記事で説明した手順により、研究室はゼブラフィッシュを使用して、環境毒素が免疫細胞のエンドサイトーシス機能を低下させるときに影響を受けるメカニズムを研究することができます。

概要

環境バイオトキシンや免疫抑制剤には多くの種類があります。細菌毒素を含む藻類の異常発生は、内陸水域で発生し、バイオフィルム¹としても発生する可能性があります。シアノバクテリア(藍藻類)は、すべての淡水生態系に自然に存在します。シアノバクテリアのブルームは、淡水系で大幅に増加しています²。特定の時期に、シアノバクテリアは水生動物や陸生動物に有害な毒素を生成する可能性があります。これらの毒素は、肝臓、皮膚、粘膜、および/または神経系に影響を与える可能性があります。シアノバクテリアによって産生される2つの化合物は、ミクロシスチンとアナトキシンAであり、ミクロシスチンは環状ヘプタペプチド³である。アナトキシンAはアルカロイド⁴です。ボツリヌス神経毒E(BoNT/E)は、水生系で発生する別の毒素です。 ボツリヌス菌 によって産生され、水生動物が摂取することができます⁵。

環境毒素への曝露は魚に影響を及ぼし、動物の健康にも影響を及ぼし、病気の発生を増加させる可能性があります⁶。これらの毒素が免疫細胞にどのように影響するかを理解することは、これらの物質への曝露に関連するリスクを決定するための基本です。ゼブラフィッシュは、環境毒素が免疫細胞に及ぼす影響を研究するための優れたモデルです⁷。フローサイトメトリーとゼブラフィッシュの白血球を利用した方法の開発は、非常に有益です。ゼブラフィッシュはヒトと生理学的に関連性があり、この手法は基礎毒性学や免疫学から創薬や発生生物学まで、幅広い研究分野に応用できます。ゼブラフィッシュは水生生物であるため、水媒介性環境毒素の影響を研究するのに特に適しています⁷。ゼブラフィッシュの使用は、他の脊椎動物モデルよりも安価であり、その使用は倫理的な懸念をあまり引き起こしません。

白血球(白血球)は、病気の原因となる生物に対する細胞防御の最前線です。エンドサイトーシスとは、細胞が細胞の外部にある液体や粒子を取り込んだり、内在化したりするプロセスです。これは、化合物を小胞⁸に包み込む細胞によって達成される。白血球は、このプロセスを病原体を殺し、病気に対する防御を準備するための最初のステップとして使用します。食作用はエンドサイトーシスの一種であり、魚の健康に対する環境汚染物質の影響を調査するために使用された最初の方法の1つでした⁹。Petrie-Hanson研究室は、ゼブラフィッシュの白血球を用いて、白血球のエンドサイトーシスおよび食作用を阻害し、免疫防御に影響を与える可能性のあるバイオトキシンをスクリーニングする方法を開発しました。これらの方法に含まれるエンドサイトーシスの種類は、ピノサイトーシス、食作用、カルシウム依存性受容体媒介性食作用、およびマンノース受容体媒介性食作用です。ゼブラフィッシュを用いたフローサイトメトリー法の使用は、Petrie-Hanson研究室⁹ で初めて報告され、水生毒素や病原体の研究に日常的に使用されています。 Rag1^-/- 変異型ゼブラフィッシュはT細胞とB細胞¹⁰ を持たず、自然免疫細胞のメカニズムを特異的に調べるために使用できる。

フローサイトメトリーはレーザーベースであり、細胞の物理的特性を決定するために使用できます。前方散乱光(FSC)値はX軸にプロットされ、セルのサイズを表します。側方散乱光(SSC)はY軸上にプロットされ、細胞の細胞質の粒度を表します。結果のプロットは、類似した物理的特性を持つ細胞の集団がグループ化され、異なる細胞タイプが散布図上のさまざまな場所に現れていることを示しています。これらの集団は、細胞の物理的特性が変化すると、散布図上の位置が変わることがある⁹。この手法をゼブラフィッシュの白血球に用いることで、研究者は環境毒素を含むさまざまな刺激に応答した細胞集団の変化を評価することができます。

フローサイトメーターは多次元であり、複数のタイプの蛍光色素を評価に使用して、細胞とその活性をさらに特徴付けることができます。このプロトコルに記載されているアッセイでは、エンドサイトーシスは、細胞が内在化した蛍光物質の量を測定することによって特徴付けられます。毒素曝露がエンドサイトーシスメカニズムに影響を与えるかどうか、またどのように影響するかは、フローサイトメトリーを使用して、毒素に曝露された細胞が物質を吸収する能力と毒素に曝露されていない細胞の能力を比較することで判断できます。この方法で評価できるエンドサイトーシスプロセスには、ピノサイトーシス、受容体媒介性エンドサイトーシス、および食作用が含まれます。

