脂肪由来間葉系間質細胞を初代混合グリアと共培養したプリオン誘発性炎症の軽減

要約

脂肪由来間葉系間質細胞(AdMSC)は、炎症に関連する疾患の治療に有用な強力な免疫調節特性を持っています。マウスのAdMSCと一次混合グリアの単離と培養、AdMSCの刺激による抗炎症遺伝子と成長因子のアップレギュレーション、AdMSCの遊走の評価、およびAdMSCと一次混合プリオン感染グリアとの共培養方法を示します。

要約

間葉系間質細胞(MSC)は、抗炎症性サイトカイン、ケモカイン、および成長因子の産生を通じて炎症を強力に調節します。これらの細胞は、プリオン病やその他のタンパク質のミスフォールディング障害などの神経変性疾患の状況で神経炎症を調節する能力を示しています。プリオン病は、散発性、後天性、または遺伝性の場合があります。これらは、脳内のプリオンタンパク質のミスフォールディングと凝集に起因する可能性があります。これらの病気は常に致命的であり、利用可能な治療法はありません。

疾患の最も初期の兆候の1つは、アストロサイトとミクログリアの活性化とそれに伴う炎症であり、これは検出可能なプリオン凝集とニューロンの喪失の前に発生します。したがって、MSCの抗炎症および調節特性は、プリオン病のアストログリオーシスを治療するために収穫することができます。最近、BV2細胞または初代混合グリアと共培養した脂肪由来MSC(AdMSC)が、パラクリンシグナル伝達を通じてプリオン誘発性炎症を軽減することを示しました。この論文では、プリオン誘発性炎症を減少させるために刺激されたAdMSCを使用した信頼性の高い治療法について説明しています。

AdMSCのヘテロ接合集団は、マウス脂肪組織から容易に単離し、培養中に拡大することができます。これらの細胞を炎症性サイトカインで刺激すると、プリオンに感染した脳のホモジネートに向かって移動する能力と、それに反応して抗炎症モジュレーターを産生する能力が向上します。これらの技術を組み合わせることで、プリオン感染に対するMSCの治療可能性を調査することができ、他のタンパク質のミスフォールディングや神経炎症性疾患にも適応させることができます。

概要

グリア炎症は、パーキンソン病、アルツハイマー病、プリオン病など、さまざまな神経変性疾患で重要な役割を果たしています。異常なタンパク質凝集は、疾患の病因や神経変性の多くに起因していますが、グリア細胞もこの^1,2,3を悪化させる役割を果たしています。したがって、グリア誘発性炎症を標的とすることは有望な治療アプローチです。プリオン病では、細胞のプリオンタンパク質(PrP^C)が疾患関連プリオンタンパク質(PrP^Sc)に誤ってフォールドし、オリゴマーを形成して凝集し、脳内の恒常性を破壊する^4,5,6。

プリオン病の最も初期の徴候の1つは、アストロサイトとミクログリアからの炎症反応です。ミクログリアの除去またはアストロサイトの改変によってこの応答を抑制した研究では、一般に、^{動物モデル7,8,9}の疾患病因の改善または悪化は示されていません。グリアの炎症を排除せずに調節することは、治療薬として興味深い代替手段です。

間葉系間質細胞(MSC)は、パラクリン方式で炎症を調節する能力があるため、さまざまな炎症性疾患の治療薬として登場しています^10,11。彼らは、抗炎症分子、成長因子、マイクロRNAなどを分泌することにより、炎症部位に移動し、これらの環境でシグナル伝達分子に応答する能力を示しました10,12,13。私たちはこれまでに、脂肪組織に由来するMSC(AdMSCと表記)がプリオン感染脳ホモジネートに向かって移動し、抗炎症性サイトカインと成長因子の遺伝子発現をアップレギュレーションすることにより、この脳ホモジネートに応答できることを実証しました。

