神経損傷のあるラットの痛みの特徴 1回のTuina介入後24時間以内の変化

要約

私たちは、tuina manipulation simulatorを使用して、軽度の慢性狭窄損傷ラットに対して「Three-Manipulation and Three-Acupoint」tuina療法を実施し、行動分析による痛みの変化と酵素結合免疫吸着アッセイを使用した炎症因子発現の変化をテストすることにより、tuinaの効果的な鎮痛時間ポイントを24時間以内に評価するプロトコルを提示します。

要約

Tuinaは、伝統的な中国医学の外部治療法として、臨床および基礎研究で末梢神経障害性疼痛(pNP)に対する鎮痛効果があることが証明されています。ただし、tuina の鎮痛効果の最適な時点は、さまざまな損傷感覚によって異なる場合があり、tuina 鎮痛の開始メカニズムの探索に影響を与えます。

この研究では、軽度の慢性狭窄損傷(マイナーCCI)モデルラットを使用してpNPをシミュレートし、インテリジェントチュイナマニピュレーションシミュレーターを使用して、トゥイナ療法を実施するための3つの方法(ポイントプレス、摘採、混練)と3つのツボ(Yinmen BL37、Chengshan BL57、Yanglingquan GB34)をシミュレートしました。この研究では、寒冷感閾値 (CST)、機械的離脱閾値 (MWT)、および熱離脱潜時 (TWL) をテストすることにより、マイナーな CCI モデルを持つラットの tuina 鎮痛薬の有効性の 24 時間以内の痛みの変化と最適な時点を評価しました。さらに、この研究では、Elisa検出を通じてIL-10およびTNF-α発現の変化を評価しました。その結果、トゥイナには即効性と持続性の両方の鎮痛効果があることが示されました。CST、MWT、TWL の 3 つの異なる損傷感受性閾値、および IL-10 と TNF-α の 2 つのサイトカインでは、介入後 24 時間以内の tuina の鎮痛効果は、異なる時点で有意に異なります。

概要

末梢神経障害性疼痛(pNP)とは、末梢体性感覚神経系の病変または疾患によって引き起こされる疼痛を指し、一連の症状および徴候として現れ、痛覚過敏を^{主な症状の}1つとして表します^1,2。痛覚過敏は、ピン刺し、寒さ^{、熱などの}有害な刺激によって引き起こされる痛みの高まる経験です3。大規模な疫学研究が実施されており、pNP が最も一般的であり、神経因性疼痛の有病率は 6.9% から 10% であることが示されています⁴。pNPは、神経の損傷、帯状疱疹後神経痛、痛みを伴う糖尿病性多発ニューロパチー、多発性硬化症、脳卒中、がんなど、複数の疾患によって引き起こされる^{可能性があります5。}今日、pNPを治療するための主な方法は薬物療法ですが、その効果は理想的ではありません。そして、副作用は重大であり、それが個人と社会に高い経済的負担がかかる主な理由です⁶。

Tuinaは、環境に優しく、経済的で、安全で、効果的な伝統的な中国医学の外用方法です⁷。多くの臨床研究で、pNPに対するtuinaの鎮痛効果が証明されており、基礎研究では^tuinaの即時および累積的な鎮痛効果が確認されています^8,9。tuinaの主な累積鎮痛メカニズムは、炎症性因子のレベルを低下させ、グリア細胞の活性化を阻害することです^10,11。以前の研究では、tuinaの累積鎮痛効果を確認し、tuina治療の20回後に坐骨神経損傷を受けたラットの後根神経節(DRG)と脊髄後角(SDH)に差次的に発現する遺伝子(DEG)を見つけました、主にタンパク質結合、圧力応答、およびニューロンの投射^{に関連しています12}。最近の研究では、tuinaには即時の鎮痛効果があり、1回のtuina介入により、マイナーなCCIラットの痛覚過敏が緩和され、特に熱痛覚過敏がより効果的に緩和されることが確認されています¹³。ただし、トゥイナの鎮痛効果の最適な時点は、損傷感(寒さ、暑さ、機械的)によって異なる場合があり、チュイナ鎮痛の開始メカニズムの探索に影響を与えます。

炎症性メディエーターは、疼痛受容体を感作および活性化し、排出閾値および異所性排出の低下をもたらし、それによって末梢感作^14,15に寄与する。末梢神経損傷後、TNF-αは炎症反応の開始剤であり、IL-10やIL-1βなどの炎症性因子の合成を促進し、直接的な組織炎症性損傷を引き起こし、局所神経終末を刺激し、痛みを引き起こします16,17,18。Tuinaは、TNF-α、IL-10、IL-6、IL-1βなどの炎症性因子の発現を減らすことにより、鎮痛効果を達成できます19,20,21。この研究では、臨床 pNP をシミュレートするためにマイナーな CCI モデル ラットを選択し、寒冷感閾値 (CST)、機械的離脱閾値 (MWT)、熱離脱潜時 (TWL) による 1 回の tuina 介入後の寒冷、熱、および機械的刺激の痛みの行動試験のさまざまな時点を選択し、酵素結合免疫吸着アッセイ (ELISA) により血清中の IL-10 と TNF-αを選択しました。 Tuinaの鎮痛効果が重要である時点を選択するために、後の段階でTuina鎮痛の開始メカニズムの研究の基礎を提供します。

