JoVE Logo
著者
お問い合わせ

サインイン

このコンテンツを視聴するには、JoVE 購読が必要です。 サインイン又は無料トライアルを申し込む。

この記事について

  • 要約
  • 要約
  • 概要
  • プロトコル
  • 結果
  • ディスカッション
  • 開示事項
  • 謝辞
  • 資料
  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

私たちは、レンチウイルスベクターを使用して、 in vivoで腹膜組織に常在するマクロファージの遺伝子機能を調べるための段階的なプロトコルを示します。

要約

腹膜組織に常在するマクロファージは、恒常性の維持に広範な機能を持ち、局所組織および隣接組織内の病状に関与しています。それらの機能は、微小環境の手がかりによって決定されます。したがって、 in vivo の生理学的ニッチにおける彼らの行動を調査することが不可欠です。現在、特定の腹膜マクロファージターゲティング方法論は、マウス全体のトランスジェニックモデルを採用しています。ここでは、レンチウイルス粒子を用いて腹膜マクロファージにおけるmRNAおよびsmall RNA種(例えば、microRNA)発現の効果的な in vivo 調節のためのプロトコルについて説明します。レンチウイルス製剤はHEK293T細胞で作製し、単一のスクロース層で精製しました。腹腔内注射後のレンチウイルスの有効性の in vivo 検証により、局所組織に限定されたマクロファージの主な感染が明らかになりました。腹膜マクロファージの標的化は、ホメオスタシスおよびチオグリコール酸誘発性腹膜炎において成功しました。レンチウイルスの腹腔内送達によって誘発される低レベルの炎症や、潜在的な実験の時間制限など、プロトコルの限界について説明します。全体として、この研究は、 in vivo の腹膜マクロファージにおける遺伝子機能を迅速に評価するための迅速でアクセス可能なプロトコルを示しています。

概要

組織常在性マクロファージ(Mφ)は、侵入する病原体を感知して応答する食作用免疫細胞の不均一な集団です1,2。さらに、それらは組織の発達、リモデリング、および恒常性の維持において重要な役割を果たします1,3。多くの組織Mφは、胚形成中に卵黄嚢前駆細胞に由来し、生涯を通じて組織に持続します4,5。これらの細胞の表現型と機能は、特定の転写因子と局所微小環境との協調的および階層的な相互作用によって決定される6,7,8,9。この依存性についての理解が深まるにつれ、生理学的に重要なニッチ内でMφを遺伝子操作するための効果的なin vivo法の必要性が高まっています。

レンチウイルスベクターは、in vivo 10,11,12の特定の細胞集団における核酸の操作に頻繁に使用されるツールであり、特に分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染し、宿主ゲノムに安定して統合する能力があるためです13,14。過去20年間で、レンチウイルス送達技術は最適化され、系統特異的なターゲティングを増やすために代替エンベロープと合成プロモーターが調査されてきた8,15。その広範な細胞親和性により、水疱性口内炎ウイルスエンベロープ糖タンパク質(VSV-G)16,17は、レンチウイルス技術で使用される「ゴールドスタンダード」エンベロープとなっています。

このプロトコル18では、VSV-Gシュードタイプレンチウイルス粒子を使用して、短いヘアピンRNA(shRNA)およびマイクロRNA(miR)のマウス腹膜Mφ(pMφ)への定常状態でのインビボへの標的化および効果的な送達を実証する。導入遺伝子の発現は、脾臓焦点形成ウイルス(SFFV)プロモーターによって駆動されました。細胞の生産感染は、レンチウイルス由来の増強緑色蛍光タンパク質(GFP)の発現によって定義されました。このアプローチを利用することで、in vivoレンチウイルス実験の読み出しが容易になり、最適な用量と実験期間を定義することができました。最後に、チオグリコール酸誘発性炎症中のマウスのin vivoレンチウイルスチャレンジにより、選択的pMφ感染の自然な傾向が明らかになりました。

プロトコル

すべての動物の作業は、機関および英国内務省のガイドラインに従って行われました。

注:レンチウイルスを用いたすべての in vivo 研究は、研究における動物の倫理的使用に関する地域および国のガイドラインに従って実施し、カテゴリーIIの感染性物質の使用に関連するすべての規制を遵守する必要があります。動物福祉も地域の規制に従って監視する必要があります。このステップでは、レンチウイルス粒子や鋭利物を扱う際には細心の注意を払う必要があります。