さらに、AdMSCは、BV2ミクログリアと一次混合グリアの両方において、Nuclear Factor-kappa B(NF-κB)、Nod様受容体ファミリーのピリンドメインを含む3(NLRP3)インフラマソームシグナル伝達、およびグリア活性化に関連する遺伝子の発現を減少させる可能性があります ¹⁴。ここでは、マウスからAdMSCと一次混合グリアの両方を単離する方法、AdMSCを刺激して調節遺伝子をアップレギュレーションする方法、AdMSC遊走を評価する方法、およびプリオン感染グリアとAdMSCを共培養する方法に関するプロトコルを提供します。これらの手順が、神経変性疾患やその他の疾患におけるグリア誘発性炎症の調節におけるMSCの役割をさらに研究するための基盤を提供できることを願っています。

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プロトコル

マウスは、コロラド州立大学のInstitutional Animal Care and Use Committeeによって承認されたプロトコル#1138に従って、Association for Assessment and Accreditation of Lab Animal Care Internationalによって認定されたコロラド州のLab Animal Resourcesで飼育および維持されました。

1. プリオンによる一次皮質混合グリアの単離と感染

1. アストロサイトとミクログリアの両方を含む初代混合グリアを単離するには、生後0〜2日齢のC57Bl/6マウスの子犬を採取します。
   注:このプロトコルは、以前のプロトコル^15,16から適応されています。
2. 子犬を一度に1匹ずつ安楽死させ、斬首して脳を取り出し、小脳と脳幹を分離して廃棄します。
   1. 2x ペニシリン/ストレプトマイシン/ネオマイシン (PSN) を含む冷たい MEM/EBSS を含む 3 cm のシャーレに脳を置きます。解剖スコープの下で、脳半球を分離し、中脳を取り外して廃棄します。皮質から海馬と髄膜を取り出して廃棄します。
   2. 両方の皮質半球を5mLのMEM/EBSS + 2x PSNを含む50mLの円錐形チューブに入れ、氷の上に置きます。
3. 組織培養フードで、ピペットで穏やかに吸引することにより、50 mLのコニカルチューブから培地を取り出し、皮質組織片をチューブの底に残します。コーティングされたガラスピペットで、10 mLの予熱解離培地を加え、ガラスピペットで組織を10〜20倍に粉砕します。
4. 懸濁液を小さな攪拌子が入った50 mLビーカーに移し、最低設定の約30 rpmで攪拌板に10分間置きます。ビーカーを攪拌板から取り外し、30°の角度で3分間セットして、組織が底に落ち着くようにします。細胞懸濁液(上清)を取り除き、氷上の新しい50 mLコニカルチューブに移します。
5. DNase-I(4,000 U/mL)を10 mLの解離培地に添加し、組織を再懸濁してさらに10分間撹拌します。新鮮な解離培地(DNase-Iなし)を2〜4回追加し(マウスの子犬2匹につき1回)、ビーカーの底に線維組織のみが残るまで、細胞懸濁液を氷上の50 mLコニカルチューブに移すことで繰り返します。
6. コニカルチューブ内の細胞懸濁液を1,000 × g 、4°Cで10分間遠心分離します。 上清を吸引し、グリア増殖培地と交換します。血球計算盤で細胞をカウントし、細胞培養処理皿を10⁶ in 10 cmの密度で細胞をプレート化します。5% CO₂ を含む 37 °C のインキュベーターに入れます。
7. 24時間後、メディアを取り外し、新しいグリアメディアと交換します。細胞が2週間以内に100%のコンフルエンスに達するようにします。次に、実験のためにそれらを分割してプレートします。
8. in vitroプリオン感染の場合、6ウェルプレートで1ウェルあたり100,000細胞でグリアをプレート化し、80%〜100%のコンフルエンスに達するようにします。プリオンと正常の両方の脳ホモジネートをPBSで20%に希釈し、細胞培養に添加する前に30分間UV光にさらします。グリアから感染する培地を吸引し、各ウェルに、最終容量が0.1%の正常またはプリオン脳ホモジネートを含むグリア増殖培地1.5〜2mLを添加します。
