蛍光バイオセンサーの動態とホルモン分泌プロファイルの同期評価のためのヒト偽島システム

要約

このプロトコルは循環アデノシンの一リン酸塩(cAMP)の生物センサー、 その場 (cADDis)のcAMPの相違の探知器のアデノウイルス配達を使用して細胞内シグナリングでき事およびインシュリンおよびグルカゴンの分泌およびmicroperifusionシステムの同時獲得そしてco登録のための方法を記述する。

要約

ランゲルハンス膵島は、膵臓全体に点在する特殊な内分泌細胞と支持細胞の小さな3Dコレクションであり、血糖値を下げるベータ細胞によるインスリンの分泌と、血糖値を上昇させるアルファ細胞によるグルカゴンの分泌を介して、グルコースホメオスタシスの制御に中心的な役割を果たしています。cAMPによって媒介されるものを含む細胞内シグナル伝達経路は、アルファ細胞およびベータ細胞ホルモンの分泌調節に重要です。3D膵島構造は、協調的な膵島機能に不可欠ですが、初代ヒト膵島細胞における細胞内シグナル伝達経路の機構研究には実験上の課題があります。これらの課題と制限を克服するために、このプロトコルでは、形態、組成、および機能において天然の膵島に類似している糖尿病のないドナーから生成された一次ヒト偽膵島を使用して、統合された生細胞イメージングおよびマイクロ流体プラットフォームについて説明します。これらの偽膵島は、初代ヒト膵島細胞の分散および再凝集プロセスを通じてサイズ制御されます。分散状態では、膵島細胞の遺伝子発現を操作し得る。例えば、遺伝子コードされたcAMPバイオセンサ、cADDisなどのバイオセンサを導入することができる。いったん形成されると、遺伝子にコードされたバイオセンサーを発現する偽膵島は、共焦点顕微鏡および微小周融合プラットフォームと組み合わせることで、蛍光バイオセンサーの動態とアルファ細胞およびベータ細胞ホルモン分泌プロファイルの同期評価を可能にし、細胞のプロセスと機能に関するより多くの洞察を提供します。

概要

ランゲルハンス島は、膵臓全体に散らばる小さな器官であり、その機能はグルコースの恒常性の維持に不可欠です。インスリンは、グルコースの代謝、ATP/ADP比の増加、ATP感受性カリウムチャネルの閉鎖、原形質膜の脱分極、および細胞外カルシウム^の流入に続いてベータ細胞から分泌されます1。アルファ細胞からのグルカゴン分泌はあまり理解されていませんが、細胞内およびパラクリン経路がグルカゴン顆粒エキソサイトーシスに寄与すると仮定されています^2,3,4。1型糖尿病と2型糖尿病はどちらも膵島細胞機能障害と関連しています^5,6,7。したがって、膵島ホルモン分泌を媒介する細胞内シグナル伝達経路の解明は、膵島における生理的・病態学的メカニズムの理解に不可欠です。

小島の球状構造は、実験に一定の障害をもたらします。これらの課題には、膵島サイズのばらつきや、膵島コア内のウイルス形質導入を減少させる膵島の3D特性が含まれる^8,9

プロトコル

ヒト膵島(N = 4製剤)は、Integrated Islet Distribution Program、Human Pancreas Analysis Program、Prodo Laboratories, Inc.、およびImagine Pharmaとのパートナーシップを通じて入手しました。ヴァンダービルト大学の治験審査委員会は、匿名化されたヒト膵臓標本をヒト被験者の研究とは見なしません。この活動は、臓器提供者やその家族、臓器調達団体の協力なくしては成り立ちません。ドナーの人口統計情報については、 表1 を参照してください。糖尿病のない膵臓ドナーからのヒト膵島は、15時間未満の寒冷虚血時間で単離されました。

1. 偽膵島形成(詳細はWalker et al.⁷)

1. 膵島培養培地の外側の表面でピペットチップを汚染しないように細心の注意を払いながら、P200ピペットと卓上顕微鏡を使用して初代ヒト膵島を採取し、手摘みします(CMRL 1066中の10%FBS、100 μg/mLストレプトマイシン、100 U/mLペニシリン、2 mM L-グルタミン)。
2. 初代膵島を15 mLチューブに移し、コンタミネーションを防ぐために組織培養フードの下で以下の偽膵島形成ステップをすべて実行します。0.025%....