1. トランスフェクション用HEK293T細胞の調製

注:これらの手順は、滅菌組織培養生物学的安全キャビネットの下で行ってください。

  1. 450 mLのDMEMを10%(v / v)のウシ胎児血清(50 mL)および最終濃度100 U / mLのペニシリン/ストレプトマイシンと組み合わせて、HEK293T細胞用の完全なダルベッコ修正イーグル培地(cDMEM)を調製します。
  2. 予定されているトランスフェクションの少なくとも1週間前にHEK293T細胞を解凍してください。健康な成長条件を維持し、トリプシン+ EDTAを使用して2〜3日ごとに通過し、フラスコから細胞を分離します。
  3. トランスフェクションの1日前に、細胞から増殖培地を慎重に吸引し、滅菌DPBSで細胞を穏やかに洗浄します。1〜5mLのトリプシンをフラスコに加え、5%CO2 インキュベーターで37°Cで2〜5分間インキュベートします。
  4. 5〜10mLのcDMEMを加え、細胞を350 x g で5分間遠心します。液体を取り出し、細胞ペレットを10 mLのcDMEMに再懸濁します。細胞をカウントし、20 mLのcDMEM中のT175フラスコあたり10-11 x 106 の生HEK293T細胞を播種します。
  5. 5% CO2 インキュベーターで37°Cで一晩インキュベートし、HEK293T細胞が70%〜80%のコンフルエントに達するようにします。
  6. 翌日、光学顕微鏡で細胞のコンフルエンシーを確認します。
  7. 細胞単層を乱さずに、25 mLの血清学的ストリペットでフラスコから培地を取り出します。
  8. DPBSを10mLをやさしく加え、プレートを揺らして細胞を洗浄し、細胞単層を乱さないように注意してください。
  9. 25mLの血清学的ストリペットでDPBSを除去します。
  10. 細胞単層を乱さないように、T175フラスコごとに壁に15 mLの新しいcDMEMを追加し、プレートを37°Cのインキュベーターに戻します。

2. 非リポソーム脂質トランスフェクション試薬を用いたHEK293T細胞のトランスフェクション

  1. 15 mLの遠心チューブで、レンチウイルス成分(2 μgのレンチウイルスプラスミド、1.5 μgのpΔ8.91(pCMV-Δ8.91)、および1 μgのpMD2.G(pCMV-MD2.G)とBuffer EC(トランスフェクション試薬キット)を最終容量600 μLまで調製します。
  2. 36 μLのエンハンサー溶液を加えます。1mLのピペットを使用して、液体の一部を繰り返し吸い上げ、残りの溶液に直接一滴ずつ戻すことにより、成分を混合します。室温(RT)で5分間放置します。
  3. トランスフェクション試薬120μLを加え、上記のように約20回混合します。室温で10分間インキュベートします。
  4. 5.2 mLのcDMEMを加え、上記のように5 mLの血清学的ストリペットと混合します。.
  5. 使い捨てのトランスファーピペットを使用して、トランスフェクションミックスをHEK293T細胞単層に直接滴下し(フラスコ壁を避け)、フラスコ内のさまざまな場所にミックスを広げます。
  6. フラスコを左右に静かに揺らしてプラスミドを分配します。フラスコの蓋に液体が入らないようにしてください。
  7. フラスコを37°Cで5%CO2 インキュベーターで48時間インキュベートします。細胞イメージング蛍光顕微鏡でモニターしたトランスフェクションから24時間以内の蛍光マーカー(ここではGFP)の出現により、HEK293T細胞の効果的なトランスフェクションを確認します。
    注:蛍光マーカーのないコンストラクトの場合、HEK293T細胞は、使用されるマーカー遺伝子の存在について、または適切な技術、例えばqPCRによる目的の遺伝子/タンパク質の発現変化によって試験されなければならない。あるいは、トランスフェクションの成功は、上記の技術により、プロトコルの後期のJurkat細胞上のレンチウイルスコレクションの試験中に間接的に確認することができます。
    注意:トランスフェクションされたHEK293T細胞は感染性があると考えられており、これらの細胞を取り扱う際には適切な安全対策を講じる必要があります。通常、カテゴリーIIの生物学安全キャビネットの下での作業、二重手袋の使用、消毒のための適切な除染液(廃漂白剤の濃度の増加(2,000ppm)または施設のバイオセーフティガイドラインに従った同等の溶液など)を含む、現地の規則に従う必要があります。レンチウイルス製剤と接触するすべての溶液とプラスチックは、施設のバイオセーフティ手順に従って消毒する必要があります。

