アキレス腱インピンジメントのメカノバイオロジー研究のためのマウス後肢外植モデル

要約

マウス後肢外植片におけるアキレス腱挿入のインピンジメントによって引き起こされる線維軟骨性変化を再現するカスタム実験プラットフォームと組織培養プロトコルを提示し、腱インピンジメントのメカノバイオロジーを探索するのに適したモデルを提供します。

要約

骨への腱の衝突は、横方向の圧縮ひずみが著しく上昇した多軸の機械的ひずみ環境を生成し、グリコサミノグリカン(GAG)に富むマトリックスの蓄積とコラーゲンネットワークのリモデリングを特徴とする局所的な線維軟骨表現型を誘発します。線維軟骨は健康な腱の侵食領域では正常な特徴ですが、過剰なGAG沈着とコラーゲンネットワークの混乱は腱鞘炎の特徴です。したがって、インピンジメントは、腱鞘炎の開始と進行における重要な外因性因子として臨床的に認識されています。それにもかかわらず、腱インピンジメントの根底にあるメカノバイオロジーは研究が不十分なままです。腱インピンジメントに対する細胞応答を解明するための以前の取り組みは、細胞に一軸圧迫を適用し、in vitroで腱外植片を切除しました。しかし、単離された細胞は、機械応答に重要な3次元の細胞外環境を欠いており、 in vitro および切除外植片研究の両方で、in vivoでの腱の衝突によって生成される多軸ひずみ環境を再現することができず、これは衝突領域の解剖学的特徴に依存します。さらに、腱インピンジメントの in vivo モデルでは、機械的ひずみ環境を制御できません。これらの限界を克服するために、アキレス腱インピンジメントのメカノバイオロジーを研究するのに適した新しいマウス後肢外植片モデルを提示します。このモデルは、アキレス腱を その場で 維持して局所的な解剖学的構造を維持し、受動的に加えられた足首背屈時にアキレス腱が踵骨に挿入されることによって発生する多軸ひずみ環境を再現し、細胞を本来の環境に保持します。このモデルに不可欠な組織培養プロトコルについて説明し、7日間にわたる持続的な外植片の生存率を確立するデータを提示します。代表的な結果は、組織学的GAG染色の亢進とインピンジメントに続発するコラーゲン線維のアライメントの低下を示しており、線維軟骨形成の上昇を示唆しています。このモデルは、さまざまな機械的負荷レジメンの調査に容易に適応でき、インピンジメントに応答してアキレス腱の表現型変化を媒介するメカニズムを特定するために、目的の分子経路を操作することができます。

概要

アキレス腱や回旋筋腱板腱を含む多くの腱は、正常な解剖学的位置により骨のインピンジメントを経験します^1,2,3,4.腱の衝突は、縦方向の繊維軸に横方向に向けられた圧縮ひずみを生成します^5,6,7.腱インピンジメントの領域は、グリコサミノグリカン(GAG)含量が著しく増加した無秩序なコラーゲンネットワーク内に、縮小した丸い細胞(線維軟骨細胞)が埋め込まれている独特の線維軟骨表現型を示します^{2,3,4,8,9,10,11,}

プロトコル

すべての動物実験は、ロチェスター大学動物資源委員会によって承認されました。

1. 組織培養培地の調製

1. すべての外植片を、1% v/v ペニシリン-ストレプトマイシンと 200 μM L-アスコルビン酸を含む Dulbecco Modified Eagle 培地 (1x DMEM) で、37 °C および 5% CO₂ のインキュベーターで培養します。最初の48時間前処理では、100 nMのデキサメタゾン⁷⁴を添加した70 mLの培地で各外植片を培養します。前処理後、デキサメタゾンなしでさらに7日間培養手足を培養し、48〜72時間ごとに培地を交換します。
   注:ウシ胎児血清などの血清を培地に添加することは、Wunderli、Blache、およびSnedeker⁵⁷によって提供された推奨事項と一致して推奨されません。簡単に言うと、無血清条件は、 生体内に存在する無血管性で栄養価の低い腱微小環境をよりよく表しています。さらに、血清補給は、特定の培養条件下で組織の分解を促進し⁷⁵ 、腱の病理学⁵⁷の両方の特徴である細胞増殖および組織外への遊走を刺激することができる。
2. 荷降ろし群の....

ディスカッション

この研究で説明した組織培養プロトコルと組み合わせた実験的なマウス後肢外植片プラットフォームは、アキレス腱挿入時のインピンジメント駆動線維軟骨形成のメカノバイオロジーを研究するための適切なモデルを提供します。この外植片モデルの有用性は、7日間の静的衝突後のトルイジン青色染色の有意かつ空間的に不均一な変化に伴う細胞生存率の維持を示す代表的な結果によって実.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbent underpads	VWR	82020-845	For benchtop dissection
Acrylic bath	Source One	X001G46CB1	Contains the explant platform submerged in culture media
Autoclave bin	Thermo Scientific	13-361-20	Used as secondary containment, holds two platforms
Base	-	-	3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Braided line	KastKing	30lb test	Used to wrap around paw and apply ankle dorsiflexion
Clip	-	-	3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Cover glass	Fisherbrand	12-541-034	Rectangular, No. 2, 50 mm x 24 mm
Cytoseal XYL	VWR	8312-4	Xylene-based mounting media for coverslipping Toluidine blue stained tissue sections
Dexamethasone	MP Biomedical LLC	194561	CAS#50-02-2
Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous	Invitrogen by ThermoFisher	D12345	CAS#67-68-5, use to solubilize dexamethasone into concentrated stock solutions
Double-sided tape	Scotch Brand	34-8724-5195-9	To attach sandpaper to Grip platens
Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X DMEM)	Gibco by ThermoFisher	11965092	high glucose, (-) pyruvate, (+) glutamine
EDTA tetrasodium salt dihydrate	Thermo Scientific Chemicals	J15700.A1	CAS#10378-23-1, used to make 14% EDTA solution for sample decalcifcation
Ethanol, 200 proof	Thermo Scientific	T038181000	CAS#64-17-5, 1 L supply
Foam biopsy pads	Leica	3801000	Used with processing cassettes, help hold ankle joints in desired position during fixation and decalcification
Forceps, #SS Standard Inox	Dumont	11203-23	Straight, smooth, fine tips
Forceps, Micro-Adson 4.75"	Fisherbrand	13-820-073	Straight, fine tips with serrated teeth
Garnet Sandpaper, 50-D Grit	Norton	M600060 01518	Or other coarse grit sandpaper
Glacial acetic acid	Fisher Chemical	A38S-500	CAS#64-19-7, for adjusting pH of sodium acetate buffer used for Toluidine blue histology, as well as 14% EDTA decalcification solution
Grips	ADMET	GV-100NT-A4	Stainless steel vice grips, screws and springs described in the protocol are included
Histobond Adhesive Microscope Slides	VWR	16005-108	Sagittal sections of hind limbs explants reliably adhere to these slides through all staining protocols
In situ Cell Death Detection Kit, TMR Red	Roche	12156792910	TUNEL assay
Labeling tape	Fisherbrand	15-959	Or any other labeling tape of preference
L-ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4544-100G	CAS#50-81-7, for culture media formulation
Neutral buffered formalin, 10%	Leica	3800600	For sample fixation, 5 gallon supply
Nunc petri dishes	Sigma-Aldrich	P7741-1CS	100 mm diameter x 25 mm height, maintain explants submerged in 70 mL of culture media as described in protocol
Penicillin-streptomycin (100X)	Gibco by ThermoFisher	15140122	Add 5 mL to 500 mL 1X DMEM for 1% v/v (1X) working concentration
Polylactic acid (PLA) 1.75 mm filament	Hatchbox	-	Choose filament diameter compatible with your 3D printer extruder, in color of choice.
Processing cassettes	Leica	3802631	For fixation, decalcification and paraffin embedding
Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI	Invitrogen by ThermoFisher	P36931	Mounting media for coverslipping tissue sections after TUNEL
Proteinase K	Fisher BioReagents	BP1700-50	CAS#39450-01-6, used for antigen retrieval in TUNEL protocol
Scissors, Fine	FST	14094-11	Straight, sharp
Slide Staining Set, 12-place	Mercedes Scientific	MER 1011	Rack with 12 stain dishes and slide dippers for Toluidine blue histology
Sodium acetate, anhydrous	Thermo Scientific Chemicals	A1318430	CAS#127-09-3, used to make buffer for Toluidine blue histology
Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile Microtome Blades	VWR	25608-964	For paraffin sectioning
Toluidine Blue O	Thermo Scientific Chemicals	348601000	CAS#92-31-9
Volume Reduction Insert	-	-	3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Xylenes	Leica	3803665	4 gallon supply for histological staining