辺縁ニッチ細胞の単離と同定

要約

ここでは、ヒトの辺縁ニッチ細胞を単離して同定するためのプロトコルを紹介します。

要約

ここでは、辺縁ニッチ細胞(LNC)の単離と同定のための標準的な手順を報告します。アイバンクから得られた辺縁部組織をLNCの単離に使用しました。組織を無菌条件下で12個に分割し、コラゲナーゼAを使用して細胞培養インキュベーターで37°Cで18時間消化し、LNCおよび辺縁上皮前駆細胞を含む細胞クラスターを得ました。細胞クラスターを0.25%トリプシン-EDTAを用いて37°Cで15分間消化し、単一細胞を得た後、5%マトリゲルでコーティングされたプラスチック表面上の改変胚性幹細胞培地(MESCM)で培養しました。細胞は70%のコンフルエンスで継代し、免疫蛍光法、リアルタイム定量PCR(qPCR)、およびフローサイトメトリーを用いてLNCを同定しました。一次LNCを単離し、12回以上継代した。P4からP6にかけてのLNCの増殖活性が最も高かった。LNCは、BMMSC(SCF、Nestin、Rex1、SSEA4、CD73、CD90、MSX1、P75NTR、およびPDGFRβ)よりも高い幹細胞マーカーを発現していました。さらに、P4 LNCはVIM、CD90、CD105、PDGFRβを均一に発現するが、LNCの同定マーカーとして使用できるPan-CKは発現しないことが示された。 フローサイトメトリー解析では、LNCの約95%、97%、92%、および11%がそれぞれCD73、CD90、CD105、およびSCFを発現し、BMMSCでは68%、99%、20%、および3%であることが示されました。LNCの単離と同定のための標準的なプロセスは、LNCを広く使用するための信頼できる実験室基盤を提供する可能性があります。

概要

角膜上皮幹細胞欠損症(LSCD)¹、角膜上皮再生症(CES)の発生率は、角膜感染症や外傷によりますます緊急性を増しています。適切に治療しないと、CESDは角膜移植を必要とする失明につながる可能性があります。その結果、CESの再生はより重要になってきています。辺縁ニッチ細胞(LNC)と呼ばれる支持細胞のグループがあり、CES機能に不可欠なサポートを提供します。辺縁間質幹細胞は、Polisettyらによって最初に単離され²、Xieら3によって、辺縁の下皮および辺縁の間質に局在するLNC^として同定されました。LNCは角膜縁を支える幹細胞であり、骨髄由来MSC(BMMSC)の機能を持ち、角膜上皮細胞や角膜間質細胞などに成長を誘導する可能性があります^3,4,5,6,7。これまでの研究で、LNCの幹細胞の質は、すでに臨床で広く使用されているBMMSC8よりも原始的であることが示されました。LNCは、特にCESDの治療において、MSC....

プロトコル

50歳から60歳までのドナーからの辺縁部組織は、赤十字眼科銀行、同済病院(中国、武漢)から入手しました。この議定書は同済倫理委員会によって承認され、ヘルシンキ宣言に従って実施されました。

1. アイソレーション

1. 中期角膜保存培地から辺縁部組織を採取し、超クリーンな作業台で無菌条件下で操作します。
2. 角膜の周りの虹彩と内皮を、滅菌した外科用丸い刃でこすり落とし、取り除きます。
3. 角膜と強膜の両側に1mmを残した外科用ブレードで、辺縁組織を12の等しい大きさに切断します。
4. 辺縁部組織を3.5cmの培養プレートに移し、1 mLのコラゲナーゼA(2 mg/mL、DF-12培地中)を加えて、すべての組織を浸して消化します。
5. プレートを37°Cの細胞インキュベーターに入れ、辺縁組織を18時間消化します。
   注意: フォローアップ手順は通常、2日目に実行されます。
6. 5%基底膜マトリックス(マトリゲル)でコーティングされた6ウェル培養プレートを調製します。
   1. ウェルの底に5%基底膜マトリックス(MESCMに溶解[表1])をコーティングします。
   2. 200 μL と 1 mL チップ、15 mL 遠心チューブ 1 本、6 ウェルプレート 1 枚を滅菌バッグに入れて調製します。

ディスカッション

角膜の透明性は、通常、角膜間質における小さな線維(直径25〜30 nm)の規則的な配置と分布によって維持され、これは正常な視力に不可欠です¹⁶。世界には2億5,300万人の視覚障害者がおり、そのうち3,600万人が¹⁷歳の視覚障害者です。世界保健機関(WHO)は、角膜失明を人間の視力に対する最も深刻な危険の1つと見なしており、世界の全失明の5.1%を占めています.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4',6-Diamidino-2-Phenylindole	ThermoFisher	D1306	5μg/mL
Amphotericin B	Sigma	V900919	1.25 μg/mL
Anti-CD73	Abcam	ab202122	1:50
Bovine Serum Albumin	MERCK	A1933	-
CD105	Proteintech	67075-1-Ig	1:200
CD105	Abcam	ab114052	1:50
CD90	Proteintech	66766-1-Ig	1:100
CD90	Abcam	ab307736	1:50
Cell Incubator	Shanghai Lishen	K1119K4644	HF90(HT)
Centrifuge system	StatSpin	StatSpin CytoFuge 12	-
Collagenase A	Roche	10103578001	2 mg/mL
Confocal microscope	Zeiss	LSM700	-
Culture plate	virya	3500356	35 mm
DME/F-12 1:1 (1x)	cytiva	SH30023.01	90%
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody	ThermoFisher	A16016	1:1000
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody	ThermoFisher	31568	1:1000
FACS Diva sofware	BD Biosciences	Tree Star	-
Flow Cytometer	BD Biosciences	Becton Dickinson LSRII	-
Fluorescence microscope	olympus	cx31
Gentamicin	Sigma	G1914	50 μg/mL
Hemocytometer	MERCK	Z359629	Bright-Line
High-capacity cDNA Transcription Kit	ThermoFisher	4374966
Inverted phase-contrast microscope	UOP	DSZ2000X
ITS (insulin, transferrin, sodium selenite)	Sigma	I3146	5 μg/mL insulin, 5 μg/mL transferrin, 5 ng/mL sodium selenite
KnockOut SR Serum Replacement for ESCs/iPSCs	gibco	10828-028	10%
Matrigel	BioCoat	356234	-
Pan-CK	Abcam	ab7753	1:1000
Paraformaldehyde	NoninBio	NBS0135	4.00%
Paraformaldehyde	MKBio	MM-1505	4%
PDGFRβ	Abclonal	A1444	1:100
Real-time fluorescence quantitative PCR instrument	Applied Biosystems	Step One Plus	-
Recombinant Human FGF-basic	Peprotech	100-18B	4 ng/mL
Recominant Human Leukemia Inhibitory Factor(Lif)	Peprotech	300-05	10 ng/mL
RNeasy Mini RNA Isolation Kit	Qiagen	74104	-
SCF	Bioss	bs-0545R	1:100
SCF	Abcam	ab52603	1:50
Stereomicroscope	ZEISS	SteREO Discovery. V8
Sterile surgical round blade	Careforde	29500	size 10
TaqMan Gene Expression Assay Mix	Applied Biosystems	4448489
Triton X-100	MERCK	X100	0.20%
Trypan blue	ThermoFisher	15250061	0.40%
Trypsin-EDTA	Genview	GP3108	0.25%
Tween 20	MERCK	P9416	-
Ultra Clean Bench	LaiTe	LT20200705	SW-CJ-IFDG
Universal PCR Master Mix	Applied Biosystems	4304437
Vim	Abcam	ab92547	1:100