9. 72時間後、培地を吸引し、細胞をPBSで洗浄して、残っている脳のホモジネートを除去します。新鮮なグリア増殖培地(脳のホモジネートを含まない)と交換してください。
10. AdMSC細胞を単離するには、血清学的ピペットを使用し、脂肪組織を~1mLのHBSS/トリプシン溶液とともに穏やかに吸引します。200 U/mL DNase-Iおよび400 U/mLコラゲナーゼ/ディスパーゼ混合物を含む2 mLのDMEM/F12培地を含む4 cmシャーレに移します。小さなハサミで脂肪組織の塊を小片(サイズ5mm未満)に切り、37°Cで1.5時間インキュベートします。
11. ペトリ皿の内容物を血清学的ピペットで50mLの円錐管に移し、ピペットで混合物を~10倍に粉砕します。組織が簡単にバラバラになり、比較的均質な混合物を形成することを確認してください。混合物を4°Cで5分間、1,000 × g で遠心分離し、間質血管画分をペレット化します。これは赤色に見えます。
12. 上清を慎重に吸引し、ペレットを予熱した滅菌PBS5 mLで洗浄し、4°C、1,000 × g で3分間遠心分離します。上清を吸引し、ペレットを1 mLのAdMSC培地(L-グルタミンを含み、15%熱不活化ウシ胎児血清(hiFBS)、1%アミノ酸、1%非必須アミノ酸、および1%PSNを補給した低グルコースDMEM)に再懸濁します。
13. 新鮮な滅菌済みの50 mLコニカルチューブの上に40 μmのセルストレーナーを置き、ストレーナーを介して細胞懸濁液をピペットで動かして、解離していない組織をすべて取り除きます。10 cmの細胞培養処理済みディッシュに9 mLのAdMSC培地を加え、濾した細胞懸濁液をディッシュにピペットで移します。5% CO₂ を含む 37 °C のインキュベーターに入れます。
14. 翌日、新しいAdMSCメディアを取り外して交換します。細胞が72時間から96時間の間に継代する準備が整うときに、細胞が80〜90%コンフルエントになるのを待ちます。
15. 上記のようにAdMSCを単離し、2回通過させて一貫した均質な集団 ^を得る14。滅菌PBSで細胞を2回洗浄し、予熱したトリプシン(0.25%)を各プレートに2mLをピペットで移します。細胞を37°Cで5分間、またはプレートから完全に外れるまでインキュベートします。予熱したAdMSC培地8 mLを各プレートに加え、ピペットで細胞懸濁液を混合し、コニカルチューブに移し、4°Cで1,000 × g で遠心分離してペレット化します。
16. AdMSCを3〜10 mLの培地に再懸濁し(使用するプレートの数によって異なります)、血球計算盤を使用して細胞をカウントします。100,000細胞/ウェルをAdMSC培地を含む6ウェルプレートにプレートします。37°Cのインキュベーターに5%_CO2 を入れて一晩置く。
17. 翌日、サイトカインまたは脳のホモジネートで細胞を刺激します。
    1. サイトカイン刺激細胞の場合は、10 ng/mL TNFαまたは200 ng/mL IFNγのいずれかを含むAdMSC培地を調製します。コントロールウェルには新鮮なメディアを使用してください。
    2. プリオン感染脳ホモジネート治療には、末期感染したプリオンマウス(22LまたはRML株)から20%脳ホモジネート(PBS中)を採取します。AdMSC培地を最終濃度0.1%のプリオン感染または正常な脳のホモジネートでコントロールします。
    3. ウェルから培地を吸引し、1.5 mLのサイトカインまたは脳ホモジネート含有培地を対応するウェルにピペットで移します。トリプリケートで実行します。プレートをインキュベーターに戻します。
18. 培地を取り出し、予熱したPBSで細胞を2回洗浄し、1% βMEを含む350 mLの溶解バッファーを各ウェルに添加してRNAを単離し、セルリフターを使用して細胞ライセートを除去します。ミニキットメーカーのプロトコールに従って、DNase消化ステップを含むRNA単離を行います。RT-qPCRでは、サンプルあたり25 ngのRNAを逆転写し、SYBR Greenおよび各遺伝子のプライマーを使用してcDNAを10 mMで増幅します。^2-ΔΔCT法を用いてmRNA発現を解析し、参照遺伝子β-アクチン¹⁷の発現に正規化します。