飲作用は可溶性成分の取り込みであり、細胞受容体を利用しません。取り込みには、マイクロフィラメントと微小管による細胞質の再配列が含まれ、小さな液胞が形成されます。ルシフェラーゼイエロー(LY)は、非選択的ピノサイトーシスによる液体の取り込みを測定するために使用される蛍光色素^です11。受容体媒介性エンドサイトーシスには、高分子の選択的な取り込みが含まれます。フルオレセイン(FITC)標識デキストラン(DX)40を使用して、このプロセスを評価できます。食作用は、0.5マイクロメートルを超える粒子を摂取するエンドサイトーシスの一種です。このプロセスは、FITC-DX70およびFITC-Eschericia coliを使用した手順によって調査されます。DX40とDX70の分子量はそれぞれ40,000と70,000です。FITC-E.coli は、フローサイトメーターで測定できる蛍光に結合した 大腸菌 の標準的な実験室株です。受容体媒介性エンドサイトーシスの多くの形態は、シグナル伝達分子として、また細胞骨格の再配列^{9のためにカルシウム}を必要とする。受容体媒介性エンドサイトーシスの別のタイプは、マンノース受容体(MR)媒介性エンドサイトーシスです。マンノース受容体は、微生物細胞表面上のマンナンの形態を認識する膜貫通タンパク質である⁹。これらの手順を最適化するには、各毒素で用量反応曲線を作成して、使用する用量を確立する必要があります。LY、FITC-DX40、FITC-DX70、およびFITC-E.大腸菌 の飽和曲線を実行して、使用する正しい濃度を評価する必要があります。

白血球がさまざまな粒子を内在化するために使用するメカニズムは異なる場合があります。プロセスのどの成分が毒素曝露によって影響を受けるかを示唆するために、阻害薬を追加して食作用メカニズムを遮断することができます。サイトカラシンD(CCD)は、微小管の動きを阻害し、したがって、飲作用を阻害します。CCDは受容体媒介性エンドサイトーシスに影響を与えません¹¹。EDTAは、カルシウム(Ca²⁺)依存性受容体媒介性エンドサイトーシスをブロックします。マンナンは、食作用またはピノサイトーシスがマンノース受容体媒^介性9であるかどうかを評価するためのマンノース受容体阻害剤として使用されるMR.マンナンの天然リガンドです。

このプロトコルの目的は、毒素曝露が食作用性白血球が病原体を取り込みする能力に影響を与えたかどうかを判断するための手順を実証することです。これらのプロトコルは、特定のエンドサイトーシスメカニズムが影響を受けるかどうかも識別できます。これらのアッセイをフローサイトメーターで実施すると、サイズと細胞質の粒度に基づいて白血球集団を選択することで、白血球亜集団が異なる影響を受けているかどうかを判断することで、さらに識別することができます。この方法は、細胞集団の電子ゲーティングに依存しています。

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プロトコル

このプロトコルは、ミシシッピ州立大学の施設内動物管理および使用委員会(MSU-IACUC)によって承認されています。この研究で使用されたすべてのゼブラフィッシュは、ミシシッピ州立大学(MSU)獣医学部の特定の病原体を含まない孵化場に以前に確立された ラグ1^/-変異 ゼブラフィッシュのホモ接合コロニーから繁殖されました¹⁰。野生型のゼブラフィッシュもこの孵化場で繁殖しました。これらの研究では、毒素曝露は in vivo または in vitroで行うことができます。 In vivo の研究では、ゼブラフィッシュを毒素にさらし、その後白血球を単離することで、毒素と組織微小環境がどのように相互作用し、白血球の機能に影響を与えるかが示されています。 in vitro 研究では、白血球を単離し、培養ウェルで細胞を毒素にさらします。