3. レンチウイルス粒子の回収

  1. 除染液、高濃度(2,000ppm)漂白剤(次亜塩素酸ナトリウム)溶液、または施設のバイオセーフティガイドラインに基づく同等の薬剤をバケツに調製し、バイオ安全キャビネットに入れます。
  2. 空のチューブラックなどの余分なアイテムをすべて取り外して、生物学安全キャビネットを準備します。
  3. T175 HEK293T細胞フラスコごとに50 mLの遠心チューブを事前に標識し、遠心チューブから蓋を取り外します。チューブを安定したラックに置きます。
  4. インキュベーターからフラスコを取り出し、488 nmレーザーを搭載した蛍光顕微鏡を使用してGFPの発現を確認します(図1A)。シグナルの強度は、手順と使用するコンストラクトのトランスフェクション効率によって異なります。
  5. 細胞から培地を標識済みの50 mL遠心チューブに集めます。トランスフェクションされた細胞を入れたT175 HEK293Tフラスコを傾けて、培地がフラスコの底部の角に集まるようにします。25 mLの血清学的ストリペットを使用して、細胞単層を乱さずに培地を回収します。この時点で、一部のフローティング セルが表示される場合があります。培地を清潔な50 mL遠心チューブに移し、蓋を閉めます。
    1. 25 mLの血清学的ストリペットを使用して、25 mLの新鮮で温かいcDMEMをフラスコに加えます。細胞単層を乱さないように、媒体の流れをフラスコの壁に向けるようにしてください。トランスフェクションしたHEK293T細胞を入れたフラスコをインキュベーター(37°C、5%CO2)に戻します。
      注:レンチウイルスの2回目のコレクションとさらなる精製は、上記の手順で概説した手順に従ってさらに24時間後に実行できます。
  6. 24時間または48時間後にレンチウイルスの収集が完了したら、細胞に除染液を追加し、細胞単層を覆うようにします。フラスコを次の24時間水平に保ち、適切なカテゴリーIIの規制に従って廃棄します。

4. レンチウイルスの精製

  1. ステップ3.5から培地を収集します。
    1. プランジャーを 50 mL シリンジから取り外し、低タンパク質結合ポリエーテルスルホンまたはポリフッ化ビニリデン 0.45 μm 滅菌フィルターをシリンジの端に挿入します。25 mLの血清学的ストリペットを使用して、ステップ3.5.1で収集した培地をシリンジに加え、プランジャーを静かに戻します。
    2. プラグをゆっくりと押して、培地をフィルターに通し、新しい50 mL遠心チューブに入れます。流量が大幅に減少する場合は、フィルターを上に向けてシリンジを配置し、プランジャーを十分に引き出してフィルターから媒体を取り除きます。
    3. シリンジのフィルターを慎重に新しいものと交換し、使用済みのフィルターは除染液に廃棄してください。中程度のろ過を続けます。終了したら、フィルターを水没させ、シリンジに除染液を充填して、フィルターとシリンジを除染します。
  2. 温度を4°Cに設定して超遠心分離機を予冷し、蓋を閉めて温度が順応するまで待ちます。
  3. 20%ショ糖溶液(超純水に20%w/v、0.22μmフィルターで滅菌)を3mLの円錐形超遠心チューブの底に加えます。
  4. 25 mLの血清学的ストリペットを使用して、スクロース層の上にろ過した培地を重ね、層を乱さないように注意します。
    1. ピペットボーイの最低速度設定を使用してください。円錐形の超遠心チューブを約45°に傾け、ステップ4.1でろ過したレンチウイルス含有培地をチューブ壁にゆっくりと加えます。培地とショ糖が混ざらないようにし、層がはっきりと分離していることを確認してください(図1B)。中層の体積が増加するにつれて、超遠心チューブをゆっくりと傾けて直立位置に戻します。
  5. 超遠心チューブ内のショ糖と培地を含む総容量が29 mL未満の場合は、スピン中にチューブが崩壊しないように、新しいcDMEMを補充します。複数のT175 mLコレクションの場合は、ろ過した培地調製物を混合し、複数の超遠心チューブを使用します。必要に応じて、最終的な超遠心チューブに培地を補充します。
  6. 超遠心分離機のバケットが汚れていないことを確認します。バケツの底やキャップに中程度の残留物はありません。必要に応じて、~70%のアルコールで拭き取ってください。各バケツの底に適切なチューブアダプターを入れ(図1C)、超遠心チューブをバケツにゆっくりと下げます。
  7. バケツをしっかりと閉じ、スピンアウトローターの割り当てられたスペースに吊るします。
  8. バケットが同じ量のショ糖と培地でバランスが取れていることを確認します。スピンアウトローターは、バケツなしで運転してはなりませんが、反対側のバケツは空のままにすることができます20 (図1D)。
  9. ローターを超遠心分離機に慎重に挿入し、真空をオンにします。超遠心分離機の加速速度と減速速度を最低に設定し、レンチウイルス調製を85,000 x g で4°Cで90分間実行します。
  10. 超遠心分離機が必要な速度(約3〜5分)に達するのを待ってから立ち去り、ローターが適切に挿入され、スピンが終了しないことを確認します。
  11. 超遠心分離機の運転中に、カテゴリーIIの安全要件に従って作業スペースを清掃し、次のステップのためのスペースを準備します。
  12. スピンが終了したら、バキュームを無効にし、サンプルを乱さないようにローターを慎重に取り外します。
  13. 超遠心分離機にこぼれがないか調査し、バケツから漏れがないことを確認します。こぼれた場合は、二重手袋をはめ、遠心分離機とバケツの外面を抗ウイルス製品で除染します。
  14. 超遠心分離機からバケツを取り外し、バケツをカテゴリーIIの生物学安全キャビネットに慎重に輸送します。
    注:レンチウイルス粒子は超遠心チューブの底に集まります。ペレットは肉眼では見えません。
  15. スクロースと培地を1回の滑らかな動きで、除染溶液と一緒に廃棄物容器に直接注ぎます。
  16. 超遠心チューブを逆さまにした状態で、組織の二重層に移し、10分間乾燥させます。その間に、バケツの内側を水に浸したティッシュで拭き、逆さまにして風乾します。
  17. 超遠心チューブの縁に残っている液体をティッシュで慎重に乾かしてから、直立させます。ティッシュとその下の表面を消毒します。
  18. ウイルスペレットを1 mLの無血清培地またはさらなる実験に必要な溶液に再懸濁し、溶液を静かにピペッティングします。カテゴリーIIの生物学安全キャビネット内のRTで15分間放置します。
  19. 1 mLピペットを使用してレンチウイルス調製物を穏やかに混合してから、1.5 mLスクリュートップチューブ(クライオチューブなど)に分注します。 in vivo 研究用(多重度 100 μL)およびJurkat T細胞のレンチウイルス力価用(1 x 20 μL)用のアリコートを調製します(ステップ5を参照)。
  20. 凍結融解サイクルは避けてください。レンチウイルス製剤は、-80°Cで最大6ヶ月間保存でき、感染力に悪影響を与えることはありません。

