液体クロマトグラフィー、トラップ型イオンモビリティー分光分析、飛行時間型質量分析を用いたヒストン修飾スクリーニング(英語)

要約

液体クロマトグラフィー、トラップ型イオンモビリティー分光、飛行時間型質量分析(LC-TIMS-ToF MS/MS)に基づく分析ワークフローにより、主要パラメーター(保持時間[RT]、衝突断面積[CCS]、正確な質量電荷比[m/z])に基づくヒストン修飾および同定の高信頼性で再現性の高い「ボトムアップ」分析を実現します。

要約

ヒストンタンパク質は真核生物に豊富に存在し、保存されており、翻訳後修飾(PTM)として知られる構造の結果として、遺伝子制御に大きな役割を果たしています。外的要因または遺伝的要因を参照して、各PTMの位置と性質またはPTMのパターンを特定することで、この情報をDNA転写、複製、修復などの生物学的応答と統計的に相関させることができます。本研究では、生体試料からヒストンPTMを検出するためのハイスループット分析プロトコルについて説明します。相補的な液体クロマトグラフィー、トラップドイオンモビリティースペクトロメトリー、飛行時間型質量分析(LC-TIMS-ToF MS/MS)を使用することで、1 回の分析で最も生物学的に関連性の高い修飾を分離し、PTM に割り当てることができます。説明されているアプローチは、モビリティトラップでの並列蓄積とそれに続く連続的なフラグメンテーションと衝突による解離を使用した依存データ収集(DDA)の最近の開発を利用しています。Histone PTMは、保持時間、移動度、フラグメンテーションパターンに基づいて確実に割り当てられます。

概要

真核細胞では、DNAはクロマチンとしてヌクレオソームと呼ばれる機能単位にパッケージ化されています。これらのユニットは、4つのコアヒストン(H2A、H2B、H3、H4の各2つ)の八量体で構成されています1,2,3,4。ヒストンは、真核生物の中で最も豊富で保存性の高いタンパク質の一つであり、遺伝子調節に大きく関与しています⁵。ヒストンの翻訳後修飾(PTM)は、クロマチン動態の調節に大きな役割を果たし、DNAの転写、複製、修復などのさまざまな生物学的プロセスに関与しています⁶。PTMは、^主にDNAと接触しているヒストンのN末端領域のアクセス可能な表面に発生します^3,7。しかし、尾部とコアの修飾はクロマチン構造に影響を与え、ヌクレオソーム間の相互作用を変化させ、特定のタンパク質を動員します^3,8。

液体ク....

プロトコル

注:ヒストンサンプルは、Bhanu et al.(2020)¹²から採用された方法を使用して抽出されました。

1. サンプル調製

1. 培養細胞の回収
   1. 細胞が80%コンフルエントになったら、トリパンブルー排除法を用いて細胞が生存可能であることを確認します。
      注:これらの実験にはHeLa S3細胞株を使用しましたが、この方法はあらゆる培養細胞に適用できます。
   2. 培地を吸引し、5 mL の 1x リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を各プレートに塗布します。
   3. プレートを回転させて残留培地をすべて洗浄し、PBSを吸引し、5 mLの1x PBSを塗布します。
   4. 使い捨てのセルリフターで細胞をこすり落として、プレートから細胞を静かに分離します。
   5. 各細胞懸濁液を15 mLのコニカルチューブに移します。
   6. 800 x g で5分間遠心分離して細胞をペレット化します。
   7. 細胞ペレットからPBSを吸引します。
   8. ヒストン抽出に進みます。
      注:セルペレットがすぐに処理できない場合は、液体窒素で急速凍結してください。準備が整うまで、ペレットを-80°Cで保存します。
2. ヒストン抽出<....

