ナノポーラス金の階層的デザインを生成するための汎用性の高い技術

要約

階層的かつ二峰性の細孔径分布を有するナノポーラス金は、電気化学的脱合金と化学的脱合金を組み合わせることによって製造することができる。合金の組成は、脱合金プロセスが進むにつれてEDS-SEM検査 を介して 監視できます。材料の負荷容量は、材料へのタンパク質吸着を調べることによって決定できます。

要約

バイオセンサー、アクチュエーター、薬物の装填と放出、触媒の開発の分野での可変細孔サイズ、単純な表面改質、および幅広い商業的使用を生み出す可能性は、研究開発におけるナノポーラス金(NPG)ベースのナノ材料の使用を間違いなく加速させました。この記事では、電気化学的合金化、化学的脱合金技術、およびアニーリングを含む段階的な手順を採用してマクロ孔とメソ孔の両方を作成することにより、階層的二峰性ナノポーラス金(hb-NPG)を生成するプロセスについて説明します。これは、双連続ソリッド/ボイド形態を作成することによってNPGの有用性を向上させるために行われます。表面改質に利用できる領域は、より小さな細孔によって強化され、分子輸送はより大きな細孔のネットワークから恩恵を受ける。一連の製造ステップの結果であるバイモーダルアーキテクチャは、走査型電子顕微鏡(SEM)を使用して、サイズが100 nm未満で、靭帯によって数百ナノメートルのサイズの大きな細孔に接続された細孔のネットワークとして視覚化されます。hb-NPGの電気化学的に活性な表面積は、サイクリックボルタンメトリー(CV)を使用して評価され、脱合金とアニーリングの両方が必要な構造を作成する上で果たす重要な役割に焦点を当てています。さまざまなタンパク質の吸着は、溶液枯渇技術によって測定され、タンパク質負荷に関してhb-NPGのより良い性能を明らかにします。表面積と体積の比率を変えることで、開発されたhb-NPG電極は、バイオセンサーの開発に大きな可能性を提供します。この原稿では、hb-NPG表面構造を作成するためのスケーラブルな方法について説明しています, 低分子の固定化のための大きな表面積と、より速い反応のための改善された輸送経路を提供するため.

概要

自然界でよく見られる階層的な多孔質構造は、ナノスケールで模倣され、材料の物理的特性を変化させて性能を向上させています¹。様々なスケールの長さの相互連結構造要素は、多孔質材料の階層構造の特徴である²。脱合金ナノポーラス金属は、典型的には、単峰性の細孔径分布を有する。したがって、2つの別々の細孔サイズ範囲³を有する階層的に二峰性の多孔質構造を生成するために、複数の技術が考案されてきた。材料設計アプローチの2つの基本的な目的、すなわち、機能化のための大きな比表面積と、本質的に互いに矛盾する迅速な輸送経路は、構造階層^4,5を持つ機能性材料によって達成されます。

電気化学センサーの性能は、ナノマトリックスの細孔サイズが分子の輸送と捕獲に重要であるため、電極の形態によって決まります。小さな細孔は複雑なサンプルのターゲット識別に役立つことがわかっていますが、大きな細孔はターゲット分子のアクセシビリティを高め、センサーの検出範囲を広げます⁶。テンプレートベースの製造、電気めっき、ボトムアップ合成化学、薄膜スパッタリング堆積⁷、ポリジメチルシロキサン支持体⁸に基づく複雑な可撓性マトリックス、様々な金属の合金化とそれに続く以下の貴金属の選択的エッチング、および電着は、電極にナノ構造を導入するために頻繁に使用される方法のいくつかである。多孔質構造を作成するための最良の方法の1つは、脱合金手順です。溶解速度の差により、貴金属が少ない犠牲金属は、電極の最終的な形態に大きな影響を与えます。細孔と靭帯の相互接続されたネットワークは、ナノポーラス金(NPG)構造を作成する効果的なプロセスから生じ、そこでは、より貴でない成分が出発合金から選択的に溶解し、残りの原子が再編成および統合します⁹。