5. Jurkat T細胞におけるレンチウイルス産生の滴定

  1. 500 mL の RPMI-1640 に 10% (v/v) の子牛胎児血清を補給し、最終濃度 100 U/mL のペニシリン/ストレプトマイシンを補給することにより、Jurkat T 細胞用の完全なロズウェル パーク メモリアル インスティテュート 1640 培地 (cRPMI-1640) を準備します。
  2. Jurkat T細胞の健康な培養を確保するために、感染前の最大1週間、細胞を培養中に維持してください。
  3. レンチウイルス滴定の日に、cRPMI-1640のウェルあたり200 μLの2 x 105 細胞/ウェルの24ウェルプレートで生存可能なJurkat T細胞をプレートアウトします。
  4. 採取したばかりのレンチウイルスを使用するか、20μLの入ったレンチウイルスバイアルを氷上で解凍し、ピペッティングで上下させて穏やかに混合します。
  5. cRPMI-1640の段階希釈を使用して、0.25 μL、0.5 μL、1 μL、2.5 μL、5 μL、および10 μLのレンチウイルスストックをJurkat T細胞に感染させます。プレートを静かに揺らして、レンチウイルスが均等に分布するようにします。非感染Jurkat T細胞は、ネガティブコントロールとして機能します。
  6. プレートを37°Cでインキュベートします。 4時間後、各ウェルにcRPMIを合計400 μLまで補充し、プレートを37°Cのインキュベーターに3日間戻します。
  7. 感染後48時間後、蛍光イメージングシステム下でGFPの発現を確認します。
  8. 感染の3日後、24ウェルプレートの各ウェルを別々の1.5 mLコレクションチューブに集め、細胞を350 x g 、4°Cで5分間遠心分離します。
  9. 上清を捨てます。DPBSで2%(w / v)調製した2%パラホルムアルデヒド(PFA)の300μLにペレットを再懸濁し、暗所の氷上に15分間放置します。
  10. 細胞を350 x g 、4°Cで5分間遠心分離し、ペレットを蛍光活性化セルソーティング(FACS)バッファー(滅菌DPBS + 4% FCS + 1 mM 滅菌EDTA)に再懸濁します。
  11. フローサイトメトリーを使用して、感染したレンチウイルスとその制御細胞のGFP発現頻度と平均蛍光強度を解析します(図2)。

