サンゴの成長とモニタリングのための統合マイクロデバイスシステム

要約

このプロトコルは、海珊瑚の長期的な養殖とモニタリングに適用できるモジュール式の制御可能なマイクロデバイスシステムの開発について説明しています。

要約

サンゴは、海洋および沿岸の生態系における基本的な生物です。近年のサンゴ保護研究の進展に伴い、サンゴの保全と研究のために、サンゴの養殖環境の正確な制御が強く求められています。ここでは、正確でプログラム可能な温度制御、無菌の初期環境、長期安定した水質、調整可能な溶存酸素濃度、およびサンゴのカスタマイズされた光スペクトルを提供できる、多機能プラットフォームとしてセミクローズドサンゴ培養マイクロデバイスシステムを開発しました。モジュラー設計により、サンゴ培養システムは、望ましい新しいモジュールを取り付けたり、既存のモジュールを取り外したりすることで、アップグレードまたは変更できます。現在、適切な条件と適切なシステムメンテナンスにより、サンプルサンゴは健康な状態で少なくとも30日間生き残ることができます。さらに、このサンゴ培養システムは、初期環境が制御可能で無菌であるため、サンゴと関連微生物の共生関係の研究を支援することができます。したがって、このマイクロデバイスシステムは、比較的定量的な方法で海サンゴを監視および調査するために適用できます。

概要

サンゴ礁の生態系の悪化は、過去70年間にわたって世界中で発生しています。中央アメリカ¹、東南アジア2,3,4,5,6、オーストラリア^7,8、^{東アフリカ9}のすべての主要なサンゴ礁地域を考慮すると、サンゴ礁の世界的な被覆率は1950年代から半減しています¹⁰。このサンゴ礁の大量損失は、生態学的および経済的問題を引き起こしました。例えば、サンゴに依存するあらゆる種類の魚類の生息/不在と個体数を8年間追跡することで、研究者たちは、サンゴの減少がパプアニューギニアの魚類の生物多様性と個体数の大幅な減少を直接引き起こしていると結論付けました¹¹。この結果は、サンゴの減少がサンゴ礁ベースの生物学的システムを損なうだけでなく、漁業収入を減少させる可能性があることを証明しました。

何十年にもわたる直接モニタリング、リモートセンシング、データ比較などのフィールド調査により、科学界はサンゴの大量減少を引き起こすいくつかの要因を特定しました。サンゴの大量減少の主な原因の1つは、高い海水温によって引き起こされるサンゴの白化です^12,13。白化現象と気象学的記録を組み合わせることで、科学者たちは、サンゴの白化現象がエルニーニョ・南方振動のフェーズでより頻繁に起こっていると結論付けました¹⁴。サンゴの減少のもう一つの理由は、海洋酸性化です。大気中と海水中の両方で_CO2濃度が上昇したため、炭酸カルシウムは以前よりも速く溶解し、サンゴ礁の石灰化の規模が縮小する¹⁵。実際、大気中の_CO2濃度が500ppmを超えると、数千万人が苦しみ、サンゴ礁は著しい劣化と共生菌の剥離のリスクにさらされると結論付けられています^16,17。サンゴの減少を引き起こしたり加速させたりする沿岸汚染物質など、サンゴの生存に影響を与える可能性のある他の要因もあります。ハワイの研究者は、サンゴの炭素、酸素、窒素の同位体を、溶存無機炭酸塩および関連栄養素(NH₄⁺、PO₄^3-、NO₂-、およびNO₃^-)とともに測定し、陸地からの汚染がサンゴの沿岸酸性化と生物侵食を拡大したと結論付けました¹⁸.汚染に加えて、都市化はサンゴの生存を危険にさらし、シンガポール、ジャカルタ、香港、沖縄でのサンゴの生存状況に関する研究で明らかになったように、サンゴの構造の複雑さを比較的低くします。したがって、人為的ストレス要因の影響と気候変動の重なり合った影響は、サンゴ礁の生物多様性の広範な減少と、それに伴うサンゴの生態学的機能と回復力の低下につながっています¹⁹。