DingとErlebacherがこれらのナノ構造を作るために使用した脱合金/メッキ/再脱合金の方法は、最初に金と銀からなる前駆体合金を硝酸を用いて化学的脱合金にかけ、次に単一の細孔径分布でより高い温度で加熱して上の階層レベルを作成し、残りの銀を除去する2番目の脱合金を使用してより低い階層レベルを生成する。この方法は薄膜¹⁰に適用できた。一度に1つずつ侵食される2つの比較的反応性の高い貴金属で構成される三元合金を使用することは、Bienerらによって助言されました。CuおよびAgは最初にCu−Ag−Au材料から除去され、二峰性構造の低密度NPGサンプル¹¹を残した。長距離秩序構造は、三元合金を利用して概説した手順では生成されません。Zhangらが採用したAl-Auの母合金の相の1つを抽出することによって、より大きな細孔が生成され、最小の次数¹²で二峰性構造が生成されました。伝えられるところによると、バルク材料の分解や基本コンポーネントをより大きな構造にまとめるなどの処理経路を使用して、いくつかの長さスケールを制御することによって、順序付けられた階層構造が作成されています。この場合、階層的なNPG構造は、直接インク書き込み(DIW)、合金化、および脱合金 化を介して 作成されました¹³。

ここでは、種々のAu-Ag合金組成を用いた階層型二峰性ナノポーラス金(hb-NPG)構造を作製するための2段階脱合金法を提示する。それ以下では脱合金が停止する反応性元素の量は、理論的には離型限界です。表面拡散速度論は、二元合金からのより反応性の高い成分の電解溶解のために典型的に50〜60原子パーセントの間である離型限界または脱合金閾値によってわずかに影響を受ける。Au:Ag合金中のAgの大きな原子分率は、電気化学的および化学的脱合金プロセスの両方が離型限界¹⁴近くの低濃度では正常に完了できないため、hb-NPGの合成を成功させるために必要です。

この方法の利点は、構造と細孔サイズを厳密に制御できることです。プロトコルの各ステップは、典型的な空隙率の長さスケールと靭帯間の典型的な距離を微調整するために重要です¹⁵。イオン界面の拡散と溶解の速度を調整するために、印加電圧は慎重に校正されます。脱合金化時の割れを防ぐために、Ag溶解速度が制御されています。