6. 組織常在性腹膜マクロファージの in vivo レンチウイルス感染

  1. カテゴリーIIの生物学的安全キャビネットに、必要量のレンチウイルスを含む総容量200μLの無血清培地をインスリン針に装填します(動物福祉と針の体液損失を避けるために、30Gの使い捨て針を使用してください)。
  2. 片手スクープ技術を使用して、針シースを針に戻します。針を氷の上に置いて、30分以内に注入します。
  3. 動物施設では、注射前にカテゴリーIIの生物学的安全キャビネットを設置します(図1E)。
    1. きれいなティッシュペーパーのシートを置きます。レンチウイルスを含むインスリン針の鞘を緩めます。.
    2. ティッシュの小片とグルコン酸クロルヘキシジンベースの消毒剤が入ったシャーレ、除染液(漂白剤溶液2,000ppm)が入った50mLチューブ、鋭利で安全な容器を準備します。
  4. 首筋21の皮膚をつかむことでマウスを拘束する。適切に拘束されたマウスは動かず、これは安全のために必要です。
  5. 腹部を上に向けて、動物の頭を少し下に向けます。レンチウイルスを腹腔の右下象限に腹腔内に注入します。.これは、腹腔臓器への注射を避けるためです。
  6. マウスを放す前に、シリンジに除染液を入れ、鋭利な金庫に安全に廃棄してください。
  7. マウスの腹部の注射部位を消毒剤に浸した組織で拭き、動物をケージに戻します。
  8. レンチウイルスを注入したマウスを、カテゴリーIIのスキャンテーナーまたは個別換気ケージ(IVC)(高効率の空気ろ過を備えた隔離ケージ)に注射後最低72時間収容します。ケージの前面に適切な情報カードを置きます。
  9. 感染後72時間後にマウスを新しいカテゴリーI保持ケージに移動します(現地の安全承認によります)。マウスを注射から合計3日間毎日監視します。

7. レンチウイルス感染マウスの腹膜細胞の採取

注意:レンチウイルス注射後72時間以内のコレクションについては、施設のカテゴリーIIの生物学的安全規則に従ってください。.レンチウイルス注射後最初の72時間に感染した動物が保管されていた寝床および保持ケージは、施設のカテゴリーII生物学的安全規則に従って除染する必要があります。

  1. 施設の規制に従って、例えば、増加したCO2濃度を吸入することによりマウスを安楽死させ、続いて子宮頸部脱臼による死亡を確認します。
  2. マウスの腹部を70%イソプロパノールで洗浄し、慎重に皮膚を切って腹腔膜を露出させます。
  3. 10 mLのシリンジと23 Gの針を使用して、6 mLの氷冷FACSバッファーで腹腔を洗浄します。.臓器に穴を開けることは避けてください。
  4. 腹膜を優しくマッサージして、細胞をFACSバッファーに取り除きます。
  5. 同じ注射器と針を使用して腹液を採取します。
  6. 針を取り外し、細胞を15 mLの遠心チューブに移します。
  7. 腹膜洗浄液を氷の上に保ちます。
  8. 他の必要な臓器を収集し、研究に応じてそれらを保管します。
  9. 動物の死骸は、地域の動物および安全ガイドラインに従って処分してください。

8. 腹膜細胞の染色と解析

  1. 腹膜洗浄液を350 x g 、4°Cで5分間遠心分離し、上清を除染液中に捨て、細胞を1 mLのFACS緩衝液に再懸濁します。
  2. 収集した細胞をカウントし、V底96ウェルプレートでウェルあたり4 x 105 細胞をプレート化します。
  3. メーカーの指示に従って、固定可能な試薬(例:ここで使用するFixable Near-IR Dead Cell Stain Kit)を使用して生存率染色を行います。
  4. 細胞が過去72時間以内に感染した場合は、細胞を氷上で2%PFAに15分間固定します。等量の冷たくしたDPBSを添加し、再度350 x g 、4°Cで5分間遠心分離します。
  5. ブロッキングバッファーを調製する:表面染色用のFACSバッファー中の10%(v/v)ラット血清中の4 μg/mL 2.4G2抗体を混合するか、細胞内染色用の透過化バッファーを混合します。
  6. 細胞ペレットを含む各ウェルを50 μLのブロッキングバッファーに再懸濁し、4°Cで15分間インキュベートします。
  7. 各サンプルにつき、50 μLのFACSバッファー(表面染色用)または透過化バッファー(細胞内染色用)のいずれかで抗体ミックスを調製します。各サンプルの最終的な染色量は100 μLで、これにはブロッキングバッファー50 μLが含まれます。それに応じて抗体濃度を計算します(表1)。
  8. サンプルに50 μLの抗体ミックスを、コントロールサンプルに50 μLのアイソタイプコントロールおよびコントロールバッファーを加えます。サンプルを暗所の氷上で30分間インキュベートします。必要に応じて、未染色の細胞とアイソタイプコントロールを含めます。
  9. 各ウェルを100〜200 μLの氷冷DPBSで洗浄し、プレートを350 x g 、4°Cで5分間遠心分離します。この手順を繰り返して、結合していない抗体を洗い流します。フローサイトメーターでサンプルを分析します。