また、サンゴの生理機能には、窒素固定、キチン分解、有機化合物の合成、免疫²⁰などの微生物が多数関与しており、サンゴ礁の劣化を考える際には、これらの微生物を含める必要があることにも注意が必要です。サンゴ礁などの自然環境では、不十分な水循環、藻類の滲出液、藻類の異常増殖など、多くの要因が低酸素または無酸素状態を引き起こします。この現象は、サンゴおよびサンゴ関連微生物の個体群分布に悪影響を及ぼします。たとえば、ベトナムの科学者は、ニャチャン、フーコック、ウジュンゲラムでは、サンゴの アクロポラフォルモサ の細菌組成が、さまざまな場所で溶存酸素の影響を受ける可能性があることを発見しました²¹。米国の研究者は、サンゴの低酸素状態または無酸素状態を調査し、藻類の滲出液が微生物活動を媒介し、局所的な低酸素状態を引き起こし、すぐ近くでサンゴの死亡率を引き起こす可能性があることを発見しました。また、サンゴは酸素濃度の低下に耐えられるが、曝露時間と酸素濃度の組み合わせによって決定される所定の閾値を超える程度であることもわかった²²。インドの研究者は、 Noctiluca scintillans 藻類が繁殖すると、溶存酸素が2 mg / Lに減少することを発見しました。 この濃度を下回ると、 Acropora montiporacan の約70%が低酸素状態のために死にました²³。

上記のすべての事実と要因は、環境の変化がサンゴ礁の劣化につながることを示唆しています。特定の条件下でサンゴ礁を養殖・研究するためには、サンゴ礁が生息する制御可能な微視的環境を正確かつ包括的に構築することが重要です。通常、科学者は温度、光、水の流れ、栄養素に焦点を当てています。しかし、海水中の溶存酸素濃度、微生物の存在量、微生物の多様性など、他の特徴は一般的に無視されています。この目的のために、私たちのグループは、比較的制御された環境でサンゴポリプを培養するために小型機器を適用する可能性を探りました^24,25。この研究では、サンゴ養殖用のモジュール式マイクロデバイスシステムを設計および構築しました。このモジュール式マイクロデバイスシステムは、温度、光スペクトル、溶存酸素濃度、栄養素、微生物などの点で制御可能な微小環境を提供することができ、拡張とアップグレードの能力を備えています。

デバイスのモジュールと機能
マイクロデバイスシステムはベルリンシステム²⁶に触発されたが、現在のシステムではライブロックは使用されていない。図1に示すように、現在のシステムは、6つのメインモジュール、2つのブラシレスモーターポンプ、1つのガスポンプ、1つのフロースルーUVランプ、 1つの電源、特定の電子制御コンポーネント、および関連するワイヤーとネジで構成されています。6つの主要モジュールには、海水貯留モジュール(エアポンプと温度センサー付き)、温度制御モジュール、藻類浄化モジュール、微生物浄化モジュール、活性炭浄化モジュール、サンゴ培養モジュールが含まれます。

デバイスのアーキテクチャ
図2と図3に示すように、マイクロデバイスシステム全体を水平方向に2つのコンパートメントに分割し、その間に温度制御モジュールを挟むことができます。安全上の理由から、すべての海水を含むモジュールと部品は、培養コンパートメントと呼ばれる左側のコンパートメントに配置されます。他の電子部品は、電子コンパートメントと呼ばれる右側のコンパートメントに配置されます。両方のコンパートメントは密封されているか、シェル内に梱包されています。温度制御モジュールは、その間の仕切り板に固定されています。培養コンパートメントのシェルには、ベースボードと3つのネジ固定プレートが含まれています。この設計により、コンパートメントの気密性が保証され、システムの操作が容易になります。さらに、気密性は正確な温度制御を支持します。電子コンパートメントのシェルには、ベースボード、2つのネジ固定プレート、および1つのフロントコントロールパネルが含まれています。

水循環
海水貯留モジュールに接続された内側と外側の海水循環ループは、事前に設計されました。内部循環ループは、海水貯蔵モジュール、温度制御モジュール、フロースルーUVランプ、藻類浄化モジュール、および微生物浄化モジュールを正常に接続します。この循環ループは、サンゴに適した生理学的および生理学的海水条件を提供することを目的としており、頻繁なメンテナンスは必要ありません。藻類精製モジュールには、水中の余分な栄養素(硝酸塩とリン酸塩)を吸収する Chaetomorpha 藻類が含まれています。微生物浄化モジュールには、微生物叢を培養して亜硝酸塩とアンモニウムを硝酸塩に移し、浄水する細菌培養基質が含まれています。これらのモジュールはすべて、重大な状況下でのみ交換する必要があります。

外側の循環ループは、海水貯留モジュール、サンゴ培養モジュール、および活性炭モジュールを連続して接続します。この循環ループは、サンゴに光、気密性、水流、および高い海水質を提供することを目的としています。海水は、水の入口と出口からリフレッシュできます。添加剤は三方弁を介して添加され、検査のためにこの弁から海水サンプルを抽出することもできます。空気は吸気口から送り込み、排気口から排出することができます。

電子設計
システム全体には、スイッチとヒューズを備えた220 V AC電源が使用されます。入力電力は 4 つの分岐に分かれています。最初の分岐は12 V DC電源に接続され、加熱パネル、冷却パネル、および冷却ファンに直接電力を供給します。また、この分岐は、4チャンネルのDCトランスを介して2つのポンプと2つの照明パネルに間接的に電力を供給します。2 番目の分岐は PID 温度コントローラーに送られます。3番目のブランチは、エアポンプ電源に行きます。最後の分岐はUVランプ電源に接続します。ソリッドステートリレーは、PID温度コントローラと温度制御モジュールの冷却パネルを接続します。通常のリレーを使用して、PID温度コントローラーと加熱パネルを接続します。4チャンネルのDCトランスは、電圧を必要な電圧に変換します。

システムの右側には 2 つのコントロールパネルがあります。天板には、主電源スイッチ、UVランプ電源スイッチ、エアポンプスイッチ、温度制御スイッチなど、UVランプ用のスイッチとコントローラーが1つずつあります。主電源スイッチは、システムの12V電源を制御します。

PID温度コントローラ、サイクルタイマ、4チャンネルDCトランス、および3チャンネルタイマがフロントパネルにあります。PID温度コントローラは、温度制御モジュール内の加熱および冷却パネルを制御することにより、水温を調整します。温度制御モジュールは、内部循環ポンプが作動していて、水が温度制御モジュールを通過して流れている 場合にのみ 機能します。サイクルタイマーはエアポンプの電源ラインに接続されています。その目的は、エアポンプに作業期間を割り当てることです。電子コンパートメントにも3チャンネルのタイマーが配置されています。このタイマーは、エアポンプ、コーラルライト、および藻類ライトの作業時間を制御します。

プロトコル

本研究に用いたサンゴは、当研究室で培養している Seriatopora caliendrumです。すべてのサンゴは、中国科学院大学南シナ海海洋研究所のご厚意により提供されました。

1. 検査と起動

メモ: システムを組み立てる前に、各モジュールの気密性と機能について個別にテストする必要があります。モジュールの気密性をテストするには、脱イオン水を使用する必要があります。すべてのモジュールコンポーネントの商業的な詳細は、 材料表に記載されています。

1. モジュール間接続の気密性試験
   1. すべてのモジュールとポンプを接続し(図1)、水がシステム上を少なくとも30分間循環するようにします。
   2. 漏れの問題がないか、すべての縫い目を確認してください。ボンディングシームのいずれかに漏れが発生した場合は、外側からボンディング接着剤を塗布してください。接続の継ぎ目のいずれかに漏れが発生した場合は、接続を再度締めて、シーリングガスケットを交換する必要があるかどうかを確認します。
2. 積載
   1. 気密性試験後、内部の水を排気して乾かします。
   2. 適切な内容を読み込みます。
      注:例えば、細菌培養基質は微生物精製モジュールに装填され、 Chaetomorpha 藻類は藻類精製モジュールに装填される。
3. システム全体の組み立てとテスト
   1. ロード後、ネジを使用してモジュールをベースボードに固定します。
   2. 内部循環モジュールと外部循環モジュールを接続します(サンゴ培養モジュールなし)。
   3. 海水灌流は、海水貯留モジュール内の水入口から海水を注入する。水位がポンプの入水口より3cm高い場合は、ポンプのスイッチを入れ、内部循環モジュールが海水でいっぱいになり、海水貯留モジュールに空気(高さ3cm)のスペースができるまで、海水の注入を続けます。
      注:海水は純水と海塩を使用して調製されます( 材料表を参照)。
4. システムテスト
   1. すべてのスイッチをオンにし、両方の海水ポンプの電圧を9Vに設定し、水温を25°Cに設定します。
   2. サイクルタイマーを「1分オン、1分オフ」に設定します。3チャンネルタイマーの3チャンネルすべてを「9:00 amオン」と「5:00 pm off」に設定します。
   3. システムに誤動作がないか少なくとも24時間監視します。問題が見つからなかった場合、システムは操作の次のステップに進む準備ができています。
      注意: 海水貯留モジュールを除くすべてのモジュールのすべての気泡を取り除くことが重要です。システム全体をわずかに持ち上げて振ると、気泡をモジュールの入口から出口に移動できます。