プロトコル

1.金線上に階層的バイモーダル構造を持つナノポーラス金のコーティングを構築する-合金化

1. 5 mLビーカーで電気化学セルを組み立てます。3つの穴のあるテフロンベースの蓋を使用して、3つの電極セットアップを収容します。
   注意: テフロンは、他の化学物質と反応しないため、蓋を作るための一般的な材料です。
2. 白金線の対電極、Ag/AgCl(飽和KCl)参照電極、および作用極として機能する直径0.2 mm、長さ5.0 mmの金線( 材料の表を参照)を蓋の各穴に便利に配置します。作用電極と対極の間の距離を0.7cmに保ちます。
   注意: ワイヤーの長さは1 cmで、ワニ口クリップをクリップした後、溶液に入る露出部分は0.5 cmです。残りの部分はポリテトラフルオロエチレンテープで覆っています( 材料表を参照)。この長さは、実験を行うたびにスケールを使用して正確に測定されます。金線は、研究で使用される前にいくつかのステップで洗浄されます。最初に濃硝酸に浸し、次にすすぎ、ピラニア溶液に浸し、最後に水素化ホウ素ナトリウムに浸します。これらの強力な試薬は、ワイヤーに付着している可能性のある不純物を除去するのに役立ちます。
3. K[Ag(CN)2]とK[Au(CN)₂](材料の表を参照)のそれぞれ50 mM溶液を水中で調製します。5 mLビーカーに0.5 mLのK[Au(CN)2]溶液と4.5 mLのK[Ag(CN)₂]塩溶液を加えます。
   注意: シアン化物塩の取り扱いと廃棄には注意してください。取り扱い中は、保護手袋、適切な衣服、呼吸用保護具、および目の保護具を着用し、ドラフトで作業してください。シアン化物塩溶液は、実験終了後に収集し、明確にマークされた別の廃棄物容器に入れる必要があります。酸と接触すると、危険なフュームが放出されます。イオン移動度を維持するために、0.25M Na2CO3を2つの塩の各々のストック40mM溶液に添加する。
4. マグネチックスターラーバーを電気化学セルに挿入し、300rpmの一定の攪拌速度で溶液を完全に混合します。
   注意: スターラーバーが汚れていないことを確認します。王水は、汚染物質がある場合にそれをきれいにするために使用することができます。
5. 内径1/32インチ、外径5/32、肉厚1/16のシリコンチューブ( 材料表を参照)を使用してアルゴンガスを溶液に循環させ、電気化学セル内に入って電解液中の溶存酸素を除去します。
   注意: セットアップの漏れは、十分にタイトにすることで回避されます。
6. 電気化学セルが完全に組み立てられたら、適切な電極にクリップされたワニ口クリップを使用してポテンショスタットを接続します。
   注意: 混乱を避けるために、クリップに取り付ける電極の名前でクリップにラベルを付けることをお勧めします。
7. ソフトウェア(PowerSuite; 材料表を参照)を使用して、ポテンショスタットをオンにした後、クロノアンペロメトリーを利用した電着を実行します。必要なパラメータを使用してソフトウェアを設定します。600秒間、電位は-1.0V¹⁵の固定値で計時されます。
   メモ: パラメータを指定する前に、起動プロセスが自動的に終了するまでにしてください。 補足ファイル1 は、この特定のソフトウェアを使用するためのスクリーンショットを示しています。
8. 実行を押して外部セルを選択し、作用電極への合金堆積を完了します。プロセスの最後に厚い白いコーティングが見られます。
   注意: 接続がしっかりしていて、溶液が着実に攪拌されていることを確認してください。すべてが正常に機能する場合、電流は300〜400μAの間で振動します。

2. 金線上に階層的二峰性構造を有するナノポーラス金のコーティングを構築する - 脱合金化

注:プロトコルのこのフェーズは、合金ワイヤの部分的な脱合金に基づいています。

1. 前のプロセス(ステップ1.2)と同様に、3つの電極を電解液中で互いに0.7cm離した状態で、電気化学セルをもう一度構成します。部分脱合金の電解液として4 mLの1 N硝酸を使用してください。
   注意: 電解質は希釈されているため、ここでは銀である貴金属元素を完全に除去することはできません。
2. スターラーバーを動かしたままにして、300rpmの一定速度で溶液を均一に循環させます。
3. 電気化学セルをセットアップしたら、正しい電極にクリップされたワニ口クリップを使用してポテンショスタットを取り付けます。
4. クロノアンペロメトリーソフトウェアをもう一度使用しますが、今回は600秒間0.6Vの電位を選択します。
5. 実行を押してから、外部セルを選択して、作用電極に堆積した合金の脱合金を終了します。
   注意: この手順を実行すると、ワイヤの色が灰色がかった黒に変わります。

3. 金線上に階層的バイモーダル構造を持つナノポーラス金のコーティングを構築する - アニーリング

1. 脱合金されたワイヤーを炉内のガラスバイアルに保管してください。
2. 炉内の温度を600°Cで3時間維持します。
   注:温度と持続時間は最適化研究に基づいて選択され、温度が低いと細孔が粗くならず、温度が高く、時間が長いと構造に亀裂が生じることが示されました。
3. 手順が終了し、炉の電源を切ったら、バイアルを取り外します。バイアルが室温に冷えるまで待ちます。
   注:熱いバイアルは、トングのセットを使用して炉から取り出されます。