    注:すべてのRT-PCRはMIQEガイドラインに従って行われました。
19. BV2ミクログリアをウェルあたり50,000細胞でプレートするか、1ウェルあたり100,000細胞の一次混合グリアを6ウェルプレートでプレートします。翌日、BV2細胞を0.1%のプリオン感染または正常な脳ホモジネートを含む培地で処理します。混合グリアの場合は、細胞が80〜90%コンフルエントになるまで待ってから、脳のホモジネートに感染します。
20. 脳ホモジネートを含む培地で細胞を72時間インキュベートします。細胞をPBSで2回洗浄して、残りの脳のホモジネートを除去し、新しい培地を加えてインキュベーターに戻します。
21. 共培養のために、継代3でAdMSCを使用します。AdMSCを刺激する場合は、10 ng/mLのTNFαを含む培地を使用し、BV2または混合グリアと共培養する前に24時間処理してください。刺激されたAdMSCをPBSで3回洗浄し、残っているTNFαを除去します。
22. ステップ 1.15 で説明したように AdMSC をトリプシン処理し、AdMSC 培地に再懸濁します。
23. AdMSC懸濁液を1,000 × g 、4°Cで5分間遠心します。この間に、BV2細胞または混合グリア上の培地をAdMSC培地のウェルあたり2 mLと交換し、孔径が0.4マイクロメートルの6ウェルプレート用のインサートをウェルの半分に配置します。各インサートに 2 mL の AdMSC 培地を添加し、インサートを受け取らないウェルに 2 mL の培地を追加で追加します。
24. AdMSCのペレット化が終了したら、ペレットをAdMSC培地に再懸濁します。血球計算盤でAdMSCをカウントし、各インサートに50,000〜100,000個の細胞を追加します。
25. BV2細胞の場合、共培養物を24時間インキュベートします。混合グリアの場合は、最短で24時間、最長で7日間インキュベートします。
26. AdMSCと所望の時間インキュベートした後、インサートを取り出して廃棄するか、新しい6ウェルプレートに入れ、インサートをPBSで2回洗浄し、RNA分離キットで提供されたバッファーを混合グリアまたはBV2細胞に加え、インサートをスクレイピングしてAdMSC RNAを分析します。
27. 2番切路でAdMSCを10 ng/mL TNFαを含む培地で処理します。翌日、予熱した滅菌PBS 3xで細胞を洗浄し、無血清AdMSC培地で4時間インキュベートします。
28. 遊走性細胞アッセイを行うには、インサートあたり25,000個のAdMSCを添加し、細胞を37°Cで24時間インキュベートします。 この間、遊走細胞はインサートの上部チャンバーから移動し、インサートの下側に付着します。ウェルとインサートの両方の内容物を慎重に吸引し、PBSで2回洗浄し、各ウェルに1 mLのPBSを残して、インサートが両側で湿ったままになるようにします。
29. 一度に1つずつ、鉗子を使用してインサートを取り外し、綿棒で上部チャンバーを優しく、しかし完全に拭いて、移行していない細胞を取り除きます。残りのPBSを吸引し、500 μLのクリスタルバイオレット溶液をインサートのウェルチャンバーと上部チャンバーの両方にピペットで移し、インサートメンブレンが完全に沈んでいることを確認します。
30. インサートをクリスタルバイオレット溶液中で室温で1時間インキュベートします。色を最適に保持するには、一度に1つのインサートのみを使用して、次の手順をすばやく実行します。
    1. インサートのウェルと上部チャンバーからクリスタルバイオレット溶液を吸引し、PBSで3回洗浄します。上部チャンバーを綿棒で再度拭きます。
    2. 1 mLのPBSを含む新しい24ウェルプレートのウェルにインサートを置きます。カメラを取り付けた倒立顕微鏡の上にプレートを置きます。10x対物レンズを使用して、インサートの底面のみに焦点を合わせ、インサートの中心に向かって4つのランダムな領域の画像を撮ります。
31. これを各ウェルで行った後、任意の画像処理ソフトウェアに画像をアップロードし、背景を調整して紫色に染色した細胞とのコントラストを高めます。セルカウンターを使用して手動でセルをカウントします。

