脱細胞化肺細胞外マトリックスハイドロゲルの開発と特性評価

要約

プロトコルは原産の牛のような肺のティッシュに加えられる2つの明瞭な脱cellularizationの方法を解明し、それぞれの性格描写の広範囲の記述を提供する。

要約

細胞外マトリックス(ECM)由来のハイドロゲルは、 in vitroで細胞の自然環境を模倣できるため、組織工学における使用がますます一般的になっています。しかし、ECMの天然生化学的含有量を維持し、機械的安定性を達成し、脱細胞化プロセスがECMハイドロゲルの機械的特性に与える影響を理解することは困難です。ここでは、2つの異なるプロトコルを使用したウシ肺組織の脱細胞化のパイプライン、脱細胞化の有効性の下流特性評価、再構成された脱細胞化肺ECMハイドロゲルの作製、およびそれらの機械的および細胞適合性の評価について説明しました。ウシ肺の脱細胞化は、物理的(凍結融解サイクル)または化学的(界面活性剤ベース)方法を用いて追求された。ヘマトキシリンおよびエオシン染色を実施して、主要なECM成分の脱細胞化および保持を検証しました。脱細胞化サンプル内の残留コラーゲンおよび硫酸化グリコサミノグリカン(sGAG)含有量の評価には、それぞれシリウスレッドおよびアルシアンブルー染色技術を採用しました。脱細胞化肺ECMハイドロゲルの機械的特性は、振動レオロジーによって特徴付けられました。この結果は、脱細胞化ウシ肺ハイドロゲルが、ほとんどの天然ECM成分を保持することにより、市販のECM製品に代わる信頼性の高い器官型 代替を提供できることを示唆しています。さらに、これらの知見は、選択した脱細胞化法がゲル化速度論だけでなく、得られるハイドロゲルの硬さや粘弾性特性にも大きく影響することを明らかにしています。

概要

従来の単層培養条件では、天然の組織微小環境を忠実に表現できず、細胞-マトリックスおよび細胞-細胞間相互作用を可能にする有益なリガンドを備えた3次元(3D)スキャフォールドを提供する能力が欠けています¹。細胞外マトリックス(ECM)の組成と機械的特性は、組織特異性が高く、時間依存性があり、病理学的状態の変化を受けます。したがって、そのような特性の調整可能性、細胞挙動の調節、および所望の組織機能の達成を可能にする生体模倣的3D組織モデルが必要である。天然ECM由来の生体材料は、組織特異的なECM ^1,2,3,4,5を直接使用できるため、組織工学において大きな注目を集めています。ECMベースのキャリアは、組織再生から疾患モデル開発まで、多くの用途で使用されています。これらは、注射用または埋め込み型の生体材料足場^4,5、薬物スクリーニングアプリケーション^6,7、細胞増殖

プロトコル

若い(1〜2歳)ウシドナーからの新鮮な天然肺を地元の食肉処理場から入手し、氷上で密封されたプラスチック容器に入れて実験室に輸送しました。動物の生贄は、一般的な肉の消費(肺は廃棄物として廃棄される)のために行われ、研究とは関係ありません。屠殺場が動物の犠牲に関する国の法律および規制に準拠していることを確認します。また、廃棄物のみを使用し、犠牲になった動物の数に影響がなかったことも確認しています。

1.臓器の採取と組織の準備

1. 新たに採取したウシ肺組織は、実験まで-80°Cで保存してください。
2. 実験当日は、凍結した肺組織が室温で融解するのを待ちます。
3. 滅菌メスとハサミで組織を解剖して気管と軟骨気道を除去し、さらに細かく刻みます(5 mm³)。
4. 2%ペニシリン/ストレプトマイシン(P / S)を含む超純水で少なくとも3回十分に洗浄します。

2. 組織の脱細胞化

注:天然のウシ肺組織は、2つの異なるプロトコルを使用して脱細胞化されました。

1. 凍結融解法
   1. ステップ1に従って組織サンプルを調製します。ミンチした組織を滅菌蒸留水(dH₂O)の2%ヨウ....

ディスカッション

臓器由来のハイドロゲルは、天然組織のECMを再現し、器官型の細胞機能を模倣する有望なモデルとなっています。脱細胞化肺ECMは組織工学でよく使用されてきましたが、生体材料の組成と機械的特性を徹底的に特性評価することで、ホメオスタシスや疾患中の生物学的プロセスをモデル化するために細胞-ECM相互作用がどのように調節されるかをよりよく理解することができます。特に、再構.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absolute ethanol	ISOLAB	64-17-5
Acetic acid	ISOLAB	64-19-7
Alcian blue solution	Sigma-Aldrich	B8438
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	DN25
Discovery HR-2 rheometer	TA Instruments
Entellan mounting medium	Merck	107960
Eosin solution	Bright-slide	2.BS01-105-1000
Formaldehyde	Electron Microscopy Sciences	50-980-485
Hydrochloric acid	Merck	100317
Iodine	Sigma-Aldrich	3002
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	7786-30-3
Mayer's haematoxylin staining solution	Merck	2.BS01-103-1000
O.C.T compound	Tissue-Tek	4583
Penicillin/Streptomycin	Biowest	L0018-100
Pepsin from porcine gastric mucosa	Sigma-Aldrich	P6887
Picric acid	Polysciences	88-89-1
Sirius Red	Polysciences	09400-25
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Triton-X-100	Merck	112298