網膜硝子体リンパ腫の診断とモニタリングのための硝子体および房水検体の無細胞DNA抽出

要約

ここでは、網膜硝子体リンパ腫を診断するための分子研究を行うために、硝子体および房水から無細胞DNAを抽出する手順が確立されています。この方法では、サンプルの細胞成分からDNAを同時に抽出したり、補助的な検査のためにDNAを予約したりできます。

要約

網膜硝子体リンパ腫(VRL)は侵攻性リンパ腫であり、原発性中枢神経系びまん性大細胞型B細胞リンパ腫に分類されることが多い。VRLを診断するために、硝子体液や最近では房水などの標本が収集されます。これらの検体に対するVRLの診断検査には、細胞診、フローサイトメトリー、および分子検査が含まれます。しかし、細胞病理学とフローサイトメトリーはどちらも、細胞DNAを用いた分子検査とともに、無傷の全細胞を必要とします。課題は、硝子体および房水は通常細胞性が低く、多くの細胞が収集、保管、および処理中に破壊されるという事実にあります。さらに、これらの標本は、硝子体液の粘度が高く、硝子体液と房水の両方の量が少ないため、分子検査にさらなる困難をもたらします。本研究では、ガラス質および水性試料から無細胞DNAを抽出する方法を提案します。このアプローチは、細胞DNAの抽出を補完したり、これらの標本の細胞成分を細胞診やフローサイトメトリーなどの他の診断方法に利用したりすることができます。

概要

網膜硝子体リンパ腫(VRL)は、原発性中枢神経系びまん性大細胞型B細胞リンパ腫^1,2,3に関連する侵攻性リンパ腫です。VRLは、中枢神経系への関与により、典型的には致命的である^1,2。まれではあるが^1,4、VRLはしばしば後部ぶどう膜炎や他の網膜硝子体疾患に似た症状を呈する^4,5。その結果、ぶどう膜炎の症状を示す患者は、VRLを確認または除外するための診断を必要とします。

最近、VRLを診断するためのコンセンサス基準が発表されましたが、これには臨床検査と検査所見の組み合わせが含まれます⁶。VRLの診断に一般的に使用される標本には、硝子体液、そして最近では房水^{が含まれます7。}硝子体液は^、扁平部硝子体切除術....

プロトコル

現在のプロトコルは、ヒューマンケアガイドラインに従い、ミシガン大学の治験審査委員会(IRB)の承認を得ています。これについては、IRBからインフォームドコンセントの放棄が得られました。関与する患者に関連する包含基準または除外基準はありません。

1. 細胞成分と無細胞成分の分離

注:VRL診断検査には、硝子体(希釈されていない、注入開始前に採取された硝子体切除術からの液体)、カセットバッグ内の希釈された硝子体(図1)、および房水(眼の前房からの液体)の3種類のサンプルを受け取ることができます。

1. 粘性が高い未希釈の硝子体液の場合は、ピペッティングを容易にするために3〜5 mLのPBSで希釈します。
2. カセットバッグ内の希薄硝子体の場合(補足図1)、液体を50 mLのコニカルチューブ(液体45 mLごとに1本)に排出します。
3. 房水は容量が非常に少ない(<200μL)。細胞の回収率を最大限に高めるには、サンプルを 1.5 mL チューブに移し、サンプルを採取した元の 500 μL 微量遠心チューブを等量の PBS で洗い流し、1.5 mL チューブに加えます。
4. 3,000 x g で室温で15分間、硝子体また....

ディスカッション

網膜硝子体リンパ腫(VRL)は、侵攻性の大細胞型B細胞リンパ腫^であり1,2,3、その症状は他の網膜硝子体疾患を模倣する可能性があります^4,5。硝子体、そして最近では房水の分子検査は、VRLの診断を下すか、または除外するための重要な方法になっています。ただし、これらの液体?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Propanol (Isopropanol)	Fischer	A415-500
DNA Clean & Concentrator-10	Zymo Research	D4011
DNA Clean & Concentrator-5	Zymo Research	D4003
Gentra Puregene Cell Lysis Solution	Qiagen	158906
Gentra Puregene DNA Hydration Solution	Qiagen	158916
Gentra Puregene Protein Precipitation Solution	Qiagen	158912
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma	P-4417
Quick-DNA Urine Kit	Zymo Research	D3061	Conditioning buffer; also includes clearing beads, Proteinase K and spin columns
Ultrapure Glycogen, 20 µg/µL (20 mg/mL)	Thermo Fisher/Invitrogen	10814010