2. 微生物環境の整備

注:サンゴ移植の前に、サンゴに優しい微生物環境を確立する必要があります。システム内、特に微生物精製モジュール内で微生物を培養するためには、希釈したプロバイオティクス溶液を硝化システムの微生物源として添加する必要があります。

1. マイクロバイオームソースの追加
   1. 市販のマイクロバイオームソース溶液( 材料表を参照)1 mLを500 mLの海水に攪拌しながら加えます。
   2. 上記の希釈溶液50 mLと市販のサンゴ栄養溶液10 μL( 材料表を参照)を循環システムに注入します。
2. マイクロバイオーム培養
   1. 内循環ポンプとエアポンプのスイッチを入れて、マイクロバイオームを21日間培養します。マイクロバイオームの酸素含有量の要件によって、エアポンプのオンタイムとオフタイムの比率が決まります。
      注:このステップは、海水浄化マイクロバイオームを培養し、システム内のサンゴに有益なマイクロバイオームの成長を促進することを目的としています。この過程で、マイクロバイオーム注入後2日目から4日目にかけて海水が濁り始めます。このマイクロバイオーム培養プロセスの後、システム内の栄養素分解能力が確立されるはずです。異なる実験要件を満たすために、異なるマイクロバイオームソースを使用してマイクロバイオーム環境を確立できることに留意する必要があります。

3.サンゴの移植と成長

1. サンゴ移植
   1. 生のサンゴの枝を3〜5cmの長さのスケールで切り取り、これらのサンゴの枝を3Dプリントされたサンゴの支持台に接着します(補足コーディングファイル1)。
   2. これらのサンゴの枝のサンプルを元の海水タンクに戻し、回収のために少なくとも7日間保管します。
   3. サンゴサポートベースを接着剤で回転ユニットに固定します。サンゴ培養モジュールを組み立て、外側の循環ループに接続します。
2. サンゴの成長をイメージング
   注:サンゴの成長を評価するには、経時的なサンゴの画像を取得する必要があります。取り外し可能な接続を使用すると、イメージングのためにシステム全体からサンゴ培養モジュールを取り外すのに便利です。そのために、適切な照明条件を備えたミニフォトスタジオを建設します。マクロレンズ付きのカメラ( 材料表を参照)を使用して、さまざまな時代のサンゴ表面の形態をキャプチャします。培養モジュール内のサンゴ回転ユニットは、非接触モードを使用してモジュール外で操作できます。モジュールに隣接する磁気ハンドルを回転させることで、フルアングルのサンゴ画像を撮影することができます。
   1. スタジオの上部にカメラを置き、垂直から画像をキャプチャします view.
   2. サンゴ培養モジュールをミニフォトスタジオに置き、サンゴを中央と下部に配置します。
   3. 外側のハンドルを回転させてサンゴの画像をキャプチャします。
      注:サンゴの生存上の理由から、イメージングの時間は15分に制限する必要があります。