4. 金線上に階層的二峰性構造を有するナノポーラス金のコーティングの構築 - 脱合金化

1. 部分的に脱合金化焼鈍したワイヤを4 mLの濃硝酸に浸します。
   注意: 濃酸をワイヤーを含むガラスバイアルに移すときは、ガラスピペットが使用されていることを確認してください。
2. 部分的に脱合金化焼鈍したワイヤを、ヒュームフード内の強硝酸を含むガラスバイアルに一晩放置します。
   注:完全な脱合金を可能にするために、脱合金期間は24時間に保たれました。
3. 翌日、hb-NPGコーティングされたワイヤを作成します(図1)。これらを脱イオン水で十分にすすぎ、続いてエタノールリンスを行ってから、その後の研究で使用してください。乾燥後、実験でワイヤーを使用してください。きれいな金線の新しいバッチは、hb-NPGを準備するために毎回使用されます。
   注:合成のすべてのステップは、バイモーダル構造に到達するために重要です。いずれかの手順をスキップすると、単峰性の細孔構造のみが生成されます。

5. HB-NPGの特性評価

1. 走査型電子顕微鏡(SEM)-サンプル調製
   1. SEMイメージング用のサンプル調製のベースとして、清潔なアルミニウムスタブを使用してください。
      注意: スタブは希硝酸で洗浄され、エタノールですすがれ、乾燥され、パラフィンフィルムで覆われた容器に保管されてから再度使用されます。
   2. 新しくカットしたカーボンテープをアルミスタブの平らなベースに置きます。
   3. ピンセットを使用して、hb-NPGコーティングされたワイヤーの小片を切り取り、カーボンテープに接着します。
      注意: コーティングが剥がれないように、ワイヤーがピンセットでそっと握られていることを確認してください。
   4. カットピースを水平に配置して、SEMの下でそれらの形態を明らかにします( 材料の表を参照)。垂直に配置されたピースは、金線に堆積した材料の厚さを明らかにすることができます(図2)。
      注意: 電極に湿気があると、チャンバーが汚染され、画像がぼやけます。そのため、SEMイメージングを行う前に電極を一晩真空中に置く。
2. SEMチャンバーのセットアップ
   1. ソフトウェア「XT顕微鏡」のオプション「ベント」を使用してチャンバーをベントし、チャンバーのドアを簡単に開きます。
      注:「XT顕微鏡」ソフトウェアにはSEMシステムが付属しています。ドアをスムーズに開く前に、チャンバーを最初に完全に通気する必要があり、通常は3〜5分かかります。さらに、窒素ガスボンベの圧力は5psi未満でなければなりません。 補足ファイル1 は、この特定のソフトウェアを使用するためのスクリーンショットを示しています。
   2. 特殊なピンセットの湾曲した前面を使用して、円形のアルミニウムスタブをしっかりとつかみ、以前にスタブに置かれたクリーンサンプルをチャンバーに挿入し、サンプルステージに置きます。
      注意: ステージがきれいであることを確認してください。こぼれた場合は、アセトンと糸くずの出ない拭き取りで取り除きます(資料表を参照)。
   3. チャンバー内にサンプルを配置した後、「ポンプ」オプションを選択して、真空のような環境を作り出します。
      注意: チャンバーをポンピングするのに約3分かかります。ビームをオンにする前に、ユーザーはポンピングが終了するのを待つ必要があります。
   4. ナビゲーションカメラを使用して、 リアルタイム画像 をクリックして、サンプルの正確な位置を観察します。
3. サンプルのイメージング
   1. 最初にビームをオンにして、サンプルの画像をキャプチャします。
      注意: ビームをオンにする前に、システムが掃除機をかけられていることを確認してください。
   2. ナビゲーションカメラの収集した画像からサンプル画像を画面の中央に移動し、フォーカスをシャープにするには、それをダブルクリックします。
   3. 互換性のあるソフトウェアとエバーハートソーンリー検出器(ETD)を使用したイメージングを利用して画像が生成されていることを確認してください。スポットサイズ、スキャンレート、および電位を最適化する必要があります。
      注意: 上に移動する前に、より低い電位とスポットサイズから始めることは常に有望です。
   4. ビーム光源からのステージ距離を10mmに調整します。
      注意: ステージとソースの間の距離を正確に測定するため。システムは焦点を合わせ、Z軸に接続する必要があります。
   5. 低縮尺で存在するアーキテクチャの詳細については、低倍率でフォーカスされた画像を取得した後、倍率を上げます(図3)。
      注意: 倍率を上げるには、すべてフォーカスが必要です。
4. サンプルの元素組成に関するSEMおよびエネルギー分散型分光法(EDS)
   1. ソフトウェアでカラーSEMオプションを選択して、材料の元素構成を決定します(図4)。サンプルのさまざまな要素に多様な色を自動的に割り当てます。ただし、色や要素を手動で選択することもできます。
      注:元素組成分析チャートと元素の原子パーセンテージを調べて、原子パーセンテージが0の選択肢を除外することが重要です。
   2. EDS検出器を挿入することにより、研究中のサンプルをエネルギー分散型X線分光法にかけます。EDSデータの収集には、15kVの電位と12のスポットサイズを使用します。
      注意: 挿入ボタンを押すと、画面に挿入された検出器がリアルタイムで表示されます。
   3. プログラムが、サンプル画像画面上の個別の領域を選択するための小さなボックスを作成し、元素組成の情報を収集できることを確認します。
      注:正確な統計を行うには、50〜100,000カウントが必要です。パネルには、収集されたデータの全体的な状況が表示されます。結論として、レポートが作成されます。