9. 臓器からの細胞の抽出

  1. 臓器あたり1 mLの消化ミックスを調製します:ハンク平衡塩溶液(HBSS)、2 mg / mLコラゲナーゼIV型、および0.03 mg / mL DNase I(肺消化用のヒアルロニダーゼ1.5 mg / mLを含む)を混合します。.
  2. 採取した臓器を消化液1mLに移し、ハサミでみじん切りにします。
  3. 40 μmのストレーナで細胞をろ過し、350 x g 、4°C、5分間遠心分離します。
  4. 肺、脾臓、または肝臓から細胞を単離する場合は、ACK溶解バッファー(150 mM NH4Cl、10 mM KHCO3、0.1 mM Na2EDTA pH = 7.4)を使用して赤血球を溶解します。40 μmのストレーナで細胞をろ過し、350 x g 、4°C、5分間遠心分離します。
  5. セクション8で説明されているように、細胞を染色および分析します。

結果

完全かつ正しく従うと、このプロトコルは、1回の調製物あたり合計1.5mLの高品質レンチウイルスストックが得られ、この研究で決定された最適な量で12回の in vivo 注射に十分です18。トランスフェクションの成功は、プロトコールの早い段階で評価できます。健康でコンフルエントなHEK293T細胞は、プラスミド中に存在する場合、プラスミドト?...

ディスカッション

組織に常在するマクロファージは、その生理学的環境6,7,8,9によって決定されるさまざまな恒常性および炎症性の組織特異的機能1,2を実行します。このプロトコルでは、レンチウイルス粒子を使用してin vivoで腹膜に常在?...

開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

この研究は、全体的または部分的に、Wellcome Trust Investigator Award [107964/Z/15/Z] によって資金提供されました。PRTは、英国認知症研究所の支援も受けています。M.A.C.は、Biotechnology and Biological Sciences Research Council Discovery Fellowship(BB/T009543/1)の支援を受けています。オープンアクセスの目的で、著者は、この提出から生じる著者受理原稿バージョンにCC BY公開著作権ライセンスを適用しています。L.C.D.は、スウォンジー大学の講師であり、カーディフ大学の名誉研究員です。この研究は、Ipseiz et al. 2020,18.

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.05% Trypsin-EDTA (1x) (Trypsin 500 mg/L or 0.02 mM)Thermo Fisher Scientific25300054
0.22 μm sterile millex GP filterMerckSLGS033SS
0.45 μm sterile millex GP filterMerckSLHP033RS
0.5 mL U-100 insulin syringe with needle, 0.33 mm x 12.7 mm (29 G)BD324892
1 Litre Sharps ContainerN/AN/A
2.4G2 antibody (TruStain FcX anti-mouse CD16/32)Biolegend101320
40 μm strainerThermo Fisher Scientific22363547
AimV medium (research grade), AlbuMax SupplementThermo Fisher Scientific31035025
Blocking bufferprepared in house
Brewer thioglycolate mediumSigma-AldrichB25514% stock solution prepared in water, autoclaved and kept frozen.
CD11bBiolegend101222Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD11bBD550993Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD11cBiolegend117317Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD11cBiolegend117333Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD19BD560375Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD19Biolegend152410Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD226Biolegend128808Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD3eBD560527Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD3eBiolegend152313Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD4Biolegend100412Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD73eBioscience16-0731-82Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD8aeBioscience48-0081-82Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Cell culture flask (T175 fask, 175 cm2, 550 mL)Greiner Bio One658175
Centrifuge tubes, conical bottom tubes 25 mm x 89 mmBeckman Coulter358126
CentrifugesBeckman CoulterUltracentrifuge and TC centrifuge
Collagenase type IVSigma-AldrichC5138
Conical centrifuge tubes (15 mL and 50 mL)Greiner Bio One11512303 & 11849650
CryotubesGreiner Bio One123277or cryotubes
DMEM medium (1x) + 4.5g/L D-glucose, 400 µM L-glutamineThermo Fisher Scientific41965-062
Dnase ISigma-Aldrich11284932001
Effectene transfection reagentQiagen301425
F4/80Biolegend123123Refer to Table 1 for the dilution and concentration
F4/80Biolegend123133Refer to Table 1 for the dilution and concentration
F4/80Biolegend123147Refer to Table 1 for the dilution and concentration
FceR1eBioscience48-5898-80Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Fetal calf serum (FCS) Thermo Fisher Scientific10270-106heat inactivated for 30 min at 56 °C and sterile filtered through 0.22 μm filter
Flow cytometerThermo Fisher Scientific Attune NxT
Flow cytometry (FACS) bufferprepared in house
Fluorescent tissue culture microscopeThermo Fisher ScientificEVOS FL
ForcepsN/AN/AUser preference
Hank's balanced salt solution (HBSS)Gibco, Life Technologies14175-053
HEK293T cell linegrown for at least a week prior transfection. Mycoplasma free
HIV-1 Core antigenBeckman Coulter6604667
HyaluronidaseSigma-AldrichH3506
Hydrex surgical scrub, chlorhexiding gluconate 4% w/v skin cleanserEcolab3037170
I-A/I-EBiolegend107625Refer to Table 1 for the dilution and concentration
ICAM1Becton Dickinson554970Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Jurkat T cell linegrown for at least a week prior use. Mycoplasma free
LIVE/DEAD fixable near-IR dead cell stain kitThermo Fisher ScientificL34975
Ly6GBiolegend127615Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Micehere used C57BL/6 females, aged 8-12 weeks (Charles Rivers), unless specified differently
Microcapillary pipettes (volume range 0.5-1,000 μL)Fisher Scientific & Starlab11963466 & 11943466 & 11973466 & S1111-3700
NK1.1Biolegend108724Refer to Table 1 for the dilution and concentration
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148-500Gprepared to 2% w/v in PBS
pCMV-ΔR8.91 packaging plasmidZuffrey, R., et al. 1997encodes Gag-Pol HIV protein driven by cytomegalovirus promoter. Ampicilin resistance.
Penicillin/Streptomycin (100x, 10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
Petri dishGreiner Bio One664160
pHR'SIN-cPPT-SEW plasmidRosas, M. et al. 2014modified for shRNA and miR expression studies. Encodes EGFP marker downstream SFFV promoter and upstream of the Woodchuck hepatitiv virus enhancer. Ampicilin resistance.
pMD2.G plasmidNaldini, L. et al. 1996encodes vesicular stomatis virus g-glycoprotein (VSV-G) envelope. Ampicilin resistance.
Rat IgG1, κ isotype controlBecton Dickinson550617Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Rat serumSigma-AldrichR9759-10ML
Red blood ACK lysis bufferprepared in house
RPMI 1640 medium (1x) + 400 uM L-glutamineThermo Fisher Scientific21875-091
SaponinSigma-AldrichS4521
SiglecFBD562681Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Sodium hypochlorite Tablets (bleach, 2,000 ppm)Guest MedicalH8818
Sterile 24-well cell culture plateGreiner Bio One662160
Sterile Dulbecco's PBS (DPBS) (1x) Mg++ and Ca2+ - freeThermo Fisher Scientific14190144
Sterile EDTAThermo Fisher Scientific15575020
Sterile VWR disposable transfer pipets (23.0 mL, 30 cm)VWR612-4515
SucroseThermo Fisher Scientific15503022
surgical scissorsN/AN/AUser preference
Syringes (50 mL and 1 0mL)Fisher Scientific10084450 & 768160
Tim4Biolegend130007Refer to Table 1 for the dilution and concentration
U-bottom 96-well cell culture plateGreiner Bio One650180