1. 試薬と溶液の調製

1. 蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)バッファー:(カルシウムまたはマグネシウムを含まないハンクス平衡塩溶液(HBSS)+ 0.05%ウシ血清アルブミン(BSA))( 材料の表を参照)。細胞単離前にこれを新たに調製してください。
2. 組織培養培地(TCM):グルタマックスと10%ウシ胎児血清を添加したRPMI-1640を使用してください( 材料の表を参照)。
3. サイトカラシンD(CCD):市販の製品( 材料表を参照)を1mLの200プルーフ無水エタノールに再懸濁して、ストック溶液を調製します。20 μLのストックCCDを980 μLのFACSバッファーに加えて作業溶液を調製し、最終濃度2.5 μg/mLを得ます。
4. EDTA:原液は1 mg/mLです。900 μLのFACSバッファーに100 μLのストック溶液を加えて作業溶液を調製し、最終濃度1 mMを得ます。
5. Mannan:1 mg / mLのストック溶液を調製します( 材料の表を参照)。.次に、900 μLのFACSバッファーに100 μLのストック溶液を加えて作業溶液を調製し、最終濃度500 μg/mLを得ます。
6. Lucifer Yellow(10 μg/mL)(LY、蛍光色素)、Dextran-40(DX-40、500 μg/mL)、Dextran-70(DX-70、500 μg/mL)を別々に調製し、市販の試薬( 材料表を参照)を滅菌水に再懸濁することにより、それぞれ1 mg/mLの溶液を調製します。
7. フルオレセイン(FITC)細菌:100 mLのLuria Bertani(LB)培地に50 μg/mL FITCを添加した100 mLのLuria Bertani(LB)培地で振とうし、光保護環境下で37°Cで一晩振盪して大 腸菌 DH5α( 材料表を参照)を増殖させると、540 nmで0.8の光学密度(OD)が得られます。
   1. バクテリア(3x)をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で10分間、1000 x g で10分間遠心分離し、続いて60°Cで20分間加熱します。さらに1回洗ってから、細菌濃度をOD₅₄₀ 0.8に調整します。これがストックソリューションになります。
   2. ストック溶液(1 mLストック:99 mL FACSバッファー)を1:100に希釈して、ワーキング溶液を調製します。最終濃度を1.8 x 10⁸ 細胞/mLに調整します。

2.ゼブラフィッシュのお手入れ

1. ゼブラフィッシュを脱塩素処理された都市水上のシングルパスフロースルーシステムで維持し、高タンパクの魚粉と生きたアルテミアを満腹になるまで供給します。
2. 生後6ヶ月になったら、雌雄混合のゼブラフィッシュを水槽から取り出し、実験に使用するために研究室に運びます。これは、^腎臓骨髄9から最適な数の白血球を単離するために使用するのに最適な年齢です。

3. 細胞単離

1. 10匹のゼブラフィッシュをトリカイン(~100 mL 4 mg/mLリン酸緩衝トリカインメタンスルホン酸/魚水1リットル)で安楽死させます( 材料表を参照)確立された方法⁹に従って。
2. 40 μmのセルストレーナーを50 mLのコニカル遠心チューブに入れます。
3. 腎臓髄組織⁹ を取り出し、3mLの組織培養培地を入れたCチューブに入れ、組織解離器を用いて組織を均質化する。これは推奨される手順です。
4. あるいは、細胞ストレーナー内の3mLシリンジのゴム端で組織を破壊します。組織が均質化(または破壊)された後、50 mLの円錐形チューブの上に置かれた40 μmのセルストレーナーに懸濁液を注ぎます。
5. ろ過した懸濁液を500 x g で16°Cで5分間遠心分離します。 上清を注ぎます。細胞を3mLのTCMに再懸濁します。この手順を 2 回繰り返します。
6. 室温で3 mLの滅菌ろ過された密度勾配培地(1.077 g / mL)に細胞を慎重に重ねます。
7. 次に、800 x g で16°Cで20分間遠心分離します。 遠心分離機が停止したときにセルが再懸濁されないように、ブレーキが最も低い設定になっていることを確認してください。
8. 不透明なバフィー層を界面から14 mLの丸底チューブに取り除きます。
9. TCMを5 mL加え、パスツールピペットで混合して細胞を洗浄します。300 x g で16°Cで5分間遠心分離します。
10. このステップを繰り返し、上清を廃棄し、細胞ペレットをTCMに再懸濁して、約1 x 10⁶ 細胞/mLを得ます。

4. 細胞生存率アッセイ

1. 細胞生存率をモニターするには、ヨウ化プロピジウム(PI)染色を用いて細胞死を評価します。
   1. 解析する細胞の濃度5 μL/mLでPI(200 μg/mL)を添加します。PE/Texas Redチャンネルで読んでください。
      注:ヨウ化プロピジウムは、死細胞の膜の穴を通って拡散し、それによってそれらを染色します。本研究で評価された生存率は85%であった。