6. 電気化学的に活性な表面積のサイクリックボルタンメトリー(CV)

1. 酸化金ストリッピング法は、参照電極、対極、および作用電極を電解質に浸して電気化学セルを手動でセットアップすることを含みます。
   注:本研究では、Ptワイヤが対電極、hb-NPGが作用電極、Ag/AgClが参照電極として機能します。硫酸、0.5 Nは電解質として機能します。使用前に、参照電極と対電極を希硝酸で洗浄することをお勧めします。また、電解液の再利用は避けてください。
2. ポテンショスタットへの接続が確立されたら、プログラムからCVオプションを選択し、パラメータを設定します。100mV/sのスキャンレートで、電位範囲を-0.2-1.6V(図5)から-0.2V(Ag/AgClに対して)に戻します。
   注:攪拌は必要ありません。
3. 実行ボタンをクリックして、サイクリックスキャンを実行します。リバーススキャンで顕著なピークが明らかになっていることを確認します。報告されている400μC cm-2の変換係数を使用して、酸化金単層の還元から来るピークの下の電荷を積分して、^hb-NPGワイヤの電気化学的表面積を決定します。
   注意: ピークの下の電荷を適切に積分するには、接線を正しく引く必要があります。
4. 化学的に脱合金されたワイヤで同じ一連の実験を行い、Au:Ag(10:90)合金ワイヤで化学的および電気化学的脱合金を組み合わせた後、デュアル脱合金手順の決定的な重要性を理解します。

7.タンパク質負荷を研究するための溶液枯渇技術

1. hb-NPG表面へのタンパク質分子のリアルタイム負荷を調べるには、紫外可視(UV-vis)分光光度計を使用します(材料表を参照)。
   注:この研究では、フェチュイン、ウシ血清アルブミン(BSA)、および西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)のタンパク質溶液( 材料の表を参照)を、0.01 M(pH = 7.4)リン酸緩衝生理食塩水(PBS)バッファーで、それぞれ1 mg / mL、0.5 mg / mL、および1 mg / mLの濃度で別々に調製しました。タンパク質の安定性を維持するバッファーとpHを選択することが重要です。
2. バッファーのみを使用してベースライン補正を実行します。補正を行った後、波長、時間、レートなどのソフトウェアのパラメータを選択します。次に、500 μLのタンパク質溶液をキュベット内に入れます。
3. hb-NPGを溶液に加えた後に、リアルタイムのタンパク質モニタリングが開始されることを確認します。 スタート ボタンを押した後、280 nmで120分間毎分吸光度の変化を監視します(図6)。