ディスカッション

ヒストンは、4つのコアヒストン(H2A、H2B、H3、H4の各2つ)からなる八量体の形でDNAと相互作用することにより、クロマチン構造を調節する基本的なタンパク質です²⁰。ヒストンには多数のリジン残基とアルギニン残基が含まれており、これらは容易に修飾され、ヒストン機能に影響を与えたり、他の細胞タンパク質に結合したりしてクロマチンの化学的性質を変化させる広範な.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
-80 °C Freezer
1x Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	10010023	Animal Origin-Free
1 mL Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	94060710	Finntip Flex 1000 μL, nonsterile, nonfiltered, racked tips
1.5 mL Microcentrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	14-282-300	Use these tubes for the simple and safe processing of sample volumes up to 1.5 mL
10 µL Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	94060100	Finntip Flex, 10 μL, nonsterile, non-filtered, racked
10% NP-40	Thermo Fisher Scientific	28324	NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution
10x Dulbecco’s PBS without Ca2+/Mg2+	(Mediatech)	MT21031CM
15 mL Conical Tubes	Corning	352196	Falcon Conical Centrifuge Tubes
200 µL Gel-Loading Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	02-707-138	Fisherbrand Gel-Loading Tips, 1–200 μL
200 µL Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	94060310	Finntip Flex 200μL, nonsterile, nonfiltered, racked tips
2x Laemmli Sample Buffer	Bio-Rad	1610737	Premixed protein sample buffer for SDS-PAGE
50 mL Conical Tubes	Corning	352070	Falcon Conical Centrifuge Tubes
96-well flat bottom plate	Thermo Fisher Scientific	12565501
96-well plate, V-Bottom 600 μL	Axygen	P-DW-500-C-S
Acetone	Sigma Aldrich	179124	ACS reagent, ≥99.5%
Acetonitrile (ACN)	Thermo Fisher Scientific	A998	HPLC, Fisher Chemical
Acetonitrile with 0.1% Formic acid (v/v), LC/MS Grade	Thermo Fisher Scientific	LS120	Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific
AEBSF	Thermo Fisher Scientific	328110500	AEBSF hydrochloride, 98%
Ammonium bicarbonate, NH4HCO3	Sigma Aldrich	09830	BioUltra, ≥99.5% (T)
Ammonium hydroxide solution, NH4OH	Sigma Aldrich	AX1303	Meets ACS Specifications, Meets Reagent Specifications for testing USP/NF monographs GR ACS
Argon (Ar)	Airgas	AR HP 300
BEH C18 HPLC column	Waters	186003625	XBridge Peptide BEH C18 Column, 300 Å, 5 µm, 4.6 mm X 250 mm, 1K–15K
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A7906	Heat shock fraction, pH 7, ≥98%
Calcium chloride, CaCl2	Sigma Aldrich	C4901	Anhydrous, powder, ≥97%
Cell dissociation buffer	Thermo Fisher Scientific	13151014
Ceramic scoring wafer	Restek	20116
Compass DataAnalysis 6.0	Bruker Datonics
Compass HyStar 6.2	Bruker Daltonics
Compass IsotopePattern	Bruker Daltonics
Compass timsControl 4.1	Bruker Daltonics
Coomassie Brilliant Blue R-250	Bio-Rad	1610436
Deep Well, 96-Well Microplate, 2.0 mL	Thermo Fisher Scientific	89237526
Disposable Cell Lifters	Thermo Fisher Scientific	08100240	Fisherbrand Cell Lifters; Disposable lifters quickly remove cell layers
Disposable Pellet Pestles	Thermo Fisher Scientific	12-141-363	Fisherbrand Pellet Pestles; Resuspend protein and DNA pellets or grind soft tissue in microcentrifuge tubes
Dithiothreitol (DTT)	Thermo Fisher Scientific	P2325	1 M
Formic acid (FA)	Sigma Aldrich	695076	ACS reagent, ≥96%
Fused silica capillary 75 μm ID x 363 μm OD	(Molex (Polymicro)	TSP075375
Glacial Acetic Acid	Thermo Fisher Scientific	A38S	Acetic Acid, Glacial (Certified ACS), Fisher Chemical
Glass Pasteur Pipettes	Sigma Aldrich	BR747725-1000EA
High-Performance Liquid Chromatograph	Shimadzu		Shimadzu Prominence 20 HPLC UFLC System
Hydrochloric acid, HCl	Sigma Aldrich	258148	ACS reagent, 37%
Hypercarb 30-40 μm Carbon 150–300 Å	Thermo Fisher Scientific	60106-402
Hypersep cartridge	Thermo Fisher Scientific	60109-404
LC/MS Calibration Standard, for ESI-ToF	Agilent	G1969-85000	TuningMix
Magnesium chloride, MgCl2	Sigma Aldrich	M8266	Anhydrous, ≥98%
Methanol, for HPLC	Thermo Fisher Scientific	A454	Optima for HPLC, Fisher Chemical
Microcentrifuge Tube Adapters	GL Sciences	501021514
Microcystin	Thermo Fisher Scientific	50-200-8727	Enzo Life Sciences Microcystin-LA
MS sample vial, LaPhaPack, Snap, 12 mm x 32 mm	LEAP PAL Parts	LAP.11190933
Nanodrop	Thermo Fisher Scientific	model: ND3300
Nitrogen (N2)	Airgas	NI UHP300
PEAKS Studio X+	Bioinformatic Solutions
pH indicator strips, Instachek	Micro Essential Lab	JR-113	Model: Hydrion
Potassium chloride, KCl	Sigma Aldrich	P3911	ACS reagent, 99.0%–100.5%
Pressure Injection Cell	Next Advance	model: PC77
Propionic Anhydride	Sigma Aldrich	8.00608	For synthesis
Refrigerated Centrifuge (700–18,000 x g)	NuAire, model: Nuwind	NU-C200V
Reprosil-Pur 120 C18-AQ 3 μm, 3 g	ESI Source Solutions	r13.aq.0003
SDS-PAGE Gels	Bio-Rad	4569035	Any kD precast polyacrylamide gel, 8.6 cm × 6.7 cm (W × L), for use with Mini-PROTEAN Electrophoresis Cells
Sodium butyrate	Thermo Fisher Scientific	A11079.06	98+%
Sodium chloride, NaCl	Sigma Aldrich	S9888	ACS reagent, ≥99.0%
SPE disk, C18	VWR	76333-134	Empore SPE disk, C18, CDS Analytical, 90 mm x 0.5 mm, 12 µm
SpeedVac+ vacuum pump and plate rotor	Savant	model: SC210A
Sucrose	Millipore	1.07651	suitable for microbiology
Sulfuric acid, H2SO4	Sigma Aldrich	339741	99.999%
TIMS-ToF Mass Spectrometer	Bruker Daltonics		model Tims tof ms
Trichloroacetic acid solution, TCA	Sigma Aldrich	T0699	6.1 N
Trifluoroacetic acid (TFA)	Sigma Aldrich	302031	Suitable for HPLC, ≥99.0%
Triversa Nanomate	Advion	model: TR263
TrypsinProtease, MS Grade	Thermo Fisher Scientific	90057
Tube rotator	Thermo Fisher Scientific	88881001
Vortex Mixer	Thermo Fisher Scientific	88880017
Water with 0.1% Formic acid (v/v), LC/MS Grade	Thermo Fisher Scientific	LS118	Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific