マウスキメラ抗原受容体(CAR)-T細胞の効率的な作製

要約

このプロトコルは、レトロウイルスベクターの生産とマウスT細胞の形質導入を合理化し、マウスCAR-T細胞の効率的な生成を促進します。

要約

キメラ抗原受容体(CAR)-T細胞を用いた改変細胞治療は、血液悪性腫瘍患者に対して目覚ましい効果を発揮し、現在、多様な固形腫瘍の治療のために開発が進められています。これまでのところ、新規CAR-T細胞産物の予備評価は、主に免疫不全マウスを用いた異種移植腫瘍モデルで行われてきた。このアプローチは、実験環境でヒトCAR-T細胞の生着を成功させるために選択されます。しかし、腫瘍とCAR-T細胞が同じマウス株に由来する同系マウスモデルでは、機能的な免疫系と包括的な腫瘍微小環境(TME)の文脈で新しいCAR技術を評価することができます。ここで説明するプロトコルは、レトロウイルス形質導入と ex vivo T細胞培養のための標準化された方法を提示することにより、マウスCAR-T細胞生成のプロセスを合理化することを目的としています。このプロトコルに記載されている方法は、この研究で使用されたもの以外の他のCARコンストラクトに適用して、免疫コンピテントシステムにおける新しいCARテクノロジーのルーチン評価を可能にします。

概要

キメラ抗原受容体(CAR)を発現する養子T細胞療法は、適応免疫系の力を利用して抗原陽性がん細胞を特異的に標的化して排除することにより、がん免疫療法の分野に革命をもたらしました¹。B細胞悪性腫瘍を標的とするCAR-T細胞療法の成功は臨床的に検証されていますが、固形腫瘍を標的とする新しいCARの開発には、動物モデルで実施される前臨床試験が依然として不可欠です。しかし、これまでの固形腫瘍の適応症では臨床効果は限定的であり、個々の前臨床モデルでは生体医薬品の薬力学や臨床効果を正確に予測できないことがますます明らかになっています^2,3。したがって、研究者らは、CAR-T細胞製品の前臨床試験を拡大し始めており、ヒトおよびマウスがんの異種移植モデルおよび同系モデルにおける並行評価をそれぞれ含めています。

ヒト腫瘍とT細胞を免疫不全マウスに生着させる異種移植モデルとは異なり、同系モデルでは、機能的な免疫系の文脈でCAR-T細胞応答を調べることができます。具体的には、同系腫瘍を有する免疫能力のあるマウスは、養子移植されたT細胞と、腫瘍微小環境(TME)におけるT細胞機能を抑制することが知られている腫瘍関連マクロファージ(TAM)および制御性T細胞(Treg)を含む状況特異的環境との間の相....

プロトコル

すべての動物処置は、体重20〜25gの6〜8週齢の雌のBALB / cまたはCF57BL / 6マウスを使用して、施設動物管理および使用委員会(コロンビア大学、プロトコルAC-AABQ5551およびAC-AAAZ4470)から承認を得て実施されました。動物は市販の供給源から入手した( 資料表参照)。このプロトコルはマウスT細胞の「活性化後の日数」のまわりで構成され、ウイルスの生産は日-2に始まる。レトロウイルスは、最初の産生後-80°Cで保存することができ、このプロトコルを将来使用するために、0日目にステップ2のT細胞の単離と活性化を開始することができます。

1. レトロウイルスベクターの作製

注:ウイルス産物は、パッケージング遺伝子を2つの別々のプラスミドに分離することにより複製欠陥があり( 材料表を参照)、組換えイベントの可能性や複製能力のあるウイルスの不注意な産生を大幅に低減します。

1. トランスフェクションの1日前にPhoenix Eco細胞を調製します(2日目の手順)。
   1. 30 mLの培地(Phoenix Eco培地、表1に詳述)を使用して、15 cmのTC処理プレートまたはT150培養フラスコに約1 x 10⁷細胞を播種します....

ディスカッション

このプロトコルは生体 内の 調査のためのCAR-Tのセルを発生させるためにマウスT細胞のretroviralのtransductionに必要なステップおよび試薬を記述する。レトロウイルスの形質導入条件を最適化することで、超遠心分離や追加の試薬によるウイルス濃縮を必要とせずに、堅牢なCAR発現を実現します。ただし、この手法に適用できる変更は複数あります。

このプロトコル?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 μm filters	MilliporeSigma	SLHVR33RS
1 mL syringe	Fisher Scientific	14-955-450
1.5 mL microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-135
10 mL syringe	BD	14-823-16E
100 μm strainer	Corning	07-201-432
15 cm TC treated cell culture dishes	ThermoFisher Scientific	130183
15 mL conical tubes	Falcon	14-959-70C
40 μm strainer	Corning	07-201-430
50 mL conical tubes	Falcon	14-959-49A
70 μm strainer	Corning	07-201-431
Attune NxT Flow Cytometer	ThermoFisher Scientific
BALB/C, 6-8 week old	Jackson Laboratory	651
B-Mercaptoethanol	Gibco	21985023
Bovine Serum Albumin	GOLDBIO	A-420-500
DMEM Medium	Gibco	11965092
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), without Calcium and Magnesium	Gibco	14-190-250
DynaMag-2 Magnet	Invitrogen	12-321-D
EasySep Magnet	Stemcell Technologies	18000
EasySep Mouse T cell Isolation Kit	Stemcell Technologies	19851
FACS buffer	BD	BDB554657
Fetal bovine serum (FBS)	Corning	MT35011CV
GlutaMAX	Gibco	35-050-061
G-Rex6	Wilson Wolf	80240M
HEPES Buffer Solution	Gibco	15-630-080
Human recombinant IL-15	Miltenyi Biotec	130-095-765
Human recombinant IL-2	Miltenyi Biotec	130-097-748
Human recombinant IL-7	Miltenyi Biotec	130-095-363
Lipofectamine 3000	Invitrogen	L3000008
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140-050
Mouse Anti-CD3 BV421	Biolegend	100228
Mouse Anti-CD3/CD28 Dynabeads	Gibco	11-453-D
Mouse Anti-CD4 BV605	BD	563151
Mouse Anti-CD44 APC	Biolegend	103011
Mouse Anti-CD62L PE-Cy7	Tonbo	SKU 60-0621-U025
Mouse Anti-CD8 APC-Cy7	Tonbo	SKU 25-0081-U025
Nikon Ti2 with Prime 95B camera	Nikon
Non-treated 24 well plates	CytoOne	CC7672-7524
Opti-MEM	Gibco	31-985-062
pCL-Eco	Addgene	#12371
Penicillin/Streptomycin Solution	Gibco	15-070-063
Phoenix Eco cells	ATCC	CRL-3214
pMDG.2	Addgene	#12259
pMSCV_PGK_GFP28z	N/A	Produced by R.LV.
Purified sfGFP	N/A	Produced by R.LV.
RetroNectin ('transduction reagent')	Takara Bio	T100B
RPMI 1640	Gibco	21875
Serological pipette 10 mL	Fisher Scientific	13-678-11E
Serological pipette 25 mL	Fisher Scientific	13-678-11
Serological pipette 5 mL	Fisher Scientific	13-678-11D
Sodium Pyruvate	Gibco	11-360-070
TC-treated 24 well plates	Corning	08-772-1
Trypan blue	Gibco	15-250-061