参考文献

  1. Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
  2. Jantsch, J., Binger, K. J., Muller, D. N., Titze, J. Macrophages in homeostatic immune function. Front Physiol. 5, 146 (2014).
  3. Wynn, T. A., Vannella, K. M. Macrophages in tissue repair, regeneration, and fibrosis. Immunity. 44 (3), 450-462 (2016).
  4. Ginhoux, F., Guilliams, M. Tissue-resident macrophage ontogeny and homeostasis. Immunity. 44 (3), 439-449 (2016).
  5. Epelman, S., Lavine, K. J., Randolph, G. J. Origin and functions of tissue macrophages. Immunity. 41 (1), 21-35 (2014).
  6. Amit, I., Winter, D. R., Jung, S. The role of the local environment and epigenetics in shaping macrophage identity and their effect on tissue homeostasis. Nat Immunol. 17 (1), 18-25 (2016).
  7. Gosselin, D., et al. Environment drives selection and function of enhancers controlling tissue-specific macrophage identities. Cell. 159 (6), 1327-1340 (2014).
  8. Lavin, Y., et al. Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment. Cell. 159 (6), 1312-1326 (2014).
  9. Davies, L. C., et al. Peritoneal tissue-resident macrophages are metabolically poised to engage microbes using tissue-niche fuels. Nat Commun. 8 (1), 2047 (2017).
  10. Shi, J., Hua, L., Harmer, D., Li, P., Ren, G. Cre driver mice targeting macrophages. Methods Mol Biol. 1784, 263-275 (2018).
  11. Wang, X., et al. Recent advances in lentiviral vectors for gene therapy. Sci China Life Sci. 64 (11), 1842-1857 (2021).
  12. Kosaka, Y., et al. Lentivirus-based gene delivery in mouse embryonic stem cells. Artif Organs. 28 (3), 271-277 (2004).
  13. Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272 (5259), 263-267 (1996).
  14. Yamashita, M., Emerman, M. Capsid is a dominant determinant of retrovirus infectivity in nondividing cells. J Virol. 78 (11), 5670-5678 (2004).
  15. Wilson, A. A., et al. Lentiviral delivery of RNAi for in vivo lineage-specific modulation of gene expression in mouse lung macrophages. Mol Ther. 21 (4), 825-833 (2013).
  16. Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (17), 8033-8037 (1993).
  17. Finkelshtein, D., Werman, A., Novick, D., Barak, S., Rubinstein, M. LDL receptor and its family members serve as the cellular receptors for vesicular stomatitis virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (18), 7306-7311 (2013).
  18. Ipseiz, N., et al. Effective in vivo gene modification in mouse tissue-resident peritoneal macrophages by intraperitoneal delivery of lentiviral vectors. Mol Ther Methods Clin Dev. 16, 21-31 (2020).
  19. Rosas, M., et al. The transcription factor Gata6 links tissue macrophage phenotype and proliferative renewal. Science. 344 (6184), 645-648 (2014).
  20. . Available from: https://www.mybeckman.uk/resources/technologies/centrifugation/principles/rotor-balancing (2023)
  21. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Rodent Handling and Restraint Techniques. , (2023).
  22. Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nat Biotechnol. 15 (9), 871-875 (1997).
  23. Nasri, M., Karimi, A., Allahbakhshian Farsani, M. Production, purification and titration of a lentivirus-based vector for gene delivery purposes. Cytotechnology. 66 (6), 1031-1038 (2014).
  24. al Yacoub, N., Romanowska, M., Haritonova, N., Foerster, J. Optimized production and concentration of lentiviral vectors containing large inserts. J Gene Med. 9 (7), 579-584 (2007).
  25. Malim, M. H., Bieniasz, P. D. HIV restriction factors and mechanisms of evasion. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (5), a006940 (2012).
  26. Sonza, S., et al. Susceptibility of human monocytes to HIV type 1 infection in vitro is not dependent on their level of CD4 expression. AIDS Res Hum Retroviruses. 11 (7), 769-776 (1995).
  27. Kingston, R. E., Chen, C. A., Rose, J. K. Calcium phosphate transfection. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 9, Unit 9.1 (2003).
  28. Brown, L. Y., Dong, W., Kantor, B. An Improved protocol for the production of lentiviral vectors. STAR Protoc. 1 (3), 100152 (2020).
  29. Moce-Llivina, L., Jofre, J., Muniesa, M. Comparison of polyvinylidene fluoride and polyether sulfone membranes in filtering viral suspensions. J Virol Methods. 109 (1), 99-101 (2003).
  30. Jiang, W., et al. An optimized method for high-titer lentivirus preparations without ultracentrifugation. Sci Rep. 5, 13875 (2015).
  31. Czubala, M. A., et al. TGFbeta induces a SAMHD1-independent post-entry restriction to HIV-1 infection of human epithelial langerhans cells. J Invest Dermatol. 136 (10), 1981-1989 (2016).
  32. Bouabe, H., Okkenhaug, K. Gene targeting in mice: a review. Methods Mol Biol. 1064, 315-336 (2013).
  33. Kim, J. M., Rasmussen, J. P., Rudensky, A. Y. Regulatory T cells prevent catastrophic autoimmunity throughout the lifespan of mice. Nat Immunol. 8 (2), 191-197 (2007).
  34. Decalf, J., et al. Sensing of HIV-1 entry triggers a Type I Interferon response in human primary macrophages. J Virol. 91 (15), e00147-e00217 (2017).
  35. Wilson, A. A., et al. Amelioration of emphysema in mice through lentiviral transduction of long-lived pulmonary alveolar macrophages. J Clin Invest. 120 (1), 379-389 (2010).
  36. Markusic, D. M., van Til, N. P., Hiralall, J. K., Elferink, R. P., Seppen, J. Reduction of liver macrophage transduction by pseudotyping lentiviral vectors with a fusion envelope from Autographa californica GP64 and Sendai virus F2 domain. BMC Biotechnol. 9, 85 (2009).
  37. Burke, B., Sumner, S., Maitland, N., Lewis, C. E. Macrophages in gene therapy: cellular delivery vehicles and in vivo targets. J Leukoc Biol. 72 (3), 417-428 (2002).
  38. Bain, C. C., Jenkins, S. J. The biology of serous cavity macrophages. Cell Immunol. 330, 126-135 (2018).
  39. Milone, M. C., O'Doherty, U. Clinical use of lentiviral vectors. Leukemia. 32 (7), 1529-1541 (2018).

転載および許可

このJoVE論文のテキスト又は図を再利用するための許可を申請します

許可を申請

さらに記事を探す

RNAin vivoHEK293T

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

個人情報保護方針

利用規約

一般データ保護規則

お問い合わせ

図書館への推薦

JoVE ニュースレター

研究

教育

著者

図書館員

JoVEについて

Copyright © 2023 MyJoVE Corporation. All rights reserved