プロトコル

北京中医薬大学の動物保護および使用に関する委員会 (BUCM-4-2022082605-3043) は、この研究で使用されたすべての手順を承認しました。

1. 動物と研究デザイン

1. 8週齢の雄Sprague-Dawley(SD)ラット49匹、体重200±10gを入手します。
2. 乱数表法を用いて、ラットを偽演算群(n = 7)、モデル群(n = 7)、およびtuina群の直後(n = 7)、tuina群の6時間後(n = 7)、tuina群の12時間後(n = 7)、tuina群の18時間後(n = 7)、およびtuina群の24時間後(n = 7)に分けます。

2. マイナーCCIのラットモデルの確立(図1)

注:マイナーCCIをモデル化する方法は、以前の研究22,23,24で説明されているとおりでした。

1. SDラットの適応給餌を7日間許可します。モデリングする前に、ラットを2〜3時間絶食させます。
2. 麻酔器による麻酔のために3〜5%イソフルランで満たされた箱にラットを置きます。麻酔後、両眼に眼用軟膏を塗布して乾燥を防ぎます。
3. ラットをテーブルの上に腹臥位に固定し、右股関節領域の毛皮を剃り、その領域をヨウ素で消毒します(図1B)。
4. つま先をつまんで麻酔の手術面を確認します。坐骨神経の歩行方向に沿って約0.5〜1cmの皮膚切開を行い、筋層を鈍く分離し、梨状筋の下端を完全に露出させます(図1C)。
5. 吸収性クロム腸管縫合糸(4-0タイプ)を神経の周りに緩く結び、神経外血管の血液循環を妨げないようにします。偽群ラットの坐骨神経を結紮せずに3分間さらします(図1A、D、E)。
6. 針のない注射器を使用して、0.9%塩化ナトリウム溶液を1滴坐骨神経に塗布し、リセットします。.層ごとに縫合し、アモキシシリン粉末などの抗炎症薬を適量与え、筋肉層を1針縫合し、皮膚を2針縫合します(図1F)。
   注:ステップ2.3からステップ2.6まで、麻酔を維持するために、ラットの口と鼻に2%〜3%のイソフルランを流し続けます。.
7. ネズミを暖かく保ち、目を覚ますのを待ちます。ネズミを飼育室に戻します。

3. インテリジェント・トゥイナ・マニピュレーション・シミュレータの介入(図2)

注:モデルが確立されてから7^日目 に治療が開始されました。

1. コンピュータ操作インターフェースで、装置パラメータを4Nの刺激力、60回/分の刺激周波数、36°Cの温度に調整します。ラットをラット固定具に入れ、後肢のツボの位置を露出させます(図2A、自社開発機、特許No.ZL 2023 20511277.5)²⁵.
2. 装置をアクティブにして、ポイントプレス、プラック、およびニーディングの方法を実行します(表1)。コンピュータ画面に表示された点押さえ、摘み取り、揉みしだくを、図2B、C)²⁶のモデル側の陰門(BL37)、成山(BL57)、陽陵泉(GB34)の点(表2)の順にクリックします。
   1. トゥイナグループの場合、1日1回、4Nの力、60回/分の頻度、および方法ごとにポイントあたり合計9分の介入を1日1回行います。
   2. simグループとmodelグループをtuinaグループと同じ回数で9分間拘束します。

4. 行動計測

注: 介入後、閾値の寒冷感度閾値 (CST)、機械的撤退閾値 (MWT)、および熱撤退潜時 (TWL) をそれぞれ 5 つの tuina サブグループ、モデル グループ、および偽操作グループでテストしました。モデルグループと偽グループのテスト時間は、tuinaグループのテスト時間と同じです(つまり、24時間)。

1. 寒冷感閾値 (CST)
   1. 表面温度が4±1°Cのインテリジェントなコールドプレートおよびホットプレートペインディテクターにラットを置き( START > SETをクリック)、透明なプラスチックケージで覆います。
   2. ラットが透明なプラスチックケージに慣れるまで、ラットの探索活動を5分間観察します。
   3. 次の 5 分以内に後肢の手術側でフットリフトの数を観察し、記録します。
      注:ラットの活動や姿勢の変化によって引き起こされたフットリフトの数は含まれていません。
2. 機械的引き出ししきい値(MWT)
   1. ラットをグリッド(0.5cm×0.5cm)として底面に置き、テストボックスに入れてから15〜30分間テストします。
   2. 疼痛のプローブ(EVF5タイプ)をラットの右後足底部の中央に移動させ、手で圧力を直線的に増加させ、ラットが足を持ち上げて舐めたときに器具画面に表示される閾値を記録します。各測定間隔を10分にして、5回連続して測定します。
3. 熱引き出し遅延(TWL)
   1. ラットを底面がガラスの試験箱に入れ、15分間順応させてから試験を開始します。
      注:熱収縮性足反射の潜伏期は、熱刺激疼痛器具(PL200タイプ)を用いて検出した。
   2. パラメータの設定:最大テスト時間は30秒、強度は50%です。 START ボタンと方向ボタンをクリックします。
   3. 赤外線プローブをラットの右後足底領域の中央に移動し、検出を開始します。
   4. ラットが足を持ち上げて舐めたときの足の収縮反射の潜伏時間を記録します。レイテンシを 5 回連続して測定し、各測定の間に 10 分の間隔を空けます。