結果

靭帯サイズと靭帯間ギャップの調整は、製造された電極にとって最も重要です。Au/Ag比を最適化して二重サイズの細孔を持つ構造を作成することは、表面形態、粗さ係数、および負荷容量を利用したキャラクタリゼーションとともに、この研究の最初のステップです。従来のNPGと比較して、バイモーダル細孔構造は、より高い電気化学的表面積、粗さ係数、およびタンパク質負荷容量を示し?...

ディスカッション

合金化、部分脱合金化、熱処理、酸エッチングを含む多段階の手順を使用して、デュアルサイズの細孔とより高い活性電気化学的表面積を持つ階層的にNPGを製造することが実証されます。

合金化では、金属前駆体の標準電位が電着中の反応性に影響します。溶液からのAuおよびAgイオンは、電着中に還元される^16,17。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Argon gas compressed	Fisher Scientific Compay
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich (St.Louis, MO)	A9418	> 98% purity
Counter electrode (Platinum wire)	Alfa Aesar	43288-BU	0.5 mm diameter
Digital Lab furnace	Barnstead Thermolyne 47,900	F47915	used for annealing at high temperatures
Digital Potentiostat/galvanostat	EG&G Princeton Applied Research	273A	PowerPULSE software
Ethanol	Sigma-Aldrich (St.Louis, MO)	CAS-64-17-5	HPLC/spectrophotometric grade
Fetuin from fetal calf serum	Sigma-Aldrich (St.Louis, MO)	F2379	lyophilized powder
Gold wire roll	Electron Microscopy Sciences (Fort Washington, PA)	73100	0.2 mm diameter, 10 ft, 99.9%
Hydrochloric acid	Fisher Chemical	A144C-212	36.5-38%
Hydrogen peroxide	Fisher Scientific (Pittsburg, PA)	CAS-7732-18-5	30%
Kimwipes	KIMTECH Science brand, Kimberly-Clark professional	34120	4.4 x 8.2 in
Nitric acid	Fisher Scientific (Pittsburg, PA)	A2008-212	trace metal grade
Parafilm	Bemis PM996	13-374-10	4 IN. x 125 FT.
Peroxidase from horseradish (HRP)	Sigma-Aldrich (St.Louis, MO)	9003-99-0
PharMed silicone tubing	Norton	AY242606	1/32" Inner Diameter, 5/32" Outer Diameter, 1/16" Wall Thickness, 25' Length
Potassium dicyanoargentate	Sigma-Aldrich (St.Louis, MO)	379166	99.96%, 10 G
Potassium dicyanoaurate	Sigma-Aldrich (St.Louis, MO)	389867	99.98%, 1 G
PowerSuite software	EG&G Princeton Applied Research		comes with the instrument
PTFE tape	Fisherbrand	15-078-261	1" wide 600" long
Reference electrode (Ag/AgCl)	Princeton Applied Research	K0265
Scanning Electron Microscopy (SEM) Apreo 2C	ThermoFisher scientific	APREO 2 SEM	equipped with Color SEM technology
Simplicity UV system	Millipore corporation, Boston, MA, USA	SIMSV00WW	for generating Milli-Q water(18.2 MΩ cm at 25 °C)
Sodium Borohydride	Sigma-Aldrich (St.Louis, MO)	213462	100 G
Sodium Carbonate	Sigma-Aldrich (St.Louis, MO)	452882	enzyme grade, >99%, 100 G
Stir bar	Fisherbrand	14-512-153	5 x 2 mm
Sulphuric acid	Fisher Scientific (Pittsburg, PA)	A300C-212	certified ACS plus
Supracil quartz cuvette	Fisher Scientific (Pittsburg, PA)	14-385-902C	10 mm light path, volume capacity 1 mL
UV-Visible Spectrophotometer	Varian Cary 50