5.毒素インキュベーション

1. 単離した細胞懸濁液から200 μLの細胞を6ウェル組織培養プレートの各ウェルに分注します(コントロール用に3ウェル、毒素曝露用に3ウェル)。これにより、レプリケートを 3 回で実行できます。
2. 各ウェルに2 mLのTCMを加えます。
3. 毒素(~2.5 μg/mL)を3つのウェルに加えます。
   注:毒素濃度は、実験を開始する前に最適化する必要があり、アッセイに使用される毒素によって異なります。
4. 組織培養プレートを所望の露光時間でインキュベートします。望ましい曝露時間は、実験を開始する前に最適化する必要があり、アッセイに使用される毒素によって異なります。本研究では、曝露時間は~1時間であった。
5. 曝露時間後、組織培養プレートを氷上に10分間置きます。
6. 各ウェルの細胞を上下にピペットで動かし、プレートから付着細胞を取り除くように注意します。
7. プレートから細胞を14 mLの丸底遠心チューブに移します。
8. 細胞を300 x g で5分間、16°Cで遠心分離します。 細胞を3mLのFACSバッファーに再懸濁します。この手順を 2 回繰り返します。
9. 細胞を1.5mLのFACSバッファーに再懸濁します。
   注: in vivo 研究では、ゼブラフィッシュを毒素(上記と同程度の濃度)にさらし、細胞を単離します。

6. エンドサイトーシスアッセイ

1. 100 μLの細胞を5 mLのフローサイトメトリーチューブに分注します。各ウェルから4本の複製チューブでチューブを次のように標識します:(1)LY、(2)DX40、(3)DX70、(4)FITC-E.coli。
2. ステップ1.6およびステップ1.7で述べた蛍光色素を適切なチューブに加えます:チューブ(1)に50μLのLY、チューブ(2)に50μLのDX40。50 μL DX70 をチューブ (3);50 μL FITC-E. coli をチューブ(4)に。
3. 1時間インキュベートします。各チューブに200μLのFACSバッファーを加えます。
4. 細胞を400 x g で16°Cで5分間遠心分離します。 上清を注ぎ出し、細胞を200μLのFACSバッファーに再懸濁します。この手順を 3 回繰り返します。フローサイトメトリー解析を実行します。

7. フローサイトメトリー

1. フローサイトメトリーを実施して、細胞集団を視覚化し、データを収集します。詳細については、Hohn et ^al.9 を参照してください。
2. 最初のステップで標的細胞集団を同定します。側方散乱光(SSC)(通常は縦軸)を使用して破片を除去し、左端の小さなピクノティック細胞と前方散乱(FSC)(通常は水平軸)を使用してプロットの下部にある同じ破片を除去します。
3. ダブレットリード(セルが2回カウントされる)を排除します。これは、パルスジオメトリゲート(FSC-H x FSC-A)を使用して実行されます。
4. バックグラウンド信号を決定します。細胞を蛍光コントロールのみと、使用する蛍光色素ごとにアイソタイプ蛍光コントロールのみを実行し、バックグラウンド蛍光レベルを同定します。
   注:各蛍光色素は、細胞の自家蛍光および非特異的結合の影響を受けて、独自のバックグラウンド蛍光レベルを有する。これにより、真陽性のシグナルとバックグラウンド蛍光が区別されます。蛍光に基づいて細胞集団を同定し、ゲーティングする場合、これらの制御値は陽性イベントの数から差し引かれ、その結果の数が分析に使用される数になります。
5. サンプルを解析し、ゲートする細胞集団を同定します。FSCとSSCを使用して、細胞の混合物内の異なる細胞集団を形態学的に特徴付け、同定します。
   注:FSCは主にセルのサイズに関連しています。セルが大きいほど、前方に散乱する光が多くなり、FSC値が高くなり、セルが小さいほど散乱する光が少なくなり、FSC値が低くなります。異なるサイズのセルはクラスターにグループ化されます。例えば、リンパ球は小さいため、顆粒球と比較してFSC値が低い別のクラスターとして現れることがあります。SSCは、細胞の粒度、複雑さ、および内部構造に関連しています。細胞質の粒度が高い細胞は、SSC値が高くなります。類似したセルが集まります。例えば、好中球は細胞質顆粒を持ち、リンパ球よりも高いSSC値でクラスター化します。
6. すべてのサンプルを実行し、FSC/SSCに基づいて、さらに分析する細胞集団にゲートを適用します。ゲートエリアは、細胞密度と対象集団に基づいて適用されます。
7. ゲート領域をヒストグラムにプロットして、青色レーザーで495 nm / 519 nmの蛍光について、各ゲートのFITCの平均蛍光強度(MFI)を分析します。
8. ソフトウェアによって決定されたセル数をエクスポートし、分析プログラムで優れた成績を収めます。
9. 統計ソフトウェアパッケージでデータを分析します ( 資料の表を参照)。
10. 対照細胞の各集団のMFIを、毒素に曝露された細胞集団のMFIと比較します。