5. エリサ

1. 行動試験後、腹腔内注射麻酔のために 35 mL/100 g の 4% 塩素水和物の用量でラットに麻酔をかけます。ラットの腹部の中央に沿って皮膚と筋肉を縦方向に切り取り、内臓を露出させます。
2. バラストとニードルホルダーを使用して純粋な分離を行い、腹部大動脈を特定し、新鮮な血液を採取し、検査用のサンプルを保管します。分離チューブを使用して血清を分離します。.血清サンプルを採取してすぐに検出するか、別々に詰めて-80°Cの冷蔵庫に保管します。
   注:分離する前に、血液サンプルを30分間凝集させます。
3. 試験プロセスのためにラットの血清を調製し、室温(RT)で少なくとも30分間保存します。
4. 試験するサンプルのブランクウェルと標準サンプルウェルを設定します。合計50 μLの標準サンプルを酵素結合プレートに加えます。最初に40 μLの希釈液を加え、次に10 μLのサンプルを試験するサンプルウェルに加えます。
   注:サンプルを添加するときは、酵素標識ウェルの底にサンプルを添加し、ウェルの壁にできるだけ触れないようにし、穏やかに振ってよく混合する必要があります。ブランクウェルにはサンプルや酵素標識試薬は含まれておらず、他のステップも同じです。サンプルの最終希釈は5倍です。
5. プレートをシーリングフィルムでシールした後、37°Cのインキュベーターに30分間置きます。
6. 濃縮洗浄液を蒸留水で30倍に希釈し、脇に置きます。
7. シールフィルムをはがし、ウェルから液体を注ぎ、振って乾かします。各ウェルに洗浄液を入れ、30秒間放置してから注ぎます。この手順を5回繰り返し、最後に振って乾かします。
8. 西洋ワサビペルオキシダーゼ標識アビジン(1ウェルあたり100μL)を加えます。
9. 各ウェルに50 μLのカラー現像剤Aを加え、次に50 μLのカラー現像剤Bを加え、静かに振って混合し、37°Cの環境に10分間暗所で置きます。
10. 1ウェルあたり50μLの停止溶液を加えて、反応を終了します。
    注意: この時点で、青色は黄色に変わります。
11. ブランクウェルをゼロにし、各ウェルの光学密度(OD値)を450nmの波長で順番に測定します。

結果

CSTの: モデル群と比較して、tuina後6時間後の群のフットリフト回数は有意に減少し、その差は統計的に有意であった(P < 0.05)。シャム群と比較して、モデル群のフットリフト回数は有意に増加し、その差は統計的に有意でした(P < 0.05)(表3、 図3)。

MWTの モデル群...

ディスカッション

この研究では、マイナー CCI モデルを使用して、臨床的な坐骨神経損傷によって引き起こされる pNP をシミュレートしました。マイナーCCIモデルは、結紮による神経幹の継続的で慢性的な圧迫と拘束を含み、結紮糸の緩やかな腫れを伴い、坐骨神経内に浮腫を引き起こし、3〜5日で安定した慢性疼痛を形成します^27,28。予備?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia machine	Ruiwode Life Technology Co., Ltd., Shenzhen, China	R500	Animal respiratory anesthesia related equipment
Chromic intestinal suture	Shandong Boda Medical Products Co., Ltd., China	BD210903	An absorbable surgical suture mainly made from collagen protein processed from the intestines of healthy young goats
Electronic Von Frey instrument	Bioseb, USA	BIO-EVF5	An instrument for detecting mechanical withdrawal threshold
Intelligent cold and hot plate pain detector	Anhui Zhenghua Biological Instrument Equipment Co., Ltd,China.	ZH-6C	An instrument for detecting cold sensitivity threshold
Isoflurane	Ruiwode Life Technology Co., Ltd., Shenzhen, China	R510-22-10	An anesthetic
Multi-function full-wavelength microplate reader	Molecular Devices (Shanghai) Co., Ltd.	SpectraMax M2	An instrument for detecting optical density (OD)
Thermal analgesia device	Chengdu Techman Software Co., Ltd., China	PL-200	An instrument for detecting thermal withdrawal latency