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結果

TNFαまたはインターフェロン-γ(IFNγ)でAdMSCを24時間刺激すると、抗炎症分子と成長因子の発現に変化が誘導されます。AdMSCをTNFαまたはインターフェロンγ(IFNγ)で処理すると、TNF刺激遺伝子6(TSG-6)mRNAが増加しますが、TNFαはIFNγではなく、トランスフォーミング成長因子β-1(TGFβ-1)mRNAが増加します。TNFαまたはIFNγによる刺激は、血管内皮増殖因子(VEGF)mRNAの増加を誘導しますが、線維...

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ディスカッション

ここでは、グリア細胞モデルにおけるプリオン誘発性炎症の減少における脂肪由来間葉系間質細胞(AdMSC)の影響を評価するための、信頼性が高く比較的安価なプロトコルを示します。AdMSCは、わずか1週間で簡単に分離および培養して使用できます。このプロトコルは、免疫蛍光およびフローサイトメトリーによって間葉系間質細胞のマーカーと一致するマーカーを発現する細胞の異種集団を一...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin	Cytiva	SH30042.01
5 mL serological pipets	Celltreat	229005B
6-well tissue culture plates	Celltreat	229106
10 cm cell culture dishes	Peak Serum	PS-4002
10 ml serological pipets	Celltreat	229210
15 mL conical tubes	Celltreat	667015B
50 mL conical tubes	Celltreat	667050B
BV2 microglia cell line	AcceGen Biotech	ABC-TC212S
Cell lifter	Biologix Research Company	70-2180
Crystal violet	Electron Microscopy Sciences	12785
Dispase	Thermo Scientific	17105041
DMEM/F12	Caisson Labs	DFL14-500ML
DNase-I	Sigma Aldrich	11284932001
Essential amino acids	Thermo Scientific	11130051
Ethanol (100%)	EMD Millipore	EX0276-1
Fetal bovine serum (heat inactivated)	Peak Serum	PS-FB4	Can be purchased as heat inactivated or inactivated in the laboratory
Formaldehyde	EMD Millipore	1.04003.1000
Glass 10 mL serological pipet	Corning	7077-10N
Hank’s Balances Salt Solution	Sigma Aldrich	H8264-500ML
Hemocytometer/Neubauer Chamber	Daigger	HU-3100
High Glucose DMEM	Cytiva	SH30022.01
low glucose DMEM containing L-glutamine	Cytiva	SH30021.01
MEM/EBSS	Cytiva	SH30024.FS
non-essential amino acids	Sigma-Aldrich	M7145-100M
Paraformaldehyde (16%)	MP Biomedicals	219998320
Penicillin/streptomycin/neomycin	Sigma-Aldrich	P4083-100ML
Phosphate buffered saline	Cytiva	SH30256.01
Recombinant Mouse IFN-gamma Protein	R&D Systems	485-MI
Recombinant Mouse TNF-alpha (aa 80-235) Protein, CF	R&D Systems	410-MT
RNeasy mini kit	Qiagen	74104
Sigmacote	Sigma Aldrich	SL2-100ML	Coat inside of glass pipets by aspirating up and down twice in Sigmacote and allowing to dry thoroughly. Wrap in aluminum foil and autoclave pipets 24 h later.
Stemxyme	Worthington Biochemical Corporation	LS004106	Collagenase/Dispase mixture
Sterile, individually wrapped cotton swab	Puritan Medical	25-8061WC
Thincert Tissue Culture Inserts, 24 well, Pore Size=8 µm	Greiner Bio-One	662638
Thincert Tissue Culture Inserts, 6 well, Pore Size=0.4 µm	Greiner Bio-One	657641