8. エンドサイトーシスメカニズムに及ぼす毒素の影響と、CCD、EDTA、マンナン阻害剤のエンドサイトーシスメカニズムへの影響

注:液体や粒子を取り込むために、細胞質は活発に動きます。この動きには、複数の構造要素とシグナル伝達経路が必要です。バイオトキシンは、これらの要素や経路のいずれかに影響を与える可能性があります。特定の特性を特徴とする阻害剤の効果を比較することは、バイオトキシンがどのように作用しているかの識別を助けるために使用することができます¹¹。

1. ステップ 3 で説明したように細胞単離を実行します。
2. 100 μLの細胞を5 mLのフローサイトメトリーチューブに分注します(各ウェルから4本の複製チューブを使用)。
   注:チューブに次のようにラベルを付けます:(5)CCD + LY(CCDは、マイクロフィラメントと微小管の再配列を阻害することにより、ピノサイトーシスを阻害します。LYは、微量飲用症による液体の取り込みを評価するために使用されます)⁹。(6)EDTA + DX40(EDTAは^Ca2+ 依存性受容体媒介性食作用および微量免疫細胞症をブロックします;取り込みがカルシウム依存性メカニズムに関与しているかどうかを測定)。(7)EDTA+DX70。(8) EDTA + FITC-E.大腸菌。(9)マンナン+DX40(マンナンはマンノース受容体による特異的な取り込みを阻害し、MR依存性エンド^{サイトーシス}9を測定する)。(10)マンナン+ DX70。(11)マンナン+ FITC-E.大腸菌。
3. 阻害剤を添加する:1μLのCCDをチューブ(5)に。10 μL EDTAをチューブ(6-8)に注入。100 μL マンナンをチューブ (9-11)。ステップ1で説明した濃度に従ってください。5分間インキュベートします。
4. 適切なチューブに蛍光二次を添加します:50 μL の LY をチューブ (1) および (5) に添加します。50 μL の DX40 をチューブ (2)、(6)、(9) に注入します。50 μL の DX70 をチューブ (3)、(7)、(10) に注入します。50 μLのFITC-E.大腸菌 をチューブ(4)、(8)、および(11)に。30分間インキュベートします。
5. 各チューブに200μLのFACSバッファーを加えます。400 x g 、16°Cで5分間遠心分離します。
6. 上清を注ぎ出し、細胞を200μLのFACSバッファーに再懸濁します。手順8.5〜8.6を2回繰り返します。
7. ステップ7に従って、フローサイトメーターでサンプルを分析します。

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結果

エンドサイトーシスアッセイは、グラジエントから単離され、食細胞とリンパ球に対してゲート化された混合白血球を使用して、毒素曝露によって特定の細胞メカニズムが変化したかどうかを判断します。まず、細胞はサイズおよび粒度¹⁰に基づいてゲートされる。死んだ細胞、断片化された細胞、または死にかけている細胞は、散布図の左下隅に?...

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ディスカッション

ゼブラフィッシュの白血球を用いたフローサイトメトリーを利用することで、免疫系を詳細に研究し、環境毒素の影響を評価し、毒物学的研究を促進するための強力で汎用性の高いアプローチが得られます。これは、毒素が免疫細胞に与える影響と免疫応答を迅速かつ効果的に評価する方法を提供します。その結果、関与する体液性因子が明らかになり、魚の生理機...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% fetal bovine serum	Gibco	A3160501
14 mL round bottom centrifuge tubes	BD Biosciences	352059
40 µm cell straininer	Corning	07-201-430
5 mL flow cytometry tubes	BD Biosciences	352235
50 mL conical centrifuge tube	Corning	14-959-49A
Absolute ethanol	Fisher	BP2818-500
Automated cell counter	Life Technologies Countess II FL		for studying cell viability
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A3059
cytochalasin D (CCD)	Sigma	C8273-5MG
Dextran 40	Sigma	FD40-100MG
Dextran 70	Sigma	46945-100MG-F
Escherichia coli DH5α (or other lab bacterial strain)	New England Biolabs	C29871
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma	ED4SS
Flow analysis software	Novoacea software
Flow cytometer	Novocyte 3000
Fluorescein	Fluka BioChemica	46950
hanks balanced salt solution without calcium or magnesium	Sigma	H4891
Histopaque 1077	Sigma	10771-100ML
Lucifer Yellow	Sigma	L0259-25MG
Mannan	Sigma	M7504-250MG
Phosphate buffered saline	Sigma	P3813
RPMI-1640 with GlutaMax	Gibco	61870036
Statistical software	SPSS
Toxin
Tricaine	Western Chemical Inc	NC0342409