ディスカッション

微小周融合システム、バイオセンサー発現偽島、レーザー走査型共焦点顕微鏡の統合により、細胞内シグナル伝達イベントと動的ホルモン分泌プロファイルの同期評価が可能になります。動的微小周輸システムは、一連の明確に定義された刺激を偽膵島に送達することができ、市販のELISAによってインスリンおよびグルカゴン濃度を測定できる廃液の収集を可能にする。同時に、共焦点顕微?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ad-CMV-cADDis	Welgen	Not applicable
0.01” FEP tubing	IDEX	1527L
1 M HEPES	Gibco	15630-080	Enriched-CMRL Media Component
1.5 mL and conical tubes	Any	Any
10 μm PTFE filter	Cole-Parmer	SK-21940-41	Change every 8-10 runs
100 mM Sodium Pyruvate	Thermo Scientific	11360070	Enriched-CMRL Media Component
190 proof Ethanol	Decon labs	2816	Acid Ethanol Component
200 mM GlutaMAX-I Supplement	Gibco	35050061	Enriched-CMRL Media Component
Ascorbate	Sigma	A5960	DMEM Perifusion Buffer Component
Bovine Serum Albumin	Sigma	A7888	DMEM Perifusion Buffer Component
Bubble trap	Omnifit	006BT
CellCarrier ULA 96-well Microplates	Perkin Elmer	6055330
cellSens analysis software	Olympus	v3.1	Software used for data analysis
CMRL 1066	MediaTech	15-110-CV	Enriched-CMRL Media Component
Conical adapter (IDEX, P-794)	IDEX	P-794
D-(+)-Glucose	Sigma	G7528	Glucose Buffer Component
DMEM	Sigma	D5030	DMEM Perifusion Buffer Component
Environmental chamber	okolab	IX83
Epinepherine (Epi)	Sigma	E4250	Stimulation Buffer Component
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated	Sigma	12306C	Enriched-CMRL Media Component
Glucagon ELISA	Mercodia	10-1281-01
Glucagon Kit HTRF	Cisbio	62CGLPEH
HCl (12N)	Any	Any	Acid Ethanol Component
HEPES	Sigma	H7523	DMEM Perifusion Buffer Component
iCell Endothelial Cells Medium Supplement	Cell Dynamics	M1019	iEC Media Component
Idex Derlin nut & ferrule 1/4-24	Cole-Parmer	EW-00414-LW
Insulin ELISA	Mercodia	10-1113-01
Isobutylmethylonine (IBMX)	Sigma	I5879	Stimulation Buffer Component
Laser scanning confocal microscope	Olympus	FV3000
L-Glutamine	Sigma	G8540	DMEM Perifusion Buffer Component
Microchip (University of Miami, FP-3W)	University of Miami	FP-3W
Microchip holder	Micronit Microfluidics	FC_PRO_CH4525
Model 2110 Fraction Collector	Biorad	7318122
P10, P200, and P1000 pipets and tips	Any	Any
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140-122	Enriched-CMRL Media Component
Peristaltic pump	Instech	P720
Phosphate Buffered Saline	Gibco	14190-144	Wash Islets
Sarstedt dishes	Sarstedt	depends on dish diameter
Sodium Bicarbonate	Sigma	S6014	DMEM Perifusion Buffer Component
Sodium Pyruvate	Sigma	P2256	DMEM Perifusion Buffer Component
Stereoscope	Olympus	SZX12
Steriflip Filter (0.22 μm)	Millipore	SCGP00525	Filter all buffers twice
VascuLife VEGF Medium Complete Kit	LifeLine Cell Technology	LL-0003	iEC Media Component