4. システムの定期メンテナンス

注:定期的なメンテナンスには、漏れ検査、故障検査、添加剤の追加、海水交換が含まれます。

1. 漏電検査
   1. ベースボードに水垢や水滴がないか調べます。システムのカバーシェルは透明であるため、水漏れを目視で検査するのは簡単で便利です。この検査は毎日行う必要があります。
2. 故障検査
   1. このステップには、設定水温、リアルタイム温度、変圧器出力電圧、UVランプ設定、タイマー動作状態を目視で確認および記録するなど、水温、ポンプ、光電圧、エアポンプの状態、およびタイマーの状態の検査が含まれていることを確認してください。この検査は毎日行う必要があります。
      注意: 特定のシステムの誤動作は、異常な音や異常な温度に基づいて診断できます。
3. 添加物添加
   注:添加剤添加は、栄養素やその他の試薬をシステムに添加するプロセスです。
   1. 例えば、活性炭モジュールと海水モジュールとの間の三方弁からシリンジを用いて海水10mLを抽出する。
   2. 抽出した海水に添加剤を溶かします。
   3. 三方弁を通して溶液をシステムに戻します。実際の場合、添加剤の種類、量、添加頻度は、実験要件を考慮して、システムの海水品質によって決定されます。
4. 水交換
   注:定期的な水交換により、培養システム内の毒性濃度と富栄養化を減らすことができます。実験条件が許せば、海水の交換は日常的な操作で済みます。
   1. 安全上の理由から、システム全体の電源を切り、電源ケーブルを抜いてください。
   2. サンゴ培養モジュールを取り外します。
   3. 外部廃水パイプラインを海水貯留モジュールの出口に接続します。
   4. システムを回転させ、システムの前面を下にして置きます。
   5. コンセントのスイッチを入れます。内部の海水をシステムから流します。
      注意: 内部の負圧がシステムを損傷する可能性があるため、ポンプを使用して水を抜かないでください。
   6. 適量の海水を排出し、出口のスイッチを切ります。排出される海水の量は、サンゴの生理状態によって決まります。
   7. システムをリセットし、新しく準備した海水を給水口からシステムに注入します。
   8. サンゴ培養モジュールをシステムに取り付け直します。
   9. システムの電源を入れ、システム全体が正常に戻るまで待ちます。

5. モジュール交換

注:誤動作や実験の段取りによりモジュールを交換する必要がある場合は、培養実験を中断したり、悪影響を与えたりすることなく、モジュールを交換することが重要です。

1. 海水貯留モジュール、藻類浄化モジュール、微生物浄化モジュール、活性炭浄化モジュールの場合は、内部循環ポンプのスイッチを切り、モジュールの固定ネジを緩めます。
2. 結合された 2 つのモジュール間のパイプラインを切り離し、交換するモジュールをシステムから分解します。最後のステップは、パイプラインを接続し、固定ネジを締め直すことにより、新しいモジュールをシステムに組み立てることです。
   注意: 温度制御モジュールの交換は、どういうわけか異なります。まず、すべてのワイヤをモジュールから外す必要があります。その後、固定ボルトを緩め、パイプラインを外します。その後、加熱パネルを取り外し、モジュールをシステムから分解します。温度制御モジュールの取り付けプロセスは、逆のプロセスです。

6. システムをシャットダウンし、システムを初期状態に復元する

注:システムは、必要なサンゴ培養実験の後、最終的にシャットダウンされます。システムを元の状態に復元する必要があります。

1. システムのシャットダウン
   1. システムの電源を切り、電源ケーブルを抜きます。
   2. システム内の海水を排出します。
   3. サンゴ培養モジュール、活性炭浄化モジュール、海水貯留モジュール、藻類浄化モジュール、微生物浄化モジュール、UVランプ、2つの循環ポンプ、温度制御モジュールの順にモジュールを分解します。
2. システムの復元
   1. すべてのモジュールを純水と界面活性剤で洗浄します( 材料表を参照)。
   2. モジュールを3%過酸化水素溶液で滅菌します。
      注意: モジュールの洗浄に有機溶剤を使用しないでください。
   3. モジュールを 40 °C で 12 時間乾燥させます。システム内のすべての水が蒸発していることを確認します。
   4. すべてのパイプラインとバルブを同じ界面活性剤を使用して洗浄します。

7. 制御微生物環境への改変

注:サンゴの培養実験とは別に、システム内の制御された微生物環境を取得するなど、特定の特別な実験では、マイクロバイオームの種類と存在量を厳密に管理する必要があります。私たちのサンゴ培養システムの最も革新的な特徴は、サンゴの生理学的活性を、比較的閉鎖的な微生物生態系の特定の微生物環境で探索できることです。この機能を実行するには、別の操作手順が必要です。

1. 事前滅菌
   1. システムを組み立てる前に、すべてのモジュール、パイプライン、およびバルブを3%過酸化水素溶液で滅菌します。
   2. 細菌培養基質をオートクレーブ 滅菌により 滅菌します。
   3. Chaetomorpha藻類を75%エタノール溶液で滅菌し、滅菌紙を使用して乾燥させます。
2. システム改造と滅菌
   1. システムを組み立てる際に、エアポンプと海水貯留モジュールの間に空気滅菌フィルター( 材料表を参照)を追加します。
   2. 入口と三方弁の間に水滅菌フィルターを追加します。このステップにより、システムに注入された空気と水が確実に滅菌されます。
   3. オゾンをシステムに導入して、残っているマイクロバイオームを排除します。
   4. 残った消毒剤を滅菌海水で3回洗い流し、滅菌海水をシステムに注入します。
   5. 微生物環境の確立のみを目的として、マイクロバイオームソース溶液を排水口から注入します。
      注意: マイクロバイオーム源を注入するために給水口を使用し ないでください 。他の試薬や海水は、引き続き水入口から注入されます。

結果

温度制御精度
システム温度は通常、サンゴの種類に応じて23〜28°Cに設定されます。しかし、最も重要な要因の1つとして、温度変動はサンゴの生存に強く影響する可能性があります。したがって、温度制御の精度はサンゴ養殖システムにとって決定的な要因です。温度センサーと9°Cから32°Cの温度範囲の独立したデータコレクターを使用して、サンゴ培養モジュールの温度制?...

ディスカッション

このサンゴ培養システムは、サンゴが移植されて生き残るための比較的自然な微小環境またはカスタマイズされた微小環境をシミュレートして提供するように設計されています。一方、自社開発の機器として、このシステムは信頼性が高く、ユーザーフレンドリーで、安全である必要があります。例えば、温度管理では、海水温は日々の環境状況に応じて適切に管理する必要があります。サ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
12V DC power supply	Delixi Electric Co., Ltd.	CDKU-S150W	12V12.5A
3% hydrogen peroxide solution	Shandong ANNJET High tech Disinfection Technology Co., Ltd	NULL	NULL
75% ethanol solution	Shandong ANNJET High tech Disinfection Technology Co., Ltd	NULL	NULL
Air pump	Chongyoujia Supply Chain Management Co., Ltd.	NHY-001	NULL
Air sterilizing filter	Beijing Capsid Filter Equipment Co., Ltd	S593CSFTR-0.2H83SH83SN8-A	NULL
Camera	SONY	Α7r4-ILCE-76M4A	NULL
Coral nutrition solution	Red Sea Aquatics Co., Ltd.	22101	Coral nutrition
Coral pro salt (sea salt)	Red Sea Aquatics Co., Ltd.	R11231	NULL
Cycle timer	Leqing Shangjin Instrument Equipment Co., Ltd.	CN102A	220V version
Double closed quick connector	JOSOT Co., Ltd	NL4-2103T	NULL
Flow-through UV lamp	Zhongshan Xinsheng Electronic technology Co., Ltd.	211	NULL
Four-channel transformer	Dongguan Shanggushidai Electronic Technology Co., Ltd	LM2596	NULL
Macro lens	SONY	FE 90mm F2.8 Macro G OSS	NULL
Microbiome source solution	Guangzhou BIOZYM Microbial Technology Co., Ltd.	303	NULL
Mini-photo studio	Shaoxing Shangyu Photography Equipment Factory	CM-45	NULL
PID temperature controller	Guangdong Dongqi  Electric Co., Ltd.	TE9-SC18W	SSR version
Pump (for water)	Zhongxiang Pump Co., Ltd.	ZX43D	Seaswater version
Pure water machine	Kemflo (Nanjing) environmental technology Co, ltd	kemflo A600	NULL
Solid-state relay	Delixi Electric Co., Ltd.	DD25A	NULL
Surface active agents	Guangzhou Liby Group Co., Ltd.	Libai detergent	NULL
Three-channel timer	Leqing Changhong Intelligent Technology Co., Ltd.	CHE325-3	220V version
Water sterilizing filter	Beijing Capsid Filter Equipment Co., Ltd	S593CSFTR-0.2H83SH83